一種用于檢測塑化劑(dbp)的elisa試劑盒的制備方法
【專利摘要】本發明為一種用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，其檢測靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的檢測。所述試劑盒包括：包被了塑化劑(DBP)抗原的酶標板、塑化劑(DBP)標準品、塑化劑(DBP)抗體工作液、酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。塑化劑(DBP)檢測試劑盒的原理是固相間接競爭酶聯免疫反應，把提取的樣品、酶標二抗工作液和抗體工作液加入對應的酶標孔中，孵育一段時間后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里將會出現藍色，加入終止液，顏色由藍色變為黃色，顯色的深淺與標準品或樣品中塑化劑(DBP)的含量成反比例關系。該方法可直接用于檢測白酒樣本中塑化劑(DBP)的含量。
【專利說明】—種用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備
【技術領域】
[0001]本發明屬于檢測【技術領域】，具體地涉及一種用于定量檢測白酒樣本中的塑化劑(DBP)殘留量的酶聯免疫試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]塑化劑是一種增加材料的柔軟性或是材料液化的添加劑。鄰苯二甲酸酯類塑化劑被歸類為疑似環境荷爾蒙，其生物毒性主要屬雌激素與抗雄激素活性，會造成內分泌失調，損害生物體生殖機能，包括生殖率降低、流產、天生缺陷、異常的精子數、睪丸損害，還會引發惡性腫瘤、造成畸形兒，導致兒童性早熟。
[0003]鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是一種常用的塑化劑，也用作膠粘劑和印刷油墨的添加劑，也可用作一種殺體外寄生蟲藥。它具有較強的生殖毒性，可引起男性生育能力下降，尤其對兒童的毒性更大。DBP主要存在于人造革、塑料制品、化妝品、香精及農藥中。
[0004]目前，檢測塑化劑的方法主要有高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC等。其中，高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC是定量的檢測方法，結果準確可靠，缺點是檢出限較高、儀器設備較為昂貴，以及復雜的樣本前處理方法，限制了該方法的廣泛應用。酶聯免疫吸附ELISA法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用。本發明旨在建立一種檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備及檢測方法。
【發明內容】
[0005]針對現有技術中存在的問題，本發明提供了檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒，其檢測靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的檢測。本發明提供了一種用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備。
[0006]檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，包括酶標板、塑化劑(DBP)標準品、塑化劑(DBP)抗體工作液、酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0007]檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標板的制備、塑化劑(DBP)標準品的制作、塑化劑(DBP)單克隆抗體及其工作液的制備、酶標二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
[0008]其進一步特征在于:所述的塑化劑(DBP)包被抗原是將塑化劑(DBP)半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將塑化劑(DBP)抗原稀釋成1:20000比例，100 μL7孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180卜17孔，37°〇放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C)晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0009] 所述的塑化劑(DBP)標準品濃度分別為O ppm、0.1 ppm、0.3 ppm、0.9 ppm、2.7ppm、8.1 ppm。[0010]塑化劑(DBP)蛋白質偶聯物單克隆抗體工作液的制備:采用塑化劑(DBP)人工抗原免疫兔所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:40000。
[0011]所述酶標二抗工作液的制備:用酶標二抗稀釋液稀釋成1:5000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0012]塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的檢測方法，基于抗原抗體進行間接競爭酶聯免疫反應，該方法包括以下步驟:
(1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有塑化劑(DBP)抗原的酶標板，加標準品/樣本50μL7孔到對應的微孔中；
(4)加入酶標二抗工作液，50PL/孔，然后加入塑化劑(DBP)抗體工作液，50 μL7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環境中反應30 min ；
(5)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300μL7孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 S，用吸水紙拍干；
(6)加入底物液A50 PL/孔，底物液B 50 PL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15 min ；
(7)加入終止液50PL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數據)；
(8)以標準品測試的吸光度值與標準品的濃度對數值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中塑化劑(DBP)的含量。
[0013]其中，所述處理后的樣品是經過以下處理的樣品:
取5 mL樣品于干凈的玻璃試管中，加入2mL色譜純的正己烷，蓋上蓋后振蕩3 min，然后靜置，待分層后取上層清液1 mL，于干凈的玻璃器皿室溫氮氣吹干，吹干后用1mL 35%的甲醇復溶后待測。
[0014]本發明采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法來檢測。用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的測定原理:樣品中的塑化劑(DBP)與酶標板上固定的抗原特異性競爭體，加入酶標二抗，與抗體反應，通過酶催化顯色劑顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中塑化劑(DBP)的含量。如果樣品中的塑化劑(DBP)含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準確、快速，適用于大批量樣品的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為塑化劑(DBP)標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0016]檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒，其包括酶標板、塑化劑(DBP)標準品、塑化劑(DBP)抗體工作液、酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。[0017]下面具體描述本發明中檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，
塑化劑(DBP)蛋白質偶聯物的制備:
將塑化劑(DBP)半抗原與載體蛋白BSA按12:1的結合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入入碳二亞胺，攪拌I~2h，置室溫反應24 h，最后用0.2mol/L pH 7.6的PBS透析兩天，除去未反應的半抗原，即可得到塑化劑(DBP)蛋白質偶聯物。
[0018]塑化劑(DBP)抗體的制備:
選用3月齡健康大白兔，通過三次免疫，每次塑化劑(DBP)蛋白質偶聯物免疫原用量為50 μδ/0.05 mL，每次免疫間隔時間為2周。初次免疫分別將免疫抗原與費氏佐劑及不安全佐劑等量混合，勁部皮下多點注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注Λ 25 Pg塑化劑(DBP)蛋白質偶聯物進行加強免疫，免疫后第6 d耳靜脈取血，采用間接競爭ELISA法測定效價。取得較高效價后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后頸動脈采全血，分離抗血清，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，制成凍干粉后于_20°C保存備用。
[0019]制備包被有塑化劑(DBP)包被抗原的酶標板:
酶標板包被塑化劑(DBP)抗原，包被抗原是將塑化劑(DBP)半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將塑化劑(DBP)抗原稀釋成1:20000比例，100 μL
/孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次； 然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 μL/孔，371:放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C)晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0020]所述的塑化劑(DBP)標準品配制濃度分別為O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。
[0021]所述的塑化劑(DBP)蛋白質偶聯物單克隆抗體工作液的制備:采用DBP人工抗原免疫兔所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:40000。
[0022]所述酶標二抗工作液的制備:用酶標二抗稀釋液稀釋成1:5000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0023]基于上述制備的試劑，本發明用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標板Xl塊；
(2)標準液X6 瓶:(1mT,/ 瓶)O ppm、0.1 ppm、0.3 ppm、0.9 ppm、2.7 ppm、8.1 ppm ；
(3)酶標二抗工作液7 mL ；
(4)抗體工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)終止液7 mL ；
(8)20 X濃縮洗滌液20 mL;使用本試劑盒時的注意事項:
(1)室溫低于20°c或試劑及樣本沒有回到室溫(20~25°C)會導致所有標準的OD值偏低；
(2)在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作；
(3)每加一種試劑前需將其搖勻；
(4)反應終止液為2M鹽酸,避免接觸皮膚；
(5)不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑；
(6)儲存條件:保存試劑盒于2~8°C，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
(7)試劑變質的跡象:發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。O標準的吸光度(450/630 nm)值小于0.5(A450 nm〈0.5)時，表示試劑可能變質，請勿使用；
(8)該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
[0024]本發明塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒在檢測白酒樣品中的塑化劑(DBP)殘留量中的應用:
本發明的試劑盒用于檢測白酒中的塑化劑(DBP)殘留量時，通過以下步驟實施:樣品預處理、用本發明試劑盒進行檢測、分析結果。
[0025](I)樣品預處理
取5 mL樣品于干凈的玻璃試管中，加入2 mL色譜純的正己烷，蓋上蓋后振蕩3 min，然后靜置，待分層后取上層清液I mL，于干凈的玻璃器皿室溫氮氣吹干，吹干后用ImL 35%的甲醇復溶后待測。
[0026]配制35%的甲醇溶液:取35 mL甲醇加入65ml去離子水中混勻。
[0027](2)用本發明試劑盒進行檢測白酒樣品中塑化劑(DBP)殘留量
取包被有DBP抗原的酶標板，加標準品/樣本50 μL/孔到對應的微孔中；加入酶標二抗工作液，50 μL孔，然后加入塑化劑(DBP)抗體工作液，50 μL孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環境中反應30 min ;小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300 PL/孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 S，用吸水紙拍干；加入底物液A 50 μι/孔，底物液B 50 μL7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15 min ;加入終止液50 PL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數據);對比待測樣品與標準品的吸光度值大小，定量分析待測樣品中的塑化劑(DBP)的殘留量。
[0028](3)分析結果
用上述制備的試劑盒中的6個DBP標準品濃度O ppm、0.1 ppm、0.3 ppm、0.9 ppm、2.7ppm、8.1 ppm,在450/630 nm處測量吸光度值。 [0029]百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，SP 百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0-O ppb標準溶液的平均吸光度值。[0030] 以標準品百分吸光率為縱坐標，以塑化劑(DBP)標準品濃度(ppb)的半對數為橫坐標繪制標準曲線，求出直線方程。標準曲線見附圖1。Y= - 18.550X+99.32，R2=0.9967。將樣本的BziBci值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出所對應樣本的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中塑化劑(DBP)的實際濃度。
【權利要求】
1.檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，包括酶標板、塑化劑(DBP)標準品、塑化劑(DBP)抗體工作液、酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
2.檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標板的制備、DBP標準品的制作、塑化劑(DBP)單克隆抗體及其工作液的制備、酶標二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
3.根據權利要求2所述塑化劑(DBP)的檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，其特征在于:所述的塑化劑(DBP)包被抗原是將塑化劑(DBP)半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將塑化劑(DBP)抗原稀釋成I =20000比例，100 μL7孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 VL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 PL/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
4.根據權利要求2所述塑化劑(DBP)的檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，其特征在于:所述的塑化劑(DBP)標準品濃度分別為O ppm、0.1 ppm、0.3 ppm、0.9 ppm、2.7ppm、8.1 ppm。
5.根據權利要求2所述塑化劑(DBP)的檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，其特征在于:所述的塑化劑(DBP)蛋白質偶聯物單克隆抗體是采用塑化劑(DBP)人工抗原免疫兔所得，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成I =40000。
6.根據權利要求2所述塑化劑(DBP)的檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，其特征在于:所述的酶標二抗工作液用酶標二抗稀釋液稀釋成1:5000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含 0.5% 吐溫-20，0.01 mol/L 的 PBST，pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
7.權利要求2所述的檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，基于抗原抗體進行間接競爭酶聯免疫反應，該方法包括以下步驟: (1)預處理待測樣品，即將用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液中； (2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻； (3)取包被有塑化劑(DBP)抗原的酶標板，加標準品/樣本50μL7孔到對應的微孔中； (4)加入酶標二抗工作液，50PL/孔，然后加入塑化劑(DBP)抗體工作液，50 μL7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環境中反應30 min ； (5)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300μL7孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)； (6)加入底物液A50 PL/孔，底物液B 50 PL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15 min ； (7)加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數據)； (8)以標準品測試的吸光度值與標準品的濃度對數值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中塑化劑(DBP)的含量。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述處理后的樣品是經過以下處理的樣品: 取5 mL樣品于干凈的玻璃試管中，加入2mL色譜純的正己烷，蓋上蓋后振蕩3 min，然后靜置，待分層后取上層清液1 mL，于干凈的玻璃器皿室溫氮氣吹干，吹干后用1mL 35%的甲醇復溶后待測。
【文檔編號】G01N33/577GK103901199SQ201210578060
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優先權日:2012年12月26日
【發明者】杜道林, 曾昆, 洪霞, 杜霞 申請人:丹陽億太生物科技發展有限公司