專利名稱：一種檢測載脂蛋白c3的試劑盒及利用其實現的檢測方法
技術領域：
本發明涉及屬于醫學免疫體外診斷領域，尤其涉及一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒以及利用該試劑盒實現的檢測方法。
背景技術：
載脂蛋白C3主要存在于極低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及乳糜微粒中。載脂蛋白C3基因全長約3. lkb，位于11號染色體長臂載脂蛋白A I/C III/A IV基因簇內，在肝臟和小腸中均有表達。載脂蛋白C3有抑制脂蛋白脂肪酶及肝細胞膜載脂蛋白E受體的功能，在調節極低密度脂蛋白及乳糜微粒的分解代謝中起重要作用。在嚴重的高甘油三酯血癥常伴有載脂蛋白C3含量的明顯升高。故測定血清載脂蛋白C3含量對探討高甘油三酯血癥的動脈粥樣硬化發病機制有重要意義。目前常用的載脂蛋白C3的檢測方法是酶聯免疫法。酶聯免疫法的基本原理是基于抗原抗體反應的特異性和等比例性，將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，通常以48孔或96孔的聚苯乙烯酶標板為載體；未結合的抗體通過洗滌除去。加入待檢樣本反應一段時間后，樣本中的抗原會和固相載體上的抗體結合形成固相抗原復合物。洗滌除去未結合的雜質。加入酶標抗體，使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣品中待測物質的量正相關。加底物，夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。酶聯免疫法測定過程較為繁瑣，自動化程度不高，需要配備多種專門設備，不能直接在全自動生化分析儀上進行批量檢測分析。隨著檢測自動化進程的加快以及樣本檢驗數量的不斷增加，臨床上迫切需要一種更為簡便、快捷的方法來進行規模化批量操作。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒及利用其實現的檢測方法，其更為簡便、快捷，從而消除上述背景技術中缺陷。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒，其含有試劑R1、試劑R2和載脂蛋白C3校準品，其中，試劑Rl含有緩沖液10 500mM，表面活性劑O. 5 50g/L，穩定劑O. 5 10g/L，電解質5 50g/L,高分子促進劑I 100g/L,防腐劑I 10g/L, pH為6 9 ;試劑R2含有緩沖液10 500mM，抗人載脂蛋白C3抗體5 50% (w/v)，穩定劑O. 5 10g/L,電解質5 50g/L,防腐劑I 10g/L, pH為6 9 ;校準品包括緩沖液10 500mM、載脂蛋白C3抗原、穩定劑5 50g/L、防腐劑I 10g/L、抗氧化劑 O. 01 10g/L。上述緩沖液10 500mM，也就是濃度為10 500mmol/L。抗人載脂蛋白C3抗體5 50% (w/v)，也就是濃度為50 500g/L。
優選的，本發明提供的試劑盒中，所述緩沖液為醋酸鹽緩沖液、氯化銨緩沖液、磷酸鹽緩沖液、TRIS緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、CAPSO, MOPS、Hepes緩沖液中的一種或幾種；所述的表面活性劑選自Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯燒基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚中的一種或幾種；所述的穩定劑選自亞氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、二乙烯三胺五乙酸鈉、1，2-環己二醇縮水甘油、甘露糖、葡萄糖、殼聚糖、山梨醇、牛血清蛋白中的一種或幾種；所述的電解質選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂中的一種或幾種；所述的高分子促進劑選自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羥丙基甲基纖維素、羥甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉中的一種或幾種；所述的防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或幾種；所述的抗人載脂蛋白C3抗體選自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、雞抗人或牛抗人載脂蛋白C3抗體中的一種；所述抗氧化劑選自丁基羥基茴香醚、沒食子酸丙酯、二丁基羥基甲苯、苯多酚、磷月旨、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基對苯二酚、維生素系列中的一種或幾種。為了保持統一的緩沖體系，作為一種優選的技術方案，所述試劑Rl和試劑R2中的緩沖液相同。作為一種優選的技術方案，所述校準品的緩沖液采用甘氨酸緩沖液。進一步優選的，本發明提供的試劑盒中，試劑Rl含有磷酸鹽緩沖液10 500mM ;Triton X1000. 5 50g/L，牛血清蛋白
0.5 10g/L,氯化鈉5 50g/L,乙二醇聚氧乙烯醚I 100g/L,疊氮鈉I 10g/L,且pH為6 9 ;試劑R2含有磷酸鹽緩沖液10 500mM，羊抗人載脂蛋白C3抗體5 50% (w/V),牛血清蛋白0. 5 10g/L,氯化鈉5 50g/L,疊氮鈉I 10g/L,且pH為6 9 ;校準品包括甘氨酸緩沖液10 500mM、載脂蛋白C3抗原、牛血清蛋白5 50g/L、疊氮鈉I 10g/L、二丁基輕基甲苯0. 01 10g/L。上述羊抗人載脂蛋白C3抗體5 50%(w/v),也就是羊抗人載脂蛋白C3抗體的濃度為 150 300g/L。一種利用上述試劑盒進行檢測載脂蛋白C3的方法，該方法包括如下步驟(I)向待測樣品中加入試劑R1，解除樣本中抗原周圍電子層和水化層，使抗原位點充分暴露，待測樣品與試劑Rl按體積比為(I 10) :250，讀取吸光度ODl ；(2)向步驟(I)的混合液中加入試劑R2，試劑R2與試劑Rl按體積比為1: (I 7)加入，讀取吸光度0D2 ；(3)使用載脂蛋白C3校準品在全自動生化分析儀上通過內置曲線擬合模式擬合標準曲線，根據吸光度自動計算出待測樣品中載脂蛋白C3的濃度。作為一種改進，試劑R2與試劑Rl體積比為1:1、1 :2、1 :3、1 :4、1 :5、1 :6或1:7。作為一種改進，所述曲線擬合模式包括Spline、二次方程、logit-log (3p)、logit-log (4p)、logit-log (5p)或 Polygonal 中的一種。由于采用了上述技術方案，本發明的有益效果是:本發明提供的檢測載脂蛋白C3的試劑盒及其檢測方法可簡潔快速地檢測樣本中脂蛋白C3的含量，使用簡便快速；與進口對比試劑實驗表明，本發明試劑具有較高的準確度和很好的特異性，能夠滿足臨床快速高通量檢測樣本的要求，檢測效率明顯提高；同時抗體原料實現自制，降低了試劑成本，易于產業化；試劑盒由于使用了篩選的最優化試劑組合，使得試劑的穩定性大大提高，2-8° C可以穩定存放一年以上。因此在臨床應用上具有廣闊的前景。
圖1為本發明檢測載脂蛋白C3含量的檢測方法流程示意圖；圖2為本發明載脂蛋白C3校準品的標準曲線。
具體實施例方式為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例1試劑Rl:
磷酸鹽(緩沖液)120 _
Triton X 100 (表面活性劑)5 g/L
氯化鈉(電解質)8.5 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促進劑) 50 g/L 牛血清蛋白(穩定劑)5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)4 g/L
pH 值7.0
試劑R2:羊抗人載脂蛋白C3抗體15% ( w/v )
磷酸鹽(緩沖液)100 mM
牛血清蛋白(穗定劑)5 g/L
氯化鈉(電解質)8.5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
pH 值7.5 才JC準品:
甘氨酸(緩沖液)30 HiM
乙二胺四乙酸二鈉(穩定劑)5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)6 g/L
牛血清蛋白(穩定劑)5 g/L
二丁基羥基曱苯(抗氧化劑)1.5 g/L
載脂蛋白C3抗原相應量按照需要的校準品濃度將相應量的載脂蛋白C3抗原添加到上述校準品溶液中，制備得到載脂蛋白C3校準品。本實施例配制5個不同濃度的參考校準品，分別為:0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。然后用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，放置2 8°C保存。使用日立7080全自動生化分析儀進行檢測分析。測定方法如圖1所示。使用載脂蛋白C3校準品在全自動生化分析儀上通過內置logit-log (4p)曲線擬合模式擬合標準曲線，標準曲線如圖2所示；向待測樣品中加入試劑R1，樣本與試劑Rl體積分別為6 μ L、210 μ L，37°C保溫5分鐘，讀取吸光度ODl ;再向得到混合液中進一步加入試劑R2，試劑R2體積為70 μ L，37°C保溫5分鐘，讀取吸光度0D2 ;根據吸光度自動計算出載脂蛋白C3的濃度。實施例2試劑Rl:磷酸鹽(緩沖液)100 mM
Triton X 100 (表面活性劑)10 g/L
氯化鈉(電解質)8.5 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促進劑)50 g/L
牛血清蛋白(穩定劑)6 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
pH 值7.5試劑R2:
羊抗人載脂蛋白C3抗體30% ( w/v )
磷酸鹽(緩沖液)IOOmM
牛血清蛋白(穩定劑)6 g/L` 氯化鈉(電解質)8.5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
pH 值8 0校準品:
甘氨酸(緩沖液)50 rnM
乙二胺四乙酸二鈉(穩定劑)7 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
牛血清蛋白(穩定劑)5 g/L
二丁基羥基曱苯(抗氧化劑)2 g/L
載脂蛋白C3抗原180 mg/L本實施例選用高濃度單點校準品，載脂蛋白C3抗原濃度為180mg/L，然后用
0.22 μ m的濾膜過濾除菌，放置2 8°C保存。在使用時用生理鹽水稀釋成5個不同濃度的參考校準品，分別為:0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。使用日立7080全自動生化分析儀進行檢測分析。測定方法同實施例1。實施例3試劑Rl:甘氨酸(緩沖液)10 mM
聚氧乙晞壬基苯基醚(表面活性劑)0.5 g/L
疏酸鎂(電解質)5 g/L
羥甲基纖維素鈉(高分子促進劑)I g/L
牛血清蛋白(穩定劑)0.5 g/L
對羥基苯曱酸(防腐劑)I g/L
pH 值6.0試劑R2:
羊抗人載脂蛋白C3抗體5% (w/v )
甘氨酸(緩沖液)10 mM
牛血清蛋白(穩定劑)0.5 g/L
氯化鈉(電解質)5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)I g/L
pH 值6 0校準品:
嶙酸鹽(緩沖液)10 _
乙二胺四乙酸二鈉(穩定劑)2g/L
疊氮鈉(防腐劑)I g/L
牛血清蛋白(穩定劑)3g/L
二丁基羥基曱苯(抗氧化劑)0.01 g/L
載脂蛋白C3抗原相應量按照需要的校準品濃度將相應量的載脂蛋白C3抗原添加到上述校準品溶液中，制備得到載脂蛋白C3校準品。本實施例配制5個不同濃度的參考校準品，分別為:0mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L、180mg/L。然后用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，放置2 8°C保存。
使用日立7080全自動生化分析儀進行檢測分析。測定方法同實施例1。實施例4試劑Rl:
權利要求
1.一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒，其特征在于:含有試劑R1、試劑R2和載脂 蛋白C3校準品，其中， 試劑Rl含有:緩沖液10 500mM,表面活性劑0.5 50g/L,穩定劑0.5 10g/L,電解質5 50g/L,高分子促進劑1 100g/L,防腐劑1 10g/L, pH為6 9 ; 試劑R2含有:緩沖液10 500mM，抗人載脂蛋白C3抗體50 500g/L，穩定劑0.5 10g/L,電解質5 50g/L,防腐劑I 10g/L, pH為6 9 ; 校準品包括緩沖液10 500mM、載脂蛋白C3抗原、穩定劑5 50g/L、防腐劑1 10g/L、抗氧化劑0.01 10g/L。
2.如權利要求1所述的一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中， 所述緩沖液為醋酸鹽緩沖液、氯化銨緩沖液、磷酸鹽緩沖液、TRIS緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、CAPSO、MOPS、Hepes緩沖液中的一種或幾種； 所述表面活性劑選自Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯燒基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚中的一種或幾種； 所述穩定劑選自亞氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、二乙烯三胺五乙酸鈉、1，2-環己二醇縮水甘油、甘露糖、葡萄糖、殼聚糖、山梨醇、牛血清蛋白中的一種或幾種； 所述電解質選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂中的一種或幾種； 所述高分子促進劑選自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羥丙基甲基纖維素、羥甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉中的一種或幾種； 所述防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或幾種； 所述抗人載脂蛋白C3抗體選自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、雞抗人或牛抗人載脂蛋白C3抗體中的一種； 所述抗氧化劑選自丁基羥基茴香醚、沒食子酸丙酯、二丁基羥基甲苯、苯多酚、磷脂、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基對苯二酚、維生素系列中的一種或幾種。
3.如權利要求2所述的一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒，其特征在于:所述試劑Rl和試劑R2中的緩沖液相同。
4.如權利要求2所述的一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒，其特征在于:所述校準品的緩沖液采用甘氨酸緩沖液。
5.如權利要求1 4任一項所述的一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中， 試劑Rl含有:磷酸鹽緩沖液10 500mM ;Triton X1000.5 50g/L，牛血清蛋白0.5 10g/L,氯化鈉5 50g/L,乙二醇聚氧乙烯醚I 100g/L,疊氮鈉I 10g/L,且pH為6 9 ； 試劑R2含有:磷酸鹽緩沖液10 500mM，羊抗人載脂蛋白C3抗體50 500g/L，牛血清蛋白0.5 10g/L,氯化鈉5 50g/L,疊氮鈉I 10g/L,且pH為6 9 ; 校準品包括甘氨酸緩沖液10 500mM、載脂蛋白C3抗原、牛血清蛋白5 50g/L、疊氮鈉I 10g/L、二丁基輕基甲苯0.01 10g/L。
6.一種利用如權利要求1所述的檢測載脂蛋白C3的試劑盒進行檢測載脂蛋白C3的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)向待測樣品中加入試劑R1，解除樣本中抗原周圍電子層和水化層，使抗原位點充分暴露，待測樣品與試劑Rl按體積比為(1 10):250，讀取吸光度ODl ； (2)向步驟(I)的混合液中加入試劑R2，試劑R2與試劑Rl按體積比為1: (1 7)加入，讀取吸光度0D2 ； (3)使用載脂蛋白C3校準品在全自動生化分析儀上通過內置曲線擬合模式擬合標準曲線，根據吸光度自動計算出待測樣品中載脂蛋白C3的濃度。
7.如權利要求6所述的一種檢測載脂蛋白C3的方法，其特征在于:所述試劑R2與試劑 Rl 體積比為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 或1:7。
8.如權利 要求6所述的一種檢測載脂蛋白C3的方法，其特征在于:所述曲線擬合模式包括 Spline、二次方程、logit-log (3p)、logit-log (4p)、logit-log (5p)或 Polygonal中的一種。
全文摘要
一種檢測載脂蛋白C3的試劑盒，包含試劑R1緩沖液、表面活性劑、穩定劑、電解質、高分子促進劑、防腐劑，pH為6～9；試劑R2緩沖液、抗人載脂蛋白C3抗體、穩定劑、電解質、防腐劑，pH為6～9；校準品緩沖液、載脂蛋白C3抗原、穩定劑、防腐劑、抗氧化劑。以及利用該試劑盒檢測載脂蛋白C3的方法。本發明操作簡單、檢測速度快、檢測范圍寬，能夠滿足臨床快速高通量檢測樣本的要求，檢測效率明顯提高。
文檔編號G01N33/68GK103076454SQ20121057492
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者宿明明, 王慶國, 王愛龍 申請人:濰坊三維生物工程集團有限公司