專利名稱：一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法
技術領域：
本發明涉及生物學檢測技術領域，具體涉及一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法。
背景技術：
流行性出血熱(EHF)又稱腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renalsyndrome, HFRS),是由布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantavirus)中某些病毒引起，并以鼠類為主要傳染源的自然疫源性疾病。臨床上以發熱、休克、充血性出血和急性腎功能衰竭為主要表現，并常伴有腔道出血、中樞神經系統并發癥、肺水腫等多種并發癥。腎綜合征出血熱分布于全世界30多個國家，疫源地分布于五大洲70多個國家，已成為世界公共衛生問題。我國是受腎綜合征出血熱危害最為嚴重的國家，年報告發病人數約為4 6萬，占世界報告病例總數的90%以上，高發疫區發病率在50/10萬左右，偶有暴發流行，病死率高達30%。該病在我國分布范圍廣、疫區類型復雜，是我國最嚴重的蟲媒傳染病之
O 漢坦病毒為分節段的負鏈RNA病毒，其基因組由大(L)、中(M)和小(S)三個RNA片段組成，分別編碼依賴RNA的RNA多聚酶、包膜糖蛋白(Gl和G2)和核殼體蛋白。漢坦病毒基因組RNA的5’端和3’端的15 30個堿基互補，這些互補序列可以保持RNA的穩定性，并可能在轉錄或復制的過程中被RNA聚合酶識別，啟動合成新的RNA。11個堿基的最末端序列“TAGTAGTAGAC”為所有漢坦病毒所共有，是漢坦病毒的重要基因特征之一，是區分漢坦病毒和布尼亞病毒科其它病毒的重要依據。漢坦屬病毒和布尼亞病毒科其它病毒在血清學上沒有交叉反應。目前流行性出血熱病毒抗體傳統的檢測方法是采用血清學診斷方法，包括間接酶免吸附試驗檢測EHF IgG抗體、膠體金法、免疫熒光試驗檢測雙份血清IgG抗體等，這些方法均在一定程度上易出現假陽性或假陰性現象，給流行性出血熱的臨床診斷帶來一定干擾。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法，使之具有以下優點一、應用IgM捕獲ELISA法檢測EHF IgM抗體，以減少假陽性或假陰性現象對臨床診斷帶來的干擾，并且使該試劑盒能夠對流行性出血熱進行快速、準確的檢測，同時誤差小、檢測靈敏度高、對檢測設備要求低；二、提高試劑盒的使用安全性；三、提高反應板條的使用期限。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于所述盒體內設有EHF酶標板、封板膜、EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶；所述EHF酶標板上設有五個以上包被有固相抗人IgM單克隆抗體的透明反應孔；每IOOOml所述底物A溶液內含有檸檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、檸檬酸7. 76g
11.64g、乙酸鈉 7. 13g 10. 70g、冰乙酸1. 52ml 2. 28ml、雙氧水 O. 8ml 1. 2ml ；每IOOOml所述底物B溶液內含有無水乙醇520ml 780ml、乙二醇272ml 408ml、二甲基甲酰胺8ml 12ml、3, 3’，5, 5’ -四甲基聯苯胺O. 8g 1. 2g ;每IOOOml所述EHF陰性對照溶液內含有氯化鈉6g 8g、Na2HPO4 · 12H202. 2g
3.4g、KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀 0. 16g 0. 24g、鹿糖 40g 60g、疊氮化鈉 O. 08g
O.12g；所述EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入24 μ g 36 μ g羊抗兔抗體配置而成；所述終止液是在900ml純水中加入80ml 120ml硫酸配置而成的。優選的，所述EHF酶標板上設有5 95個反應孔。優選的，所述EHF酶標板包括板架和多個可拆卸安裝在所述板架上的反應板條，所述反應孔設置在所述反應板條上。
優選的，所述盒體內部設有隔斷，使所述盒體內部具有多個空腔。優選的，所述盒體內部設有一個橫向隔斷，使所述盒體分成一個上部用于容納所述EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶的空腔和一個底部用于容納所述EHF酶標板的空腔。所述流行性出血熱IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法(I) EHF酶標板的制備1.1配制EHF包被液用碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液將抗人IgM單克隆抗體溶液稀釋成濃度為O. 8 μ g/ml、ΡΗ=9. 6的溶液；1. 2包被用步驟1.1制得的EHF包被液按100 μ I/孔進行包被，并在2 8°C溫度下靜置40 50小時；1. 3洗滌液制備將含有O. 05%吐溫一 20、pH=7. 5的PBS溶液與蒸餾水按體積比I 40混合均勻，制得洗滌液；1. 4洗滌用洗滌液連續洗滌包被后的酶標板2次，拍干；1. 5封閉向洗滌后的透明反應孔內按130μ I/孔加入封閉液，所述封閉液為每IOOOml純水溶液中含NaHC032 . 93g,Na2CO3L 59g、牛血清白蛋白10g，并在20 25°C條件下，封閉2. 8 3. 2小時；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護液將反應孔密封，所述保護液組成為9. 5wt% 10. 5wt%小牛血清和89wt% 91wt%甘油，制得EHF酶標板；(2) EHF酶結合物溶液的配制2.1將5mg辣根過氧化物酶溶解在Iml雙蒸水中，再加入21. 4mg/ml的高碘酸鈉溶液200 μ 1，在室溫18°C 25°C條件下混合均勻制備得到辣根過氧化物酶溶液；2. 2再將辣根過氧化物酶溶液加入PH4. 4的醋酸-冰乙酸緩沖液，在2°C 8°C條件下透析16 20小時；2. 3取EHF抗原加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析16 20小時；2. 4將透析后的辣根過氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混勻，放入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3 3. 5小時，再加入4mg/ml的硼氫化鈉溶液，加入量為50 μ 1/0. 5mg EHF抗原，并充分混勻； 2. 5使步驟2. 4得到的混合溶液通過葡聚糖凝膠G-200柱，同時用PH=7.1的PBS溶液洗脫；2. 6用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進行檢測，收集試管內的羊抗鼠板條顯蘭色的試管內產物，制得酶結合物初溶液；2. 7將6g 8g氯化鈉、140ml 160ml小牛血清和O. 8g 1. 2g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得酶結合物稀釋液；2. 8將酶結合物初溶液用酶結合物稀釋液按1:700稀釋，并在2°C 8°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG - HRP溶液，制得EHF酶結合物溶液；(3)底物A溶液的 配制先將朽1檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、梓檬酸7. 76g 11. 64g和乙酸鈉7. 13g 10. 70g用純水完全溶解，再加入1. 52ml 2. 28ml的冰乙酸和O. 8ml 1. 2ml的雙氧水，最后用純水定容至1000ml，制得底物A溶液；(4)底物B溶液的配制將0.95g 1.05g3，3’，5，5’_四甲基聯苯胺溶解在IOml 二甲基甲酰胺中，再加入650ml無水乙醇和340ml乙二醇，混勻，制得底物B溶液；(5)終止液的配制向900ml純水中加入IOOml硫酸，混勻，制得終止液；(6) EHF陰性對照溶液的配制將氯化鈉6g 8g、Na2HPO4 · 12Η202· 2g 3. 4g、KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀
0.16g 0. 24g和蔗糖40g 60g完全溶解在純水中，再加入O. 8g 1. 2g疊氮化鈉，用純水定容至1000ml，制得EHF陰性對照溶液；(7) EHF陽性對照溶液的配制向步驟(6)制得的EHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體24 μ g 36 μ g，制得EHF陽性對照溶液。所述流行性出血熱IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟(I)樣品收集靜置待測血清30min，對所述待測血清進行離心處理10 20分鐘，即可進行檢測。(2)加樣檢測a.將在冷藏環境中貯藏的所述EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶平衡至室溫20°C 25°C ；b.將所述EHF酶標板用生理鹽水洗3次；c.采用生理鹽水作為稀釋液，按照1:100的比例稀釋待檢血清；d.將所述酶標板上的至少一個反應孔作為空白孔；取稀釋后的待檢血清按100 μ I/孔加入到所述酶標板上的至少一個反應孔內，作為樣品孔^EHF陽性對照溶液按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標板上的至少一個反應孔內，作為陽性對照孔；取EHF陰性對照液按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標板上的至少兩個反應孔內，作為陰性對照孔；e.將所述EHF酶標板貼上封板膜，震蕩混勻，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應29min 31min ；f.取出所述EHF酶標板，揭下封板膜，向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內各加入50 μ I酶結合物溶液，混勻，貼上封板膜，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應58min 62min ；g.取出所述EHF酶標板，并揭下封板膜，用生理鹽水洗滌各反應孔5次，每次間隔15秒 25秒,拍干；h.依次向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內各加入50 μ I底物溶液A和30 μ I底物溶液B，混勻，貼上封板膜，室溫20°C 25°C避光放置1(Γ30分鐘，揭下封板膜，觀察結果若只判斷檢測樣的陰陽性，采用目測方法，分別對比樣品孔與陽性對照孔、陰性對照孔的顏色，即可得出檢測結果；若需讀出準確的檢測數值，在步驟g后，向所述空白孔、樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內再分別加入50 μ I終止液，混勻后，使用酶標儀讀取結果。優選的，如待測血清不能及時檢測，應將待測血清在_20°C _15°C條件凍存。采用上述技術方案后，本發明的有益效果是由于本發明采用ELISA法IgM捕獲法檢測EHF IgM抗體，若待 測血清中含有流行性出血熱病毒，則流行性出血熱病毒IgM抗體即與EHF酶結合物、抗人-1gM單抗結合，并結合在微孔壁表面，通過底物作用顯色，用以特異性的檢測待測血清中的流行性出血熱IgM抗體，檢測出流行性出血熱病毒，與ELISA法間接法等其他方法相比，本發明靈敏度高、特異性強，實驗操作僅需一步即可出結果，因此，本發明不但減少了假陽性或假陰性現象對臨床診斷帶來的干擾，使該試劑盒能夠對流行性出血熱進行快速、準確的檢測，而且誤差小、檢測靈敏度高、對檢測設備要求低；還由于本發明采用了所述酶標板和各種溶液的配方，使得本發明試劑盒的檢測結果的準確程度是目前市場上其它出血熱檢測試劑所達不到的；本發明試劑盒陽性對照溶液為非傳染性EHF陽性血清，對實驗操作者安全；另外，本發明酶標板反應板條內含有甘油，因而無需干燥儲存，也不會因其儲存過程中受潮而失效，大大提高了反應板條儲存的有效期。
圖1為本發明實施例打開后俯視圖；圖2為本發明實施例內部正視示意圖；圖3為本發明實施例酶標板的示意圖；其中，1、盒體；2、EHF酶結合物溶液瓶；3、底物A溶液瓶；4、底物B溶液瓶；5、EHF陰性對照溶液瓶；6、EHF陽性對照溶液瓶；7、終止液溶液瓶；8、透明反應孔；9、板架；10、反應板條；11、橫向隔斷；12、縱向隔斷。
具體實施例實施例1一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒如圖1、圖2和圖3所示，本實施例試劑盒包括盒體1，盒體I內設有EHF酶標板(如圖3所示)、封板膜、EHF酶結合物溶液瓶2、底物A溶液瓶3、底物B溶液瓶4、EHF陰性對照溶液瓶5、EHF陽性對照溶液瓶6和終止液溶液瓶7 ；EHF酶標板上設有多個包被有固相抗人IgM單克隆抗體的透明反應孔8 ；每IOOOml底物A溶液內含有檸檬酸三鈉5. 2g、檸檬酸9. 7g、乙酸鈉8. 92g、冰乙酸1.9ml、雙氧水 Iml ；每IOOOml底物B溶液內含有無水乙醇650ml、乙二醇340ml、二甲基甲酰胺10ml、3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(簡稱TMB) Ig ；每IOOOmlEHF 陰性對照溶液內含有氯化鈉 7g、Na2HP04 · 12H202. 8g、KH2P040. 2g、KCLO. 2g、蔗糖50g,疊氮化鈉O.1g ；EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入30 μ g的羊抗兔抗體配制而成的；終止液是在900ml純水中加入硫酸IOOml配制而成的，所用硫酸為質量百分比為98%的濃硫酸。EHF酶標板上設有48個反應孔。EHF酶標板包括板架9和多個可拆卸安裝在板架9上的反應板條10，透明反應孔8設置在反應板條10上。盒體I內部設有一個橫向隔斷11，使盒體分成一個上部用于容納EHF酶結合物溶液瓶2、底物A溶液瓶3、底物B溶液瓶4、EHF陰性對照溶液瓶5、EHF陽性對照溶液瓶6和終止液溶液瓶7的空腔和一個底部用于容納板架9的空腔，橫向隔斷11為硬質材料，盒體I上部空腔設有還一個縱向隔斷12，底物A溶液瓶3和底物B溶液瓶4放入其中的一個空腔，其他溶液瓶放置于另一個空腔。實施例2 一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒本實施例中每IOOOml底物A溶液內含有檸檬酸三鈉4. 16g、檸檬酸7. 76g、乙酸鈉7. 13g、冰乙酸1. 52ml、雙氧水 O. 8ml ；每IOOOml底物B溶液內含有無水乙醇520ml、乙二醇272ml、二甲基甲酰胺8ml、3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺O. 8g；每IOOOmlEHF 陰性對照溶液內含有氯化鈉 6g、Na2HPO4 · 12H202. 2g、KH2PO4O. 16g、氯化鉀0. 16g、鹿糖40g,疊氮化鈉O. 08g ；EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入24 μ g的羊抗兔抗體配制而成的；終止液是在900ml純水中加入硫酸80ml配制而成的，所用硫酸為質量百分比為98%的濃硫酸；EHF酶標板上設有5個反應孔。其余同實施例1。實施例3一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒本實施例中每IOOOml底物A溶液內含有檸檬酸三鈉6. 24g、檸檬酸11. 64g、乙酸鈉10. 70g、冰乙酸2. 28ml、雙氧水1. 2ml ；每1000ml底物B溶液內含有無水乙醇780ml、乙二醇408ml、二甲基甲酰胺12ml、3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺1. 2g;每IOOOmlEHF 陰性對照溶液內含有氯化鈉 8g、Na2HPO4 · 12H203. 4g、KH2PO4O. 24g、氯化鉀0. 24g、蔗糖60g，疊氮化鈉O. 12g ；EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入36 μ g的羊抗兔抗體配制而成的；終止液是在900ml純水中加入硫酸120ml配制而成的，所用硫酸為質量百分比為98%的濃硫酸。EHF酶標板上設有95個反應孔。其余同實施例1。實施例4流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒制備方法本實施例中微孔板中所包被的兔抗人-1gM單抗在堿性環境下可以很好的結合在微孔板塑料表面上，采用的包被抗原濃度為O. 8 μ g/mL,本實施例中EHF酶標板由板架和多個可拆卸安裝在板架上的反應板條組成。制備如實施例1所述的流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，具體制備步驟如下 (I) EHF反應板條的制備1.1EHF包被液的配制用O. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(配方0. 159g Na2C03+0 . 29 3gNa2HCO3定容至100ml)將3. 42mg/ml的兔抗人-1gM單抗溶液稀釋成O. 8 μ g/ml, PH=9. 6 ；1. 2包被量EHF反應板條均按100 μ I/孔包被，待全部包被完畢，置2 8°C靜置、吸附48小時；1. 3洗滌液制備將含有O. 05% (體積含量)吐溫一 20、pH=7. 5的PBS溶液與蒸餾水按體積比1:40混合均勻，制得洗滌液。1. 4洗滌用洗滌液連續洗滌包被后的反應板條2次，拍干。1. 5封閉分別將上述洗滌后的反應板條加封閉液130 μ I/孔，室溫20 25°C封閉3小時；封閉液組成配方為NaHC032. 93g+Na2C03l. 59g+BSA10g，純水定容1000ml ；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護液將反應孔密封，所述保護液組成為10wt%小牛血清和90wt%甘油，制得EHF反應板條；分別將上述處理后的板條裝入鋁箔袋，封口，2 8°C保存備用。(2) EHF酶結合物的制備包括以下步驟2.1稱取辣根過氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶內，取Iml雙蒸水溶解，用加樣器取200 μ I高碘酸鈉溶液，滴入盛辣根過氧化物酶的小瓶內，將5mg辣根過氧化物酶溶解在Iml雙蒸水中，再加入21. 4mg/ml的高碘酸鈉溶液200 μ 1，在室溫18°C 25°C振蕩20min制備得到辣根過氧化物酶溶液；2. 2振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4. 4醋酸緩沖液中，4°C冰箱透析18小時；2. 3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析18小時；2. 4將透析后的辣根過氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混勻，放入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3小時，再加入4mg/ml的硼氫化鈉溶液，加入量為50 μ 1/0. 5mg EHF抗原，并充分混勻；2.5使步驟2. 4得到的混合溶液通過葡聚糖凝膠G-200柱，同時用PH=7.1的PBS溶液洗脫；2. 6用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進行檢測，收集試管內的羊抗鼠板條顯蘭色的試管內產物，制得酶結合物初溶液。也可將收集的酶結合物加入等量甘油混勻(甘油能更好的穩定酶結合物活性)，放置于-20°C冰箱保存。2. 7將7g氯化鈉、150ml小牛血清和1. Og疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得
酶結合物稀釋液；2. 8將酶結合物初溶液用酶結合物稀釋液按1:700稀釋，并在6°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結 合物溶液，裝入試劑瓶冷藏備用。(3)底物A的配制用電子天平準確稱量檸檬酸三鈉5. 2g、檸檬酸9. 7g、乙酸鈉8. 92g加入容量瓶中；先加適量純水，輕搖使之完全溶解；再用移液器準確量取冰乙酸1. 9ml、雙氧水Iml加入容量瓶中，輕搖混勻；以純水定容至1000ml。(4)底物B的配制用電子天平準確稱取TMBlg，倒入有色廣口瓶中；用移液器準確量取二甲基甲酰胺10ml，加入有色廣口瓶中，輕搖使TMB混勻；用量筒準確量取無水乙醇650ml、乙二醇340ml，倒入廣口瓶中，搖勻，定容至1000ml。(5)終止液的配制用量筒準確量取所需的純水900ml，倒入廣口瓶中；再用量筒準確量取濃硫酸(質量百分比為98%以上)100ml，邊攪拌邊慢慢倒入廣口瓶中；扣上瓶蓋，輕搖廣口瓶，使液體混勻。(6) EHF陰性對照的配制用電子天平準確稱量NaCL7g、Na2HPO4 · 12H202. 8g,KH2PO4O. 2g、KCL0. 2g、蔗糖 50g，加入容量瓶；先加適量純水，輕搖使之溶解完全；再用電子天平準確稱量疊氮化鈉O. lg，力口入容量瓶，攪拌使之完全溶解，輕搖混勻；以純水定容，混勻備用。(7) EHF陽性對照的配制向步驟(6)制得的EHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImLEHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體30 μ g,制得陽性對照溶液。實施例5流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒制備方法本實施例同實施例4，不同之處在于(I)EHF反應板條的制備1. 2包被量EHF反應板條均按100 μ I/孔包被，待全部包被完畢，置2 8°C靜置、吸附40小時；1. 5封閉分別將上述洗滌后的反應板條加封閉液130 μ I/孔，室溫20 25°C封閉2. 8小時；封閉液組成配方為NaHC032 . 93g+Na2C03l. 59g+BSA10g，純水定容1000ml ；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護液將反應孔密封，所述保護液組成為9. 5wt%小牛血清和91wt%甘油，制得EHF反應板條；(2) EHF酶結合物的制備包括以下步驟2. 2振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4. 4醋酸緩沖液中，4°C冰箱透析16小時；2. 3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析18小時；2. 7將6g氯化鈉、140ml小牛血清和O. 8g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得
酶結合物稀釋液；2. 8將酶結合物初溶 液用酶結合物稀釋液按1:700稀釋，并在2°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結合物溶液，裝入試劑瓶冷藏備用。(3)底物A的配制用電子天平準確稱量檸檬酸三鈉4. 16g、檸檬酸7. 76g、乙酸鈉7. 13g加入容量瓶中；先加適量純水，輕搖使之完全溶解；再用移液器準確量取冰乙酸1. 52ml、雙氧水O. 8ml加入容量瓶中，輕搖混勻；以純水定容至1000ml。(6)陰性對照的配制用電子天平準確稱量NaCL6g、Na2HPO4 · 12Η202· 2g、KH2PO4O. 16g、KCLO. 16g、蔗糖40g，加入容量瓶；先加適量純水，輕搖使之溶解完全；再用電子天平準確稱量疊氮化鈉
O.8g，加入容量瓶，攪拌使之完全溶解，輕搖混勻；以純水定容，混勻備用。(7)陽性對照的配制向步驟(6)制得的陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體24 μ g，制得陽性對照溶液。實施例6流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒制備方法本實施例同實施例4，不同之處在于(I)EHF反應板條的制備1. 2包被量EHF反應板條均按100 μ I/孔包被，待全部包被完畢，置8°C靜置、吸附50小時；1. 5封閉分別將上述洗滌后的反應板條加封閉液130 μ I/孔，室溫20 25°C封閉3. 2小時；封閉液組成配方為NaHC032. 93g+Na2C031. 59g+BSA10g，純水定容1000ml ；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護液將反應孔密封，所述保護液組成為10. 5wt%小牛血清和89. 5wt%甘油，制得EHF反應板條；(2) EHF酶結合物的制備包括以下步驟2. 2振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4. 4醋酸緩沖液中，4°C冰箱透析20小時；
2. 3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析20小時；2. 7將8g氯化鈉、160ml小牛血清和1. 2g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得
酶結合物稀釋液；2. 8將酶結合物初溶液用酶結合物稀釋液按1:700稀釋，并在8°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結合物溶液，裝入試劑瓶冷藏備用。(3)底物A的配制用電子天平準確稱量檸檬酸三鈉6. 24g、檸檬酸11. 64g、乙酸鈉10. 7g加入容量瓶中；先加適量純水，輕搖使之完全溶解；再用移液器準確量取冰乙酸2. 28ml、雙氧水1. 2ml加入容量瓶中，輕搖混勻；以純水定容至1000ml。(6)陰性對照的配制用電子天平準確稱量氯化鈉8g、Na2HP04 · 12H203. 4g、KH2P040. 24g、氯化鉀
0.24g、蔗糖60g，加入容量瓶；先加適量純水，輕搖使之溶解完全；再用電子天平準確稱量疊氮化鈉1. 2g，加入容量瓶，攪拌使之完全溶解，輕搖混勻；以純水定容，混勻備用。(7)陽性對照的配制向步驟(6)制得的陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體36 μ g，制得陽性對照溶液。
實施例8流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒使用方法實施例1所述的流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒的使用方法(I)樣品收集靜置待測血清30min，對所述待測血清進行離心處理10 20分鐘,進行檢測。(2)加樣檢測a.將在冷藏環境中貯藏的EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶等試劑平衡至室溫20°C 25°C ；b.將所述EHF酶標板用生理鹽水洗3次；c.采用生理鹽水作為稀釋液，按照1:100的比例分別稀釋待檢血清、陰性對照溶液和陽性對照溶液；d.將所述酶標板上的一個反應孔作為空白孔；取稀釋后的待檢血清按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標板上的一個反應孔內，作為樣品孔；取稀釋后的陽性對照溶液按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標板上的一個反應孔內，作為陽性對照孔；取稀釋后的待檢血清按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標板上的兩個反應孔內，作為陰性對照孔；e.將所述EHF酶標板貼上封板膜，震蕩混勻，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應30min ；f.取出所述EHF酶標板，揭下封板膜，向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內各加入50 μ I酶結合物溶液，混勻，貼上封板膜，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應60min ；g.取出所述EHF酶標板，并揭下封板膜，用生理鹽水洗滌各反應孔5次，每次間隔20秒,拍干；
h.依次向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內各加入50 μ I底物溶液Α，30 μ I底物溶液B，混勻，貼上封板膜，室溫20°C 25°C避光放置20分鐘，揭下封板膜，觀察結果若只判斷檢測樣的陰陽性，采用目測方法，分別對比樣品孔與陽性對照孔、陰性對照孔的顏色，即可得出檢測結果；若需讀出準確的檢測數值，在步驟f后，向樣品孔內再加入50μ I終止液，混勻后，使用酶標儀讀取結果；(3)檢測結果分析在450nm波長下用空白孔調零讀取各孔的吸光度值，并按如下計算方法，得出檢測結果當陰性對照孔的平均吸光度值小于O. 10時，臨界值為O. 10 ;當陰性對照孔平均吸光度值大于O. 10時，臨界值=3 X陰性對照計算平均吸光度值；a.比色法若樣品孔吸光度值彡臨界值，檢測結果為陽性；若樣品孔吸光度值〈臨界值，檢測結果為陰性；b.比值法若樣品孔吸光度值/臨界值彡1，檢測結果為陽性；若樣品孔吸光度值/臨界值〈1，檢測結果為陰性；當陰性對照孔平均吸光度值/臨界吸光度值〈O. 33，并且陽性對照孔平均吸光度值/臨界吸光度值> 6. O時，則檢測結果有效，否則應當重復試驗。本發明流行性出血熱酶聯免疫檢測試劑盒的性能指標測試(I)陰性參考品符合率用10份該試劑陰性參考品檢測，檢測結果全部成陰性。(2)陽性參考品符合率用10份該試劑陽性參考品檢測(包括強、中、弱)檢測，檢測結果全部成陽性。(3)精密性用I份精密性參考品做10個測試，CV值不高于10%。(4)臨床實驗結果用本試劑盒檢測已確診的臨床樣本1000例(其中EHF陽性50例)，檢測結果顯示，陰性符合率100%，陽性符合率100%，總符合率100%。檢測實例共檢測臨床血清樣本1000例(其中EHF陽性50例)，使用本發明方法進行檢測，其特異性和敏感性均為100%。表I本發明EHF試劑盒檢測結果與臨床診斷結果比較
權利要求
1.一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于所述盒體內設有EHF酶標板、封板膜、EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶； 所述EHF酶標板上設有五個以上的包被有固相抗人IgM單克隆抗體的透明反應孔； 每IOOOml所述底物A溶液內含有朽1檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、朽1檬酸7. 76g 11. 64g、乙酸鈉7. 13g 10. 70g、冰乙酸1. 52ml 2. 28ml、雙氧水O. 8ml 1. 2ml ； 每IOOOml所述底物B溶液內含有無水乙醇520ml 780ml、乙二醇272ml 408ml、二甲基甲酰胺8ml 12ml、3, 3’，5, 5’ -四甲基聯苯胺O. 8g 1. 2g ; 每IOOOml所述EHF陰性對照溶液內含有氯化鈉6g 8g、Na2HPO4 · 12H202. 2g 3. 4g、KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀 0. 16g 0. 24g、鹿糖 40g 60g、疊氮化鈉 0. 08g 0. 12g ；所述EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入24 μ g 36 μ g的羊抗兔抗體配制而成的； 所述終止液是在900ml純水中加入硫酸80ml 120ml配制而成的。
2.如權利要求1所述的一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述EHF酶標板上設有5 95個反應孔。
3.如權利要求1所述的一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述EHF酶標板包括板架和多個可拆卸安裝在所述板架上的反應板條，所述反應孔設置在所述反應板條上。
4.如權利要求1所述的一種流行性出血熱IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述盒體內部設有隔斷，使所述盒體內部具有多個空腔。
5.如權利要求4所述的一種流行性出血熱IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述盒體內部設有一個橫向隔斷，使所述盒體分成一個上部用于容納所述EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶的空腔和一個底部用于容納所述EHF酶標板的空腔。
6.權利要求1所述流行性出血熱IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于 (I)EHF酶標板的制備1.1配制EHF包被液用碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液將抗人IgM單克隆抗體溶液稀釋成濃度為O. 8 μ g/ml、ΡΗ=9· 5 9· 7的溶液；1.2包被用步驟1.1制得的EHF包被液按100 μ I/孔對所述透明反應孔進行包被，并在2 8°C溫度下靜置40 50小時；1.3洗滌液制備將含有O. 05%吐溫一 20、pH=7. 5的PBS溶液與蒸餾水按體積比1:40混合均勻，制得洗滌液；1.4洗滌用洗滌液連續洗滌包被后的酶標板2次，拍干；1.5封閉向洗滌后的透明反應孔內按130μ I/孔加入封閉液，所述封閉液為每IOOOml純水溶液中含NaHC032. 93g、Na2CO3L 59g、牛血清白蛋白10g，并在20 25°C條件下，封閉·2. 8 3. 2小時；1.6甩出孔中的封閉液，加入保護液將反應孔密封，所述保護液組成為9wt% llwt%小牛血清和89wt% 91wt%甘油，制得EHF酶標板；(2)EHF酶結合物溶液的配制 · 2.1將5mg辣根過氧化物酶溶解在Iml雙蒸水中，再加入21. 4mg/ml的高碘酸鈉溶液·200 μ 1，在室溫18°C 25°C條件下混合均勻制備得到辣根過氧化物酶溶液； ·2. 2再將辣根過氧化物酶溶液加入PH4. 4的醋酸-冰乙酸緩沖液，在2°C 8°C條件下透析16 20小時； · 2.3取EHF抗原加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析16 20小時； · 2.4將透析后的辣根過氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混勻，放入pH=9. 6、碳酸鈉含量為·O.05mol/L的碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3 3. 5小時，再加入4mg/ml的硼氫化鈉溶液，加入量為50 μ 1/0. 5mg EHF抗原，并充分混勻； ·2.5使步驟2. 4得到的混合溶液通過葡聚糖凝膠G-200柱，同時用PH=7.1的PBS溶液洗脫； ·2.6用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進行檢測，收集試管內的羊抗鼠板條顯蘭色的試管內產物，制得酶結合物初溶液； ·2.7將6g 8g氯化鈉、140ml 160ml小牛血清和O. 8g 1. 2g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得酶結合物稀釋液； ·2.8將酶結合物初溶液用酶結合物稀釋液按1:700稀釋，并在2°C 8°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結合物溶液； (3)底物A溶液的配制 先將檸檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、檸檬酸7. 76g 11. 64g和乙酸鈉7. 13g 10. 70g用純水完全溶解，再加入1. 52ml 2. 28ml的冰乙酸和O. 8ml 1. 2ml的雙氧水，最后用純水定容至1000ml，制得底物A溶液； (4)底物B溶液的配制 將O. 95g 1.05g3，3’，5，5’_四甲基聯苯胺溶解在IOml 二甲基甲酰胺中，再加入·650ml無水乙醇和340ml乙二醇，混勻，制得底物B溶液； (5)終止液的配制 向900ml純水中加入IOOml硫酸，混勻，制得終止液； (6)EHF陰性對照溶液的配制將氯化鈉 6g 8g,Na2HPO4 ·12Η202· 2g 3. 4g,KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀 0. 16g ·0.24g和蔗糖40g 60g完全溶解在純水中，再加入O. 8g 1. 2g疊氮化鈉，用純水定容至·1000ml，制得EHF陰性對照溶液； (7)EHF陽性對照溶液的配制 向步驟(6)制得的EHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體24 μ g 36 μ g，制得EHF陽性對照溶液。
7.如權利要求1所述的流行性出血熱IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟 (I)樣品收集 靜置待測血清30min，對所述待測血清進行離心處理10 20分鐘，即可進行檢測；(2)加樣檢測 a.將在冷藏環境中貯藏的所述EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶平衡至室溫20°C 25°C ； b.將所述EHF酶標板用生理鹽水洗3次； c.采用生理鹽水作為稀釋液，按照1:100的比例稀釋待檢血清； d.將所述酶標板上的至少一個反應孔作為空白孔；取稀釋后的待檢血清按 οομI/孔加入到所述酶標板上的至少一個反應孔內，作為樣品孔；取EHF陽性對照溶液按100 μ I/孔加入到所述酶標板上的至少一個反應孔內，作為陽性對照孔；取EHF陰性對照液按100 μ I/孔加入到所述酶標板上的至少兩個反應孔內，作為陰性對照孔； e.將所述EHF酶標板貼上封板膜，震蕩混勻，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應.29min 31min ； f.取出所述EHF酶標板，揭下封板膜，向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內各加入.50 μ I酶結合物溶液，混勻，貼上封板膜，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應58min 62min ； g.取出所述EHF酶標板，并揭下封板膜，用生理鹽水洗滌各反應孔5次，每次間隔15秒 25秒，拍干； h.依次向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內各加入50μ I底物溶液A和30 μ I底物溶液B，混勻，貼上封板膜，室溫20°C 25°C避光放置1(Γ30分鐘，揭下封板膜，觀察結果若只判斷檢測樣的陰陽性，采用目測方法，分別對比樣品孔與陽性對照孔、陰性對照孔的顏色，即可得出檢測結果；若需讀出準確的檢測數值，在步驟g后，向所述空白孔、樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內再分別加入50 μ I終止液，混勻后，使用酶標儀讀取結果。
8.如權利要求7所述的流行性出血熱IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，如待測血清不能及時檢測，應將待測血清在_20°C _15°C條件凍存。
全文摘要
本發明公開了一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法，包括盒體，所述盒體內設有EHF酶標板、封板膜、EHF酶結合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶。本發明采用IgM捕獲ELISA法檢測EHF IgM抗體，以減少假陽性或假陰性現像對臨床診斷帶來的干擾，并且使該試劑盒能夠對流行性出血熱進行快速、準確的檢測，同時誤差小、檢測靈敏度高、對檢測設備要求低。
文檔編號G01N33/577GK103063841SQ201210572128
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者楊致亭, 楊愛香, 王春光, 沈孝功, 劉發新, 劉海波, 邱香廷, 宋玉翠 申請人:濰坊市康華生物技術有限公司