專利名稱：一種稻瘟病菌的病原相關分子模式的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌的病原相關分子模式，具體涉及一種稻瘟病菌的病原相關分子模式，屬于植物保護和生物技術領域。
背景技術：
植物自身的先天免疫機制能有效抵御致病微生物的入侵。當感病植物受到病原菌特異小種侵染時，植物自身的免疫機制不能被激活，最終導致病害發生。植物通常通過兩套防御機制抵御病原微生物入侵，第一套是通用機制，第二套是抵御病原菌特異小種的機制。植物通用防御機制是病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)激發的免疫機制，即PTI(PAMP-triggered immunity)。PTI是通過寄主胞外表面受體識別病原相關分子模式而激活。已報道的植物病原真菌中的病原相關分子模式主要有木聚糖酶(xylan ase)、轉化酶(invertase)、β -葡聚糖(β-glucans)、幾丁質(chitin)和麥角固醇(ergosterol)，其中只有水稻識別β-葡聚糖。由此可見，植物病原真菌，特別是寄主為水稻的真菌病原相關分子模式目前還少有鑒定到。研究真菌病原相關分子模式有助于了解寄主與病原互作早期的免疫機制，以達到開發生物制劑進行植物病害生物防治的目的。植物對病原相關分子模式的識別可引發寄主一系列的生理反應，諸如①H+、K+、Cl+和Ca2+離子流的產生，其中Ca2+離子流增加是植物免疫反應關鍵的一步；②活性氧爆發；③從絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)到防御相關基因表達，MAPKs參與了植物防御反應。在PTI過程中，MAPK聯級的激活使得WRKY型的轉錄因子表達，而這類轉錄因子是植物防御反應的關鍵調控因子；④胼胝質產生，細胞壁與細胞膜間沉積的胼胝質是PTI響應時的一個典型標志；⑤荷爾蒙，SA、JA和ET是防御反應過程中比較典型的植物荷爾蒙。⑥氣孔關閉；⑦基因沉默。發明內容
本發明的目的提供一種全新的稻瘟病菌病原相關分子模式。
本發明的技術方案是:保持現有病原菌病原相關分子模式鑒定方法不變，包括胼胝質沉積、活性氧爆發 、防御相關基因表達譜分析等方法均與常規相同，其特征是通過一系列的實驗證明了該基因具有病原相關分子模式的特性，即該基因是稻瘟病菌病原相關分子模式(PAMPs)。
進一步，該基因是稻瘟病菌病原相關分子模式PAMPs驗證方法為:
(I)根據MgNIP53的核酸序列設計PCR特異性引物，PCR分析MgNIP53基因在稻瘟病菌基因組中的保守性，結果表明，MgNIP53存在于大多數稻瘟病菌株中，非常保守；
(2)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h,苯胺藍染色30min后置于突光顯微鏡下觀察胼胝質產生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照。結果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產生大量的胼胝質，而對照根組織產生少量的胼胝質；
(3) 5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h，DAB染色30min后置于顯微鏡下觀察胼胝質產生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照；結果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產生大量的活性氧，而對照對照根組織產生少量的胼胝質；
(4)利用real-time PCR檢測到了 MgNIP53能誘導水稻根組織SA途徑、JA/Et途徑和WRKY型轉錄因子表達；
通過以上實驗，證實了 MgNIP53為稻瘟病菌病原相關分子模式。
本發明的有益效果在于:
通過一系列方法鑒定到了一個稻瘟病菌病原相關分子模式。該病原相關分子模式可為今后開發生物制劑進行有效生物防治稻瘟病提供有力參考。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
病原相關分子模式的原核表達產物處理水稻根組織24h，苯胺藍染色后直接觀察胼胝質形成情況以及通過DAB染色后進行活性氧觀察，同時提取根組織總RNA，利用real-time PCR分析SA途徑基因、JA/Et途徑基因和WRKY型轉錄因子的表達。結果表明，原核表達產物處理水稻根組織后形成了胼胝質以及產生了活性氧，real-time PCR檢測到SA途徑基因、JA/Et途徑基因和WRKY型轉錄因子表達。因此，該稻瘟病菌基因是病原相關分子模式。
該基因是稻瘟病菌病原相關分子模式PAMPs驗證方法為:
(I)根據MgNIP53的核酸序列設計PCR特異性引物，PCR分析MgNIP53基因在稻瘟病菌基因組中的保守性，結果表明，MgNIP53存在于大多數稻瘟病菌株中，非常保守；
(2)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h,苯胺藍染色30min后置于突光顯微鏡下觀察胼胝質產生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照。結果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產生大量的胼胝質，而對照根組織產生少量的胼胝質；
(3) 5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h，DAB染色30min后置于顯微鏡下觀察胼胝質產生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照；結果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產生大量的活性氧，而對照對照根組織產生少量的胼胝質；
(4)利用real-tim e PCR檢測到了 MgNIP53能誘導水稻根組織SA途徑、JA/Et途徑和WRKY型轉錄因子表達；
通過以上實驗，證實了 MgNIP53為稻瘟病菌病原相關分子模式。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種稻瘟病菌的病原基因，其特征在于，該基因為MgNIP53，是稻瘟病菌病原相關分子模式PAMPs，能誘導植物活性氧產生，胼胝質產生、SA途徑相關基因、JA/Et途徑相關基因和WRKY型轉錄因子有有表達。
2.如權利要求1所述的稻瘟病菌的病原基因，其特征在于，該基因是稻瘟病菌病原相關分子模式PAMPs驗證方法為: (1)根據MgNIP53的核酸序列設計PCR特異性引物，PCR分析MgNIP53基因在稻瘟病菌基因組中的保守性，結果表明，MgNIP53存在于大多數稻瘟病菌株中，非常保守； (2)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h,苯胺藍染色30min后置于突光顯微鏡下觀察胼胝質產生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照。結果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產生大量的胼胝質，而對照根組織產生少量的胼胝質； (3)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h，DAB染色30min后置于顯微鏡下觀察胼胝質產生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照；結果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產生大量的活性氧，而對照對照根組織產生少量的胼胝質； (4)利用real-timePCR檢測到了 MgNIP53能誘導水稻根組織SA途徑、JA/Et途徑和WRKY型轉錄因子表達； 通過以上實驗，證實了 MgNIP5 3為稻瘟病菌病原相關分子模式。
全文摘要
本發明公開了一種稻瘟病菌的病原基因，保持現有病原菌病原相關分子模式鑒定方法不變，包括胼胝質沉積、活性氧爆發、防御相關基因表達譜分析等方法均與常規相同，其特征是通過一系列的實驗證明了該基因具有病原相關分子模式的特性，即該基因是稻瘟病菌病原相關分子模式(PAMPs)。通過一系列方法鑒定到了一個稻瘟病菌病原相關分子模式。該病原相關分子模式可為今后開發生物制劑進行有效生物防治稻瘟病提供有力參考。
文檔編號G01N1/30GK103160518SQ20121056793
公開日2013年6月19日 申請日期2012年12月16日 優先權日2012年12月16日
發明者楊靜, 李成云, 劉林, 朱有勇, 徐暢, 施竹鳳 申請人:云南農業大學