一種評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法
【專利摘要】本發明涉及一種評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法；從測試液/培養液瓶中取出體積為Vb的測試液/培養液廢棄掉；注入用含硫酸鹽還原菌的污水配制的抑制藥劑/殺菌劑，體積為Vb或Vn；注入污水體積為（Vb-Vn）；放入培養箱，30℃恒溫培養，每24h觀察結果；每隔24h小劑量、小體積地補充注入用清水配制的該抑制藥劑/殺菌劑，以液體總體積不超過瓶子的總體積為限，30℃恒溫培養，每24h觀察結果，以鐵釘是否變黑，瓶內液體是否變黑或產生明顯的黑色沉淀物、幾天變黑來評價該抑制配方對該水樣中的硫酸鹽還原菌的抑制效果；本方法縮短了測試周期，減少了抑制劑/殺菌劑的用量和測試瓶的消耗，測試結果更為直觀。
【專利說明】一種評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用硫酸鹽還原菌細菌測試瓶或自行配制的適合硫酸鹽還原菌生長的培養基(內加指示劑)，快速評價殺菌劑或抑制劑對該微生物的殺滅或抑制效果的評價方法。
【背景技術】
[0002]在油田生產中，硫酸鹽還原菌(SRB)的繁殖滋生會引起許多不良后果，如油田水處理設備的腐蝕破壞、地層堵塞、油層污染等，給油田生產造成巨大損失。國內外科技工作者對控制SRB的生長進行了大量的探索，對SRB危害的監控和殺菌劑效果的檢測都需要我們及時檢測SRB，因而，對殺菌劑和抑制劑的應用效果的評選和及時檢測就顯得尤為重要。
[0003]國內外科技人員對于硫酸鹽還原菌的抑制效果的檢測，主要集中在3個層面:一是傳統的檢測方法，培養法及顯微鏡直接計數法；二是基因層面，基于SRB種屬的16SrDNA序列的定性檢測，如基因芯片以及FISH技術對SRB的定量和定性檢測，APS還原酶基因和異化型亞硫酸鹽還原基因進行定性檢測；三是蛋白層面，主要是通過免疫吸附的原理得以實現，如已經申請專利的基于APS還原酶的SRB的快速檢測試劑盒。到目前為止，還沒有一種被公認較完善的檢測方法。其中，顯微鏡技術最大的特點是快速，但需特定的染料及受過培訓的操作人員。由于該技術不能分辨細菌的死活，所以檢測結果往往偏高。通過檢測細菌構成物測定SRB的儀器有很多，但因測定的具體構成物不同，分析結果往往有差異。隨著分子生物學技術的飛速發展，分子生物學方法已經滲透到環境生物地球化學的許多領域，但是由于專業要求較高，輔助檢測設備操作難度大，檢測費用較高，不適于普遍適用。
[0004]培養法是我國各油田過去多年來一直采用的SRB的檢測方法，它是根據APIRP-38美國石油學會推薦的地下注入水分析方法中的絕跡逐漸稀釋法進行的。該方法是迄今為止應用最多也是最好的方法，可靠性較高。目前，油田系統內SRB菌的計數主要執行中國石油天然氣行業標準SY/T5329-94。對殺菌劑/抑制劑藥效的評價也多用此法。即在一定體積的污水樣中，靜態或動態地加入殺菌劑/抑制劑，恒溫培養若干小時后，再利用硫酸鹽還原菌測試瓶做培養測試分析。這種方法存在的問題是:試驗周期長，包括前期反應和后期評價兩個過程，尤其在前期抑制劑的評選過程中，工作量繁瑣，不能及時有效地指導生產實踐。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種用于快速評價硫酸鹽還原菌殺滅/抑制效果的方法，可簡單快速地評選殺菌劑/抑菌劑，并方便觀察，去掉了加入抑制劑/殺菌劑的單獨反應過程，將反應和評價過程合二為一，縮短了評價檢測時間，達到快速評價抑制配方的目的。
[0006]本發明所所述的快速評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法，是以市場上流通的、內裝硫酸鹽還原菌測試液的硫酸鹽還原菌測試瓶為反應場所，測試液體積范圍為5?IOml ；或者以自行配制的、內加指示劑的適合硫酸鹽還原菌優勢生長的培養基為反應場所，培養基成分以質量含量為單位，由磷酸氫二鉀0.1~1%。，硫酸鹽I~10%。，亞鐵鹽0.1~1%。，氯化物I~10%。,抗壞血酸0.1~1%。, L-Cys半胱氨酸0.1~1%。,乳酸鹽2~10%。和蒸懼水995.6~966%。組成，pH=6.5~7.0，該培養基經滅菌處理后裝在帶有密封蓋的厭氧瓶中，體積范圍為5~IOml ;以廣泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油氣井等缺氧或兼性厭氧環境中，以硫酸根為底物進行還原反應，適宜生長的溫度為25~60°C，pH為6~9的硫酸鹽還原菌為抑制對象；以生物抑制劑/化學殺菌劑/生物-化學復配抑制劑為評價對象，其中，生物抑制劑為以硝酸根/亞硝酸根為電子受體的反硝化細菌菌液及其營養液，化學殺菌劑包括氧化性殺菌劑，如氯氣、次氯酸鈉、漂白粉、臭氧、氯胺等；非氧化性殺菌劑，如氯化十二烷基二甲基芐基銨、溴化十二烷基二甲基芐基銨、二硫氰基甲烷等；重金屬化合物，如氧化汞、氯化汞、氟化汞等；粘泥殺菌劑，如松香胺、過氧化氫、又胍聚合物等，生物-化學復配抑制劑則為上述兩種或兩種以上制劑的任意組合。若在3天之內，測試瓶中的鐵釘沒有變黑或者產生明顯的黑色沉淀物，或者厭氧瓶中的帶有指示作用的培養液沒有變黑或產生明顯的黑色沉淀物，則表明該條件下評選出來的藥劑種類和濃度可在O~24h內將該污水中的硫酸鹽還原菌控制在O~5mg/l。該控制指標遠遠低于SY-T5329-1994碎屑巖油藏注水水質推薦指標(SRB < 25個/ml)。
[0007]相同濃度、不同種類的抑制劑或殺菌劑的評選方法。首先從油田、礦場及其他存在硫酸鹽還原菌危害的環境中取樣或制備成含有硫酸鹽還原菌的污水樣。依據污水中硫酸鹽還原菌的含量，利用含有硫酸鹽還原菌的污水配制相同濃度、不同種類的抑制劑/殺菌劑，并依次編號為1#、2#~N#。其次，對應于N個抑制劑/殺菌劑的配方，取N個硫酸鹽還原菌測試瓶，并依次編號為1、2……N;同時再取N個硫酸鹽還原菌測試瓶做為空白對照，依次編號為I,、2，……N'。每只硫酸鹽還原菌測試瓶中的原裝測試液體積為Va，分別從2N個硫酸鹽還原菌測試瓶中均吸取體積為Vb的測試液廢棄處理，Vb與Va的比例為0.1~0.9，此時2N個硫酸 鹽還原菌測試瓶中的測試液體積均為(Va-Vb)。加藥方式可根據需要選擇一次性加入或連續加入。若是一次性加入，則吸取體積為Vb的1#抑制劑/殺菌劑，注入編號為I的硫酸鹽還原菌測試瓶中，吸取體積為Vb的污水樣，注入編號為I'的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；吸取體積為\的2#抑制劑/殺菌劑，注入編號為2的硫酸鹽還原菌測試瓶中，吸取體積為Vb的污水樣，注入編號為2'的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；……以此類推，直至需要的硫酸鹽還原菌測試瓶均注射完畢。此時硫酸鹽還原菌測試瓶中的最終抑制劑/殺菌劑濃度和污水中的硫酸鹽還原菌數量均按同等比例進行了稀釋。最后將注入好的硫酸鹽還原菌測試瓶均放入恒溫箱中恒溫至30°C培養，每24h觀察一次，以鐵釘是否變黑，瓶內液體是否變黑或產生明顯的黑色沉淀物、幾天變黑來評價該抑制配方對該水樣中的硫酸鹽還原菌的抑制效果。沒變黑的時間越長，說明該抑制劑/殺菌劑對該水樣中的硫酸鹽還原菌的抑制效果越好。若是連續加入，即在一次性加入的基礎上，每隔24h，用一次性注射器分別吸取編號為1#、2#~Ns的抑制劑/殺菌劑，對應編號為1、2……N的硫酸鹽還原菌測試瓶，分別補充注入適量的的抑制劑/殺菌劑，補充注入藥劑體積與硫酸鹽還原菌測試瓶原裝藥液體積比為0.01~0.05。連續I~7天，若3天內觀察到鐵釘變黑/瓶內液體變黑/產生明顯的黑色沉淀物，則停止補加，說明該條件不能在O~24h內將污水中的SRB控制在O~5mg/I。
[0008]相同種類、不同濃度的抑制劑或殺菌劑的評選方法。首先從油田、礦場及其他存在硫酸鹽還原菌危害的環境中取樣或制備成含有硫酸鹽還原菌的污水樣。依據污水中硫酸鹽還原菌的含量，利用含有硫酸鹽還原菌的污水配制一種較高濃度(濃度為C)的針對硫酸鹽還原菌的抑制劑/殺菌劑，若考察的藥劑濃度依次為Cp C2……Cn，則取N個硫酸鹽還原菌測試瓶，依次編號為1、2……N ;同時再取N個硫酸鹽還原菌測試瓶做為空白對照，依次編號為I,、2'……N'。每只硫酸鹽還原菌測試瓶中的原裝測試液體積為Va，分別從2N個硫酸鹽還原菌測試瓶中均吸取體積為Vb的測試液廢棄處理，Vb與Va的比例為0.1~0.9，此時2N個硫酸鹽還原菌測試瓶中的測試液體積均為(Va-Vb)。加藥方式可根據需要選擇一次性加入或連續加入。若是一次性加入，則吸取體積為V1的1#抑制劑/殺菌劑，注入編號為I的硫酸鹽還原菌測試瓶中，用另一支一次性注射器吸取體積為(Vb-V1)的污水也注入編號為I的硫酸鹽還原菌測試瓶中，其中，Vn = Cn.NJC (Vn e (Va-Vb))0吸取體積為Vb的污水樣，注入編號為I,的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；吸取體積為％的2#抑制劑/殺菌劑，注入編號為2的硫酸鹽還原菌測試瓶中，用另一支一次性注射器吸取體積為(Vb-V2)的污水也注入編號為2的硫酸鹽還原菌測試瓶中；吸取體積為Vb的污水樣，注入編號為2'的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；……以此類推，直至需要的硫酸鹽還原菌測試瓶均注射完畢。此時硫酸鹽還原菌測試瓶中的最終抑制劑/殺菌劑濃度依次為C1X2……Cn，而空白測試瓶中的硫酸鹽還原菌數量則按同等比例進行了稀釋。最后將注入好的硫酸鹽還原菌測試瓶均放入恒溫箱中恒溫至30°C培養，每24h觀察一次，以鐵釘是否變黑，瓶內液體是否變黑或產生明顯的黑色沉淀物、幾天變黑來評價該抑制配方對該水樣中的硫酸鹽還原菌的抑制效果。沒變黑的時間越長，說明該抑制劑/殺菌劑對該水樣中的硫酸鹽還原菌的抑制效果越好。若是連續加入，即在一次性加入的基礎上，每隔24h，用一次性注射器吸取濃度為C的抑制劑/殺菌劑，對應編號為1、2……N的硫酸鹽還原菌測試瓶，分別補充注入適量的抑制劑/殺菌劑，補充注入藥劑體積與硫酸鹽還原菌測試瓶原裝藥液體積比為0.01~0.05。連續I~7天，若3天內觀察到鐵釘變黑/瓶內液體變黑/產生明顯的黑色沉淀物，則停止補加，說明該條件不能在O~24h內將污水中的SRB控制在O~5mg/l。 [0009]本發明的有益效果是，將硫酸鹽還原菌的抑制/殺滅、再培養、檢測、觀察集中在同一時間內、同一反應環境中完成，省卻了硫酸鹽還原菌和抑制藥劑單獨作用反應的場所和時間。每評選一個條件，加上空白對照，只需2個硫酸鹽還原菌測試瓶。在3天左右便可估測出該條件在將來現場應用時的有效時間。這種評價方法，不但縮短了測試周期，而且減少了抑制劑/殺菌劑的用量和硫酸鹽還原菌測試瓶的消耗，相應地降低了操作者的勞動量，且測試結果觀測起來更為直觀。利用該方法所評選出來的抑制配方/殺菌劑也更為苛亥IJ，對硫酸鹽還原菌的抑制標準為5個/ml，將來在推廣使用的時候有一定的富裕度。同時該發明可作為一種硫酸鹽還原菌抑制效果的快速評價方法和觀察方法，以測試液中的指示劑/指示物(鐵釘)變化為標準，沒變黑的天數越多，說明該抑制劑/殺菌劑對該污水樣中的硫酸鹽還原菌的抑制效果維持的時間越長，該配方越好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是本發明的一次性加藥操作流程示意圖。
[0011]圖2是本發明的連續性加藥操作流程示意圖。
[0012]其中，1-測試瓶/厭氧瓶；2_ 一次性注射器；3_廢液杯；4_培養箱。【具體實施方式】
[0013]步驟1:從測試液/培養液中取出體積為Vb的測試液/培養液，并廢棄掉入廢液杯3中；
[0014]步驟2:用一次性注射器2注入用含硫酸鹽還原菌的污水配制的抑制藥劑/殺菌劑，體積為Vb或Vn;
[0015]步驟3:用一次性注射器2注入污水，體積為(Vb-Vn)；
[0016]步驟4:放入培養箱4，30°C恒溫培養，每24h觀察結果；
[0017]步驟5:每隔24h小劑量、小體積地補充注入用清水配制的該抑制藥劑/殺菌劑，以液體總體積不超過瓶子的總體積為限。
[0018]步驟6:30°C恒溫培養，每24h觀察結果。
[0019]實施例1
[0020]以克拉瑪依油田石南4污水為含硫酸鹽還原菌的污水樣(SRB為104個/ml)，用其配制100mg/l的次氯酸鈉、二硫氰基甲烷、氯化汞溶液各100ml，并依次編號為1#、2#和3# ；取硫酸鹽還原菌測試瓶6只(內置測試液10ml)，各吸出5ml測試液并棄之，分別編號為1、
2、3和1'、2' ,V，其中編號為1'、2' ,V的為空白對照。在編號為I的硫酸鹽還原菌測試瓶中注入5ml配制好的1#溶液，吸取體積為5ml的污水樣，注入編號為I'的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；在編號為2的硫酸鹽還原菌測試瓶中注入5ml配制好的2#溶液，吸取體積為5ml的污水樣，注入編號為2，的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；在編號為3的硫酸鹽還原菌測試瓶中注入5ml配制好的3#溶液，吸取體積為5ml的污水樣，注入編號為3'的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中。使每只硫酸鹽還原菌測試瓶中的總液體體積為10ml。這時，編號為1、2、3的測試瓶中的殺菌劑的終濃度均為50mg/l。放入30°C培養箱恒溫培養，每隔24小時后，進行觀察，觀察期為7天。
[0021]
【權利要求】
1.一種評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法，其特征在于，以市售的硫酸鹽還原菌測試瓶或者自行配制的硫酸鹽還原菌培養基為檢測手段，以硫酸鹽還原菌為抑制對象，以生物抑制劑、化學殺菌劑或生物-化學復配抑制劑為評價對象，評價硫酸鹽還原菌的抑制效果的方法包括以下步驟: 1)取樣:從油田、礦場及其他存在硫酸鹽還原菌危害的環境中取樣或制備成含有硫酸鹽還原菌的污水樣； 2)配藥:依據污水樣中硫酸鹽還原菌的含量，利用該污水樣配制相同濃度、不同種類的抑制劑/殺菌劑，并依次編號為1#、2#~N# ;或者配制濃度為C的同種抑制劑/殺菌劑溶液，考察其在不同濃度Cp C2……Cn下的抑制/殺滅效果； 3)編號:對應于N種抑制劑/殺菌劑或同一抑制劑/殺菌劑的N種不同濃度，取N個硫酸鹽還原菌測試瓶，依次編號為1、2……N ;并同時做空白對照，空白硫酸鹽還原菌測試瓶編號為I'、2'……N'； 4)比例調配:每只硫酸鹽還原菌測試瓶中的原裝測試液體積為Va，廢棄測試液體積為Vb, Vb是依據抑制劑/殺菌劑發揮藥效的終濃度計算而得，且Vb:Va為0.1~0.9，分別從測試液體積為Va的2N個硫酸鹽還原菌測試瓶中均吸取體積為Vb的測試液廢棄處理，此時2N個硫酸鹽還原菌測試瓶中的測試液體積均為(Va-Vb)； 5)注藥:加藥方式可根據需要選擇一次性加入或連續加入方式； 一次性加入方式:吸取體積為VbZiV1的1#抑制劑/殺菌劑，注入編號為I的硫酸鹽還原菌測試瓶中，若評價同一藥劑在不同濃度下的抑制效果，則再用另一支一次性注射器吸取體積為(Vb-V1)的污水也注入編號為I的硫酸鹽還原菌測試瓶中，其中，Vn = Cn.NjC (Vn e(Va-Vb));同時吸取體積為Vb的污水樣，注入編號為的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；吸取體積為\的2#抑制劑/殺菌劑，注入編號為2的硫酸鹽還原菌測試瓶中，若評價同一藥劑在不同濃度下的抑制效果，則再用另一支一次性注射器吸取體積為(Vb-V2)的污水也注入編號為2的硫酸鹽還原菌測試瓶中，同時吸取體積為Vb的污水樣，注入編號為2'的空白硫酸鹽還原菌測試瓶中；……以此類推，直至需要的硫酸鹽還原菌測試瓶均注射完畢，此時硫酸鹽還原菌測試瓶中的最終抑制劑/殺菌劑濃度即為所考察的濃度，污水中的硫酸鹽還原菌數量均按比例進行了稀釋； 連續加入方式:若是不同種類藥劑的評選，即在一次性加入的基礎上，每隔24h，用一次性注射器分別吸取編號為1#、2#~Ns的抑制劑/殺菌劑，對應編號為1、2……N的硫酸鹽還原菌測試瓶，分別補充注入適量的的抑制劑/殺菌劑。若是同種藥劑在不同濃度下的評選，即在一次性加入的基礎上，每隔24h，用一次性注射器吸取濃度為C的抑制劑/殺菌劑，對應編號為1、2……N的硫酸鹽還原菌測試瓶，分別補充注入適量的抑制劑/殺菌劑；補充注入藥劑體積與硫酸鹽還原菌測試瓶原裝藥液體積比為0.01~0.05 ;連續1~7天,若3天內觀察到鐵釘變黑/瓶內液體變黑/產生明顯的黑色沉淀物，則停止補加，說明該條件不能在O~24h內將污水中的SRB控制在O~5mg/l ； 6)培養、觀察:將注入好的硫酸鹽還原菌測試瓶均放入恒溫箱中恒溫至30°C培養，每24h觀察一次，以鐵釘是否變黑，瓶內 液體是否變黑或產生明顯的黑色沉淀物、幾天變黑來評價該抑制配方對該水樣中的硫酸鹽還原菌的抑制效果。
2.根據權利要求1所述的一種評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法，其特征在于:所抑制的對象硫酸鹽還原菌廣泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油氣井及缺氧或兼性厭氧環境中，以硫酸根為底物進行還原反應，適宜生長的溫度為25~60°C，pH為6~9。
3.根據權利要求1所述的一種評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法，其特征在于:硫酸鹽還原菌培養基成分以質量含量為單位，由磷酸氫二鉀0.1~1%。，硫酸鹽I~10%。，亞鐵鹽0.1~1%0，氯化物I~10%。,抗壞血酸0.1~1%。，L-Cys半胱氨酸0.1~1%0，乳酸鹽2~10%。和蒸餾水995.6~966%。組成，ρΗ=6.5~7.0。
4.根據權利要求1所述的一種評價硫酸鹽還原菌抑制效果的方法其特征在于:評價對象為生物抑制劑、化學殺菌劑或生物-化學復配抑制劑；生物抑制劑為以硝酸根/亞硝酸根為電子受體的反硝化細菌菌液及其營養液，化學殺菌劑包括氧化性殺菌劑，如氯氣、次氯酸鈉、漂白粉、臭氧、氯胺等；非氧化性殺菌劑，如氯化十二烷基二甲基芐基銨、溴化十二烷基二甲基芐基按、二硫氰1基甲燒等；重金屬化合物，如氧化萊、氣化萊、氣化萊等；粘泥殺菌劑，如松香胺、過氧化氫、又胍聚合物；生物-化學復配抑制劑則為上述兩種或兩種以上制劑的任意組合。
【文檔編號】G01N21/82GK103901024SQ201210579145
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月27日 優先權日:2012年12月27日
【發明者】聶春梅, 陳愛華, 方新湘, 李敏香, 趙燕, 王傳萍 申請人:中國石油天然氣股份有限公司