專利名稱：伐地那非的抗原模擬表位及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及伐地那非抗原模擬表位及其應用。
背景技術：
伐地那非(vardenafil, vard)是一種由德國拜耳公司生產的磷磷酸二酯酶_5抑制劑(PDE-5 inhibitors)，用于治療男性陰莖勃起功能障礙。天然壯陽藥品被認為安全、無副作用，深受世界各地消費者的親睞，而在天然壯陽藥中違法添加PDE-5抑制劑藥物，會對公眾健康產生一系列副作用，如頭痛、面部潮紅、消化不良、視力模糊和肌肉酸痛。PDE-5抑制劑與硝酸酯藥物相互作用會導致嚴重的低血壓。因此，加強天然壯陽藥物中非法添加PDE-5抑制劑的檢測對人類的健康意義重大。目前，篩查違法添加的伐地那非的檢測方法包括LC-MS、GC-MS和LC/ES1-MS/MS，雖然上述方法靈敏、精確、可靠，但所需設備昂貴且運行費用高，很難在基層工作中大規模開展。免疫學檢測方法具有靈敏、特異、快速和廉價的特點，已廣泛運用于食品和環境樣品的快速檢測。但是該方法必須使用vard標準品，不僅增加了檢測成本，而且對檢測人員及環境易造成危害，在一定程度上制約了免疫學方法的應用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨特型抗體及抗原模擬表位技術來實現有害小分子物質標準品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結合的噬菌體展示多肽，該技術在探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質空間結構表位、新型疫苗的研制等方面應用廣泛。噬菌體展示技術為獲得vard的代替品提供了技術支持。本發明通過用噬菌體展示肽庫技 術，從肽庫中篩選出能與靶分子(抗伐地那非單克隆抗體)特異性結合的多肽(抗原模擬表位)，該抗原模擬表位具有與天然伐地那非分子相似的免疫反應特性，通過獲得的伐地那非抗原模擬表位，以代替價格昂貴且毒性強的伐地那非標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于伐地那非的免疫學檢測。
發明內容
本發明以抗伐地那非單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標板上，投入噬菌體隨機展示環七肽庫，進行親和淘選，獲得了 I種伐地那非的抗原模擬表位，其氨基酸序列如下
伐地那非抗原模擬表位從噬菌體隨機環七肽庫中篩選的伐地那非抗原模擬表位(多肽)，其氨基酸序列為CKFPSHPYC。上述抗原模擬表位(多肽)結構中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構體的一種，即C代表半胱氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基,F代表苯丙氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基。抗原模擬表位的N末端和C末端的兩個半胱氨酸殘基形成分子內二硫鍵,為環狀結構。本發明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，優選為AAG TTTCCG TCG CAT CCT TAT。本發明提及的伐地那非抗原模擬表位(多肽)可通過噬菌體擴增、化學合成或基因工程重組表達的方式進行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有伐地那非抗原模擬表位(多肽)的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產展示有伐地那非抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子。化學合成是指依據公布的模擬表位的氨基酸序列，通過化學合成多肽的方式進行多肽合成。基因工程重組表達的方式是指將編碼模擬表位的基因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行伐地那非抗原模擬表位的大量制備。本發明還涉及所述伐地那非抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。免疫學檢測的類型包括酶聯免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基于抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測類型。本發明伐地那非抗原模擬表位(CKFPSHPYC)在應用時，可以把合成的模擬表位用于免疫學檢測分析，將通過噬菌體擴增獲得的展示有伐地那非抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測，當然，也可以將伐地那非抗原模擬表位從噬菌體上切下來代替伐地那非標準品來進行免疫學檢測分析。還涉及伐地那非抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。
還涉及伐地那非抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應用。前述伐地那非抗原模擬表位可以替換價格昂貴的伐地那非標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于伐地那非的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然伐地那非分子相似的免疫反應特性，效果非常好。本發明的有益效果是本發明伐地那非抗原模擬表位可以替換價格昂貴的伐地那非標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于伐地那非的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然伐地那非分子相似的免疫反應特性，效果非常好。減少了伐地那非對人體健康的危害，節約了成本，具有很高的應用價值。
圖1以伐地那非抗原模擬表位建立的間接競爭ELISA標準曲線。線性檢測范圍為(2. 4 - 32) ng/mL, IC50 為 8. 8 ng/mL。
具體實施例方式
實施例1.伐地那非抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定
I)伐地那非抗原模擬表位的親和淘選具體方法為用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗伐地那非單克隆抗體，并以終濃度100 μ g/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用TBST (50 mM NaCl, pH 7. 5 包含 O. 1% Tween-20 (v/v))洗滌 10 次后，加入 300 μ I 封閉液(3% BSA-PBS)4°C孵育2小時。2小時后棄封閉液，用TBST洗滌5次，每孔加入100μ I噬菌體肽庫(噬菌體展示環七肽庫或十二肽庫，購自NEB公司，用TBS 10倍稀釋噬菌體原液，約1. OXlO11 pfu)，22-26°C振蕩反應I小時。棄去未結合的噬菌體，用TBST洗滌10次，結合上的噬菌體用O. 2 M Glycine-HCl (pH 2.2)洗脫，并立即用15 μ I I M Tris-HCl(pH 9.1)中和。取10 μ I洗脫噬菌體測滴度，其余的用于感染20 mL生長至對數前期的Ε. coli ER2738菌株進行擴增。第三天用PEG/NaCl沉淀純化噬菌體，并測定擴增后噬菌體的滴度。在第二、第三輪的淘選過程中，包被的抗伐地那非單克隆抗體濃度分別為75 μ g/mL和50 μ g/mL,所用的TBST濃度為O. 25%和O. 5%，其余步驟同上。2)陽性噬菌體克隆的鑒定從第三輪淘選后測定噬菌體滴度的平板中隨機挑取20個曬菌體斑,進行曬菌體的擴增,采用間接酶聯免疫吸附檢測方法(Indirect EnzymeLinked immunoasorbent assay,1-ELISA)進行陽性卩遼菌體克隆的鑒定,具體方法為首先，用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗伐地那非單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37°C孵育I小時；投入100 μ 噬菌體斑擴增液(1. OX IO11 pfu)，以原始噬菌體肽庫作為陰性對照，37 °C孵育I小時；加入1:5000倍稀釋的HRP標記抗M13噬菌體二抗100 μ1，37 °C孵育I小時；加入ΙΟΟμΙ TMB底物液，避光顯色5min，酶標儀(ThermoScientific Multiskan FC)讀取450 nm處的吸收值。選取OD45c!大于陰性對照2倍的卩遼菌體克隆為陽性克隆。3)伐地那非抗原模擬表位的鑒定采用間接競爭ELISA的方法進行伐地那非抗原模擬表位的鑒定，具體方法為用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗伐地那非單克隆抗體，10Kg/mL 包被酶標板，4°C 孵育過夜；第二天用 PBST (10 mM PBS, 0. 05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37°C孵育I小時；投入50 μ 經間接ELISA鑒定為陽性的噬菌體克隆(1. OXlO11 pfu)和50 μ 伐地那非標準品(濃度范圍為0_20 ng/ml)，37°C孵育I小時；加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗100 μ1，37 孵育I小時；加入100 μ TMB底物液，避光顯色5min，讀取OD45tl,能結合抗伐地那非單克隆抗體，且能被伐地那非標準品所阻斷的噬菌體，鑒定為伐地那非的抗原模擬表位。
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實施例2.伐地那非抗原模擬表位編碼基因的測序及其氨基酸序列的確定
將經過間接競爭ELISA鑒定展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體進行擴增，提取噬菌體的DNA測序模板。簡要過程如下進行噬菌體擴增,在第一步離心后,將800 μ 含噬菌體上清轉入一新離心管。加入200 μ PEG/NaCl沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100 μ 碘化物緩沖液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，I mM EDTA, 4 M NaI)，加入250 μ 無水乙醇沉淀DNA，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(DNA測序模板)。沉淀最終重懸于20 μ 滅菌水，取2 μ 進行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5 PL噬菌體模板進行DNA測序，其-96 gill測序引物為5’ -hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依據DNA測序結果及密碼子表可獲得伐地那非抗原模擬表位的氨基酸序列CKFPSHPYC。實施例3.伐地那非抗原模擬表位作為競爭抗原在ELISA中的應用(I)樣品提取
稱取5g待測樣品，加入25 ml 60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后,取I ml濾液加入4 ml PBS(磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2)混勻后，即為樣品提取液，待用。(2)包被及封閉用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗伐地那非單克隆抗體，10 Pg/ml包被酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20 (v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37 °C孵育I小時后，用PBST洗板6次待用。( 3 )標準曲線的建立
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體(1. OX IO11 pfu)和一系列不同濃度的50 μ 伐地那非標準品，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取OD45tlt5以伐地那非濃度對數為橫坐標，結合率(加入伐地那非的孔的OD45tl/未加入伐地那非的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線(圖1)。(4)樣品的檢測
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體(1. OX IO11 pfu)和待測樣品提取液，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D·，計算結合率，并根據標準曲線，倒推出樣品中伐地那非的含量。實施例4.伐地那非抗原模擬表位作為固相抗原在ELISA中的應用(I)樣品提取
稱取5g樣品，加入25 ml 60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后,取Iml濾液加入4ml PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2)混勻后，即為樣品提取液，待用。(2)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀 釋展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體(2. OX IO11pfu), 100 μ 包被于酶標板，4°C孵育過夜。第二天用 PBST (10 mM PBS, O. 05% Tween-20(v/v))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37 °C孵育I小時后，用PBST洗板6次待用。( 3 )標準曲線的建立
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 抗伐地那非單克隆抗體(O. 5 ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ 伐地那非標準品，37°C孵育I小時。加入1:2000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以伐地那非濃度對數為橫坐標，結合率(加入伐地那非的孔的OD450/未加入伐地那非的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線。(4)樣品的檢測
取出經步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50 μ 抗伐地那非單克隆抗體(O. 5ng/ml)和一系列不同濃度的50 μ 伐地那非標準品，37 °C孵育I小時。加入1:2000稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗，37°C孵育I小時。然后用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以伐地那非濃度對數為橫坐標，結合率(加入伐地那非的孔的OD450/未加入伐地那非的孔的OD45tlX 100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線
實施例5.伐地那非抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析分析中的應用(I)樣品提取
稱取5g樣品，加入25 ml 60 %的甲醇-PBS溶液，200 rpm振蕩5分鐘；將提取液用whatman I號濾紙進行過濾后,取I ml濾液加入4毫升PBS (磷酸鹽緩沖液，pH=7. 2)混勻后，即為樣品提取液，待用。(2)噬菌體及控制線的點陣
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體(2. OX IO11pfu)，用點陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑O. 2-0. 45微米)，作為檢測線；將0. 5 mg/ml的HRP標記的羊抗鼠IgG 二抗，用點陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測線的上方，距離大于5毫米)，作為控制線。(3)膠體金標記伐地那非抗體
將伐地那非抗體逐滴加入膠體金溶液(pH=8. 2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1% PEG加入上述溶液中，繼續攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% BSA溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標記的伐地那非抗體溶液。(4)膠體金檢測卡的組裝
將膠體金標記的伐地那非抗體點噴于膠金墊上(1.O微克/毫升)，將樣品墊、膠金墊，點陣了檢測線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進行組裝，切成試紙條，裝入檢測卡中待用。(5)樣品的檢測
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有伐地那非且超過膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區域不顯色，而控制線區域顯色；若樣品中不含有伐地那非且低于膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區域顯色，控制線區域也顯色。若控制線區域不顯色，表明試紙條失效。
實施例5伐地那非抗原模擬表位的大量制備
(I)以曬菌體擴增的方式
將展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體加入至20 ml接種有ER 2738的培養物中，37度220 rpm振蕩培養4. 5 h。將培養物轉入另一離心管中，4 V 10000 rpm離心10 min，將上清的上部80 %轉入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4 °C下靜置120min。4°C 10000 rpm離心PEG/NaCL靜置溶液15 min。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入ImL TBS進行重懸，即為噬菌體擴增液。(2)以伐地那非抗原模擬表位-融合蛋白的方式進行制備A. PCR擴增伐地那非抗原模擬表位的外源編碼基因
PCR反應體系(50 μ
10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)5 M-L
dNTP Mixture (each for 2. 5 mM)4 M-L
M13KE insert extension primer (10 mM)I M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)I M-L
噬菌體DNA模板I μ
Pyrobest DNA Polymerase0. 5 M-L
滅菌 ddH2037. 5 μ PCR反應條件
95 0C5 min接著 95 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 40sec,72°C 10 min 共 30 cycles。采用PCR產物回收試劑盒純化PCR產物，微量核酸定量儀定量。伐地那非抗原模擬表位的編碼基因序列為AAG TTT CCG TCG CAT CCT TAT0B.外源編碼基因及表達載體的雙酶切
分別采用ACC65I和Eag I酶對外源編碼基因和表達載體(pMAl-pIII，NEB公司，可表達MBP融合蛋白)進行雙酶切。C.酶切后產物的連接及轉化
將質粒pMal-ΡΙΙΙ和目的片段以1: 10(摩爾比)混勻，于16 °C水浴連接12 h,取10 μ L連接產物加至100 μ L感受態細胞TBl中，充分混勻。冰浴30 min后，42 V水浴熱激90 S，立即冰浴5 min后補加600 μ L LB液體培養液，37 °C, 200 rpm培養I h，10000rpm離心2 min,吸去上清留取約200 μ L,涂布于LB-A固體(Ampr)培養基中，37 °C過夜培養，得到陽性克隆。伐地那非抗原模擬表位-MBP融合蛋白的表達
將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 mL LB-A，0. 2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振蕩培養過夜，將過夜培養物按I %接種量(v/v)接種于50 mL的LB_A，0. 2 %蔗糖培養基中，分別接種3瓶，37°C，220 r/min振蕩培養，當培養物細菌濃度0D600達到O. 6時，向三瓶培養物中加入IPTG至終濃度為O. 2 mmol/L,220 r/min振蕩培養，將誘導物(PEG溶液)于4 0C, 4000 g，離心20 min收集菌體沉淀，棄上清。重懸細胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g細胞濕重)，加入EDTA至I mM，室溫下震蕩5-10min,8000 g,4°C,離心20 min,棄上清,沉淀重懸于400 ml預冷的5 mM MgS04,冰上震蕩10min,8000 g,4°C,離心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL I M Tris-HCl, pH 7. 4,獲得伐地那非抗原模擬表位-MBP融合蛋白。SEQUENCE LISTING
<110>南昌大學
〈120〉伐地那非的抗原模擬表位及其應用
〈130〉I
〈160〉2
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉9
〈212〉PRT〈213〉人工序列
〈400〉I
Cys Lys Phe Pro Ser His Pro Tyr CysI5
〈210〉2
〈211〉21
〈212〉DNA〈213〉人工序列
〈400〉 2
aagtttccgt cgcatcctta t2權利要求
1.伐地那非的抗原模擬表位，其特征在于氨基酸序列為CKFPSHPYC。
2.編碼權利要求1所述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的核苷酸序列AAGTTT CCG TCG CAT CCT TAT。
4.如權利要求1所述抗原模擬表位的制備方法，其特征在于通過噬菌體擴增、化學合成或基因工程重組表達的方式進行大量制備；所述噬菌體擴增是指將展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產展示有伐地那非抗原模擬表位的噬菌體粒子；所述化學合成指依據模擬表位模擬表位氨基酸序列，通過化學合成多肽的方式進行多肽合成；所述基因工程重組表達的方式是指將編碼模擬表位的基因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行伐地那非抗原模擬表位的大量制備。
5.權利要求1所述抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。
6.如權利要求5所述應用，其特征在于伐地那非抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。
7.如如權利要求5所述應用，其特征在于伐地那非抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及伐地那非的抗原模擬表位，其氨基酸序列為CKFPSHPYC。本發明伐地那非抗原模擬表位可以替換價格昂貴的伐地那非標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于伐地那非的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然伐地那非分子相似的免疫反應特性，效果非常好，減少了伐地那非對人體健康的危害，節約了成本，具有很高的應用價值。
文檔編號G01N33/68GK103044526SQ20121056137
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月21日 優先權日2012年12月21日
發明者何慶華, 許楊, 劉星 申請人:南昌大學