專利名稱：一種同時檢測腫瘤相關成纖維細胞和其表達蛋白的方法
技術領域：
本發明屬于組織免疫熒光技術領域，具體涉及同時檢測腫瘤相關成纖維細胞(Cancer associated fibroblasts, CAFs)和其表達蛋白的標記方法。
背景技術：
在腫瘤發生、發展過程中，微環境充當著“土壤”的作用，是促進腫瘤進展的重要條件。腫瘤微環境由多種成分組成，除腫瘤細胞本身以外，還包括成纖維細胞、免疫或炎性細胞、脂肪細胞以及血管內皮細胞等。其中成纖維細胞數目較多。在腫瘤細胞的影響下，微環境發生了一系列變化從而更加適合腫瘤細胞的生存。CAFs是被腫瘤細胞激活的成纖維細胞，高表達ct -平滑肌肌動蛋白(a -smooth muscle act in, a -SMA )是其重要標志之一。CAFs作用廣泛，對腫瘤的浸潤和轉移起著重要的作用。它參與細胞外基質的沉積和降解，并且分泌大量的細胞因子，調節自身及周圍腫瘤細胞的增殖、血管的新生和腫瘤免疫，促進腫瘤細胞的遷移。目前已有研究表明，表達在CAFs上的蛋白不僅可成為判斷腫瘤預后的標志物，而且可能成為腫瘤治療的新靶點。目前，腫瘤微環境已成為腫瘤相關研究的熱點。CAFs所發揮的重要作用也越來越受到研究者的關注，尤其是對表達在CAFs上的腫瘤標記物的研究。要研究表達在CAFs上的腫瘤標記物，常常需要同時精確觀察CAFs的標記物a-SMA及其相關功能蛋白的定位和表達情況。以往的研究中，多采用傳統的免疫組織化學法進行定位觀察。然而無論是免疫酶法，還是傳統免疫熒光法，都有其固有的缺點，有待改進。免疫組織化學法基于抗原抗體特異性結合原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(如熒光素、金屬離子、酶等)顯色來確定組織細胞的抗原，并進行定位、定性及定量的研究。由于具有特異性強、靈敏度高、技術簡單等優點，免疫組織化學法常常被用于醫學研究和臨床病理診斷中。然而，傳統免疫熒光法所發熒光易與組織高自發熒光混淆、易淬滅、結果不易長期保存、且對研究條件要求較高等缺點，限制了它的廣泛應用。此外，傳統熒光染料所需激發光譜較窄，使其只能用不同的激發光激發不同的熒光染料標記的抗原顯色，然后通過圖像合成的方法觀察兩種或兩種以上的抗原共表達情況，過程復雜且容易產生偏倚，使結果的準確性降低。而免疫酶法的顯色基于色原的沉著，不利于在同一張切片上觀察兩種或兩種以上抗原。量子點(quantum dots, QDs)是一種半導體納米晶體,直徑約l-lOnm,由I1- VDI或II1-V族元素組成。在激發光的誘導下，可發出熒光。到目前為止，還沒有將量子點用于CAFs和其表達的腫瘤標記物的標記。
發明內容
本發明的目的在于提供一種同時檢測腫瘤相關成纖維細胞和其表達蛋白的方法。本發明的另一個目的在于提供用于同時檢測腫瘤相關成纖維細胞和其表達蛋白的試劑盒。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案
一種同時檢測腫瘤相關成纖維細胞和其表達蛋白的方法，該方法采用第一種量子點標記所述腫瘤相關成纖維細胞標記物的抗體，或者標記能與所述成纖維細胞標記物的抗體特異結合的二抗，或者標記鏈霉親和素，以及至少第二種量子點標記其表達蛋白的抗體，或者標記能與所述其表達蛋白的抗體特異結合的二抗，或者標記鏈霉親和素，其中第一種量子點和第二種量子點的發射波長不同，第一種量子點和第二種量子點不同時標記鏈霉親和素。所述腫瘤相關成纖維細胞標記物可以是a -SAM，所述表達蛋白可以是腫瘤標記物，或其他待檢蛋白或多肽。具體地，本發明方法包括如下步驟
(I).將石蠟包埋的組織4iim厚切片固定于經多聚賴氨酸處理的防脫玻片上，然后脫蠟，水化，用TBS緩沖液沖洗3次，每次3-4min ；TBS緩沖液配制方法是三羥基氨基甲烷1. 21g，氯化鈉7. 6g，加蒸餾水調至IOOOmL,濃鹽酸調pH到7. 4。(2).配制0. OlM pH6. 0檸檬酸緩沖液，其中A液0. 1M/L檸檬酸檸檬酸21.0g，加蒸餾水調至IOOOmL,濃鹽酸調pH值為6. 0 ;B液0. 1M/L檸檬酸鈉溶液檸檬酸鈉29. 41g,加蒸懼水調至IOOOmL,取A液1. 9mL, B液8.1mL,加蒸懼水9OmL, 95 C微波抗原修復IOmin,冷卻30min, TBS沖洗3次,每次3_4min ；
(3).滴加2%胎牛血清白蛋白封閉緩沖液，37C孵育20-30min；
(4).滴加兔抗人待檢測表達蛋白抗體和鼠抗人成纖維細胞標記物a-SAM抗體的混合物，37C濕盒中孵育l_2h或4C過夜；
(5).滴加2%BSA稀釋的生物素化羊抗兔或鼠IgG，37C濕盒孵育30_60min。TBS-T溶液洗滌切片3次，每次3-4m in。加2%BSA封閉緩沖液，37C濕盒中孵育15_20min ；
(6).滴加2%BSA稀釋的波長為605nm的QDs標記的鏈霉親和素復合物和波長為545nm的QDs標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG ；37 C濕盒孵育30 -60min, TBS-T溶液洗滌3次，每次 3_4min ；
(7) TBS溶液洗滌2次，每次3-4min ；
(8).90%緩沖甘油封片，上熒光顯微鏡，紫外光同時激發兩種QDs，以細胞內出現橙紅色和綠色的熒光顆粒為陽性。根據上述檢測方法，本發明提供量子點在制備檢測腫瘤相關成纖維細胞和其蛋白表達試劑中的應用。量子點具有獨特的光學特性，主要體現在①量子點是多電子體系，發光率遠遠高于單個分子，發射光強度是傳統有機熒光染料(如最常用的羅丹明6G染料)的20倍；②量子點具有范圍相當寬的激發波長，幾乎涵蓋了整個光譜，因此同一波長的光能激發直徑大小不同的多種量子點量子點具有狹窄而對稱的光譜峰和較大的斯托克斯位移，這使其發射光幾乎不會出現交疊現象，通過控制量子點直徑大小，可獲得多種顏色可分辨的光量子點較傳統有機熒光材料穩定性更強，即使反復多次激發也不容易發生淬滅量子點具有良好的生物兼容性，用做標記物對標本的生物活性無影響。因此，量子點在分子標記方面有著廣闊的應用前景，不僅可以實現單一分子的標記，而且可以進行多分子、多組分同時顯色，對開發研究多種成分相互作用機制以及表達在特定細胞上的腫瘤標記物的研究提供了新方法。具體地，本發明提供的用于檢測腫瘤相關成纖維細胞和其蛋白表達的試劑盒，其包括第一種量子點標記的所述腫瘤相關成纖維細胞標記物的抗體，或者標記的能與所述成纖維細胞標記物的抗體特異結合的二抗，或者標記的鏈霉親和素，以及至少第二種量子點標記的其表達蛋白的抗體，或者標記的能與所述其表達蛋白的抗體特異結合的二抗，或者標記的鏈霉未和素，其中第一種量子點和第二種量子點的發射波長不同，第一種量子點和第二種量子點不同時標記鏈霉親和素。上述試劑盒還可包括以下試劑中的一種或多種TBS緩沖液、檸檬酸緩沖液和封閉緩沖液。本發明提供了在腫瘤組織中同時標記腫瘤基質CAFs和其表達的腫瘤標記物的方法，其核心在于結合了免疫熒光技術和量子點獨特光學特性。與現有的熒光技術相比，本方法主要具有以下優勢①靈敏度更高，傳統的免疫熒光標記物很難在石蠟包埋的標本上檢測抗原的表達，而以量子點為標記的免疫熒光法可以很好地在石蠟標本上進行抗原的檢測，且背景清晰，便于分辨組織形態(圖1);②激發光譜廣，不同直徑的量子點可被同時激發，實現直觀地觀察到多種標記物，無需圖像合成，有利于研究腫瘤組織中多種成分的相互作用(圖2，圖3)。③由于熒光色澤與背景色澤對比鮮明，熒光效率高，便于結果判斷以及使用圖像分析軟件進行定量分析；④結果能長期保存，即使多次激發也不易淬滅；⑤實驗條件不苛刻，整個實驗過程均不需要避光，在一般免疫組化室均可完成，適合于廣泛推廣應用。本發明一種同時標記CAFs和其表達的腫瘤標記物的方法。主要涉及在免疫熒光技術的基礎上，使用量子點標記的二抗或鏈霉親和素來檢測a -SMA和腫瘤標記物的共定位和定量。本方法準確、簡便、快速，所有標記物同時顯色，結果直觀，為探究CAFs在腫瘤發生發展中的作用機制和尋找表達于CAFs上的腫瘤標志物提供了技術支持。
圖1為量子點單色標記胃癌組織Cav-1蛋白(A)與H&E染色(B)對照圖。A中紅色信號(如箭頭I)為Cav-1陽性信號，綠色信號(如箭頭2)為組織自發熒光。A圖背景清晰，可很好的顯示組織構成。A、B為連續切片，放大倍數為40X。圖2量子點同時標記胃癌組織Cav-1蛋白和基質CAFs。A :發射光譜，其中紅色
(I)和綠色(2)分別為QDs(605 nm)和QDs (545 nm)的發射光，組織自發熒光為黑色(3);B :紅色信號即Cav-1陽性信號；C :綠色信號即a -SAM陽性信號；D =Cavl和a -SAM同時顯示。放大倍數400X。注黑白模式下觀察到的即為熒光信號。圖3 量子點同時標記肺癌組織Cav-1蛋白和基質CAFs。A :綠色信號即a -SAM陽性信號；B :紅色信號即Cav-1陽性信號；C =Cav-1和a -SAM同時標記(濾掉組織自發熒光)。D =Cav-1和a -SAM同時標記，灰色為組織自發熒光。放大倍數400X。
具體實施例方式以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。實施例1在胃癌組織芯片上同時標記Cav-1蛋白和CAFs1.配制TBS緩沖液三羥基氨基甲烷1. 21g，氯化鈉7. 6g，加蒸餾水調至IOOOmL,濃鹽酸調pH到7.4。取4iim厚的胃癌組織芯片，脫蠟，水化，用TBS緩沖液(pH7. 4)沖洗3次，每次 3_4min。2.配制0. OlM pH6. 0檸檬酸緩沖液。A液:0. 1M/L檸檬酸檸檬酸21. Og,加蒸餾水調至IOOOmL,濃鹽酸調pH值為6. 0 ；B液0. 1M/L檸檬酸鈉溶液檸檬酸鈉29. 41g，加蒸懼水調至IOOOmLo取A液1. 9mL, B液8.1mL,加蒸懼水9OmL, 95 C微波抗原修復IOmin,冷卻30min。TBS沖洗3次,每次3_4min。3.滴加2%BSA封閉緩沖液(取2g BSA溶于IOOmL TBS溶液中制成)，37C孵育20_30min。4.滴加兔抗人Cav-1抗體(購自se-894,美國Santacruz公司)和鼠抗人成纖維細胞標記物a-SAM抗體(購自英國Abcam公司，稀釋比例為1:150 )的混合物，37C濕盒中孵育l-2h。5.滴加2%BSA稀釋的生物素化羊抗兔IgG (北京中杉金橋生物技術有限公司)，37C濕盒孵育45min。TBS-T溶液洗滌切片3次，每次3_4min。加2%BSA封閉緩沖液，37C濕盒中孵育15min。6.滴加2%BSA稀釋的QDs (605nm)標記的鏈霉親和素復合物(購自武漢珈源量子點技術開發有限責任公司)(稀釋比例為1:120)和QDs (545nm)標記的羊抗鼠IgG (購自武漢珈源量子點技術開發有限責任公司)(稀釋比例為1:80) ;37 C濕盒孵育30 -60minoTBS-T溶液洗滌3次，每次3-4min。7. TBS溶液洗滌2次，每次3_4min。8. 90%緩沖甘油封片，上熒光顯微鏡，紫外光同時激發QDs (605 nm)和QDs (545nm)，細胞內橙紅色熒光信號標記的是Cav-1蛋白，綠色熒光信號標記的是CAFs ( a -SAM)(見圖2)。實施例2在肺癌組織芯片上同時標記Cav-1蛋白和CAFs1.配制TBS緩沖液三羥基氨基甲烷1. 21g，氯化鈉7. 6g，加蒸餾水調至IOOOmL,濃鹽酸調pH到7. 4。取4 ii m厚的肺癌組織芯片，脫蠟，水化，用TBS緩沖液(pH7. 4)沖洗3次，每次 3_4min。2.配制0. OlM pH6. 0檸檬酸緩沖液。A液0. 1M/L檸檬酸檸檬酸21.0g，加蒸餾水調至IOOOmL,濃鹽酸調pH值為6. 0 ；B液0. 1M/L檸檬酸鈉溶液檸檬酸鈉29. 41g，加蒸懼水調至IOOOmLo取A液1. 9mL, B液8.1mL,加蒸懼水9OmL, 95 C微波抗原修復IOmin,冷卻30min。TBS沖洗3次,每次3_4min。3.滴加2%BSA封閉緩沖液(取2g BSA溶于IOOmL TBS溶液中制成)，37C孵育20_30min。4.滴加兔抗人Cav-1抗體(購自美國Santacruz公司)和鼠抗人成纖維細胞標記物a-SAM抗體(購自英國Abcam公司)(稀釋比例為1:150 )的混合物,4C過夜。5.滴加2%BSA稀釋的生物素化羊抗兔IgG，(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)37 C濕盒孵育45min。TBS-T溶液洗滌切片3次，每次3_4min。加2%BSA封閉緩沖液，37C濕盒中孵育20min。6.滴加2%BSA稀釋的QDs (605nm)標記的鏈霉親和素復合物(購自武漢珈源量子點技術開發有限責任公司)(稀釋比例為1:120)和QDs (545nm)標記的羊抗鼠IgG (購自武漢珈源量子點技術開發有限責任公司)(稀釋比例為1:80);37 C濕盒孵育45min。TBS-T溶液洗滌3次，每次3-4min。7. TBS溶液洗滌2次，每次3_4min。8. 90%緩沖甘油封片，上熒光顯微鏡，紫外光同時激發QDs (605 nm)和QDs (545nm)，細胞內橙紅色熒光信號標記的是Cav-1蛋白，綠色熒光信號標記的是CAFs ( a -SAM)(見圖3)。免疫酶法研究表達在CAFs的腫瘤標記需要進行連續切片，對比識別CAFs ;傳統的熒光染色雙標法必須在不同波長下激發，通過軟件進行圖像合成，然后才能獲得雙標圖像，容易造成結果偏倚。而用量子點進行免疫熒光多重染色，在靈敏度高，特異度強的前提下，可以同時顯示CAFs的標記物和待研究的表達于CAFs上的腫瘤標記物，并具有石蠟切片免疫組織化學染色組織細胞結構，抗原定位穩定的特點。綜合以上實例，可以看出本方法簡單易行，重復性高，多指標同時成像等，在一般免疫組化實驗室即可完成，適于大范圍推廣。
權利要求
1.一種同時檢測腫瘤相關成纖維細胞和其表達蛋白的方法，該方法采用第一種量子點標記所述腫瘤相關成纖維細胞標記物的抗體，或者標記能與所述成纖維細胞標記物的抗體特異結合的二抗，或者標記鏈霉親和素，以及至少第二種量子點標記其表達蛋白的抗體，或者標記能與所述其表達蛋白的抗體特異結合的二抗，或者標記鏈霉親和素，其中第一種量子點和第二種量子點的發射波長不同，第一種量子點和第二種量子點不同時標記鏈霉親和素。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述腫瘤相關成纖維細胞標記物為a -SAM0
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達蛋白為腫瘤標記物。
4.根據權利要求f3任一項所述的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1).將石蠟包埋的組織4pm厚切片固定于經多聚賴氨酸處理的防脫玻片上，然后脫蠟，水化，用TBS緩沖液沖洗3次，每次3-4min ； (2)配制0.OlM pH6. 0檸檬酸緩沖液，其中A液:0. 1M/L檸檬酸檸檬酸21. Og，加蒸餾水調至IOOOmL,濃鹽酸調pH值為6. 0 ；B液0. 1M/L檸檬酸鈉溶液檸檬酸鈉29. 41g，加蒸懼水調至IOOOmL,取A液1. 9mL, B液8.1mL,加蒸懼水9OmL, 95 C微波抗原修復IOmin,冷卻30min, TBS沖洗3次,每次3_4min ； (3)滴加2%胎牛血清白蛋白封閉緩沖液，37C孵育20-30min； (4)滴加兔抗人待檢測表達蛋白抗體和鼠抗人成纖維細胞標記物a-SAM抗體的混合物，37C濕盒中孵育l_2h或4C過夜； (5)滴加2%BSA稀釋的生物素化羊抗兔或鼠IgG，37C濕盒孵育30_60min ； TBS-T溶液洗滌切片3次，每次3-4min ； 加2%BSA封閉緩沖液，37C濕盒中孵育15-20min ； (6)滴加2%BSA稀釋的波長為605nm的QDs標記的鏈霉親和素復合物和波長為545nm的QDs標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG ;37 C濕盒孵育30 -60min, TBS-T溶液洗滌3次，每次3_4min ； (7)TBS溶液洗滌2次，每次3-4min ； (8)90%緩沖甘油封片，上熒光顯微鏡，紫外光同時激發兩種QDs，以細胞內出現橙紅色和綠色的熒光顆粒為陽性。
5.量子點在制備檢測腫瘤相關成纖維細胞和其蛋白表達試劑中的應用。
6.用于檢測腫瘤相關成纖維細胞和其蛋白表達的試劑盒，其包括第一種量子點標記的所述腫瘤相關成纖維細胞標記物的抗體，或者標記的能與所述成纖維細胞標記物的抗體特異結合的二抗，或者標記的鏈霉親和素，以及至少第二種量子點標記的其表達蛋白的抗體，或者標記的能與所述其表達蛋白的抗體特異結合的二抗，或者標記的鏈霉親和素，其中第一種量子點和第二種量子點的發射波長不同，第一種量子點和第二種量子點不同時標記鏈霉未和素。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述腫瘤相關成纖維細胞標記物為a -SAM0
8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述表達蛋白為腫瘤標記物。
9.根據權利要求61任一項所述的試劑盒，其特征在于，其還包括以下試劑中的一種或·多種TBS緩沖液、檸檬酸緩沖液和封閉緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種同時檢測腫瘤相關成纖維細胞和其表達蛋白的方法，屬于組織免疫熒光技術領域。該方法采用第一種量子點標記所述腫瘤相關成纖維細胞標記物的抗體，或者標記能與所述成纖維細胞標記物的抗體特異結合的二抗，或者標記鏈霉親和素，以及至少第二種量子點標記其表達蛋白的抗體，或者標記能與所述其表達蛋白的抗體特異結合的二抗，或者標記鏈霉親和素，其中第一種量子點和第二種量子點的發射波長不同，第一種量子點和第二種量子點不同時標記鏈霉親和素。本發明還公開了用于同時檢測腫瘤相關成纖維細胞和其表達蛋白的試劑盒。本發明方法簡便、高效、準確、同時檢測，適合于推廣到其他多種腫瘤相關標志物的同時標記及定量分析。
文檔編號G01N21/64GK103063849SQ20121058282
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者何禹禹, 趙顯達, 陳洪雷, 朱小波 申請人:武漢大學