基于親水作用機理富集糖肽的酰胺型整體柱及制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種糖肽富集專用的酰胺型整體柱的制備和應用。所述的整體柱采用帶有酰胺功能基團的單體和交聯劑，加入適當比例的致孔劑和引發劑，通過快速光聚的方法在紫外透明石英毛細管中制備的整體柱。該類整體柱具有制作簡單快速、結構穩定均一、親水性較好、酰胺功能基團多等優點，本發明的整體柱可以實現對微量生物樣品中糖肽的基于親水作用機理的柱上富集。在生物樣品糖蛋白預處理和在線糖蛋白分析平臺的構建方面具有很好的實用價值和應用前景。
【專利說明】基于親水作用機理富集糖肽的酰胺型整體柱及制備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及糖肽富集裝置，即一種基于親水作用機理富集糖肽的酰胺型整體柱及其制備和在生物樣品糖蛋白預處理技術中的應用。
【背景技術】
[0002]在蛋白質組學的研究領域中，蛋白質的組成和結構對其功能的影響一直受到人們的關注，尤其是對于翻譯后修飾的蛋白來說，不同的修飾位點和修飾基團對蛋白的功能產生巨大的影響，但是因其本身低豐度和高復雜程度的特點而成為蛋白質組學中的研究熱點和難點。
[0003]糖蛋白是一類具有重要生物學意義的蛋白，在細胞運輸、信號傳導、免疫調節、生物應激性等生物過程中都有著不可或缺的作用，并且還是一些疾病的生物標志物和臨床治療靶標。作為糖蛋白研究中的一項重要技術，采用質譜對糖蛋白的糖基化位點信息和糖鏈結構的解析使得人們對糖蛋白的結構和功能探索有了進一步的認識。但是糖蛋白豐度較低，酶解后產生的糖肽占總肽段的比例小，在質譜鑒定過程中糖肽信息容易被其他肽段信息所掩蓋，因此在樣品預處理過程中，必須要對糖蛋白和糖肽進行有效地富集。
[0004]目前常用的糖肽富集方法包括了酰肼氧化法、硼酸功能化材料富集和親水作用色譜。其中親水作用色譜主要是利用糖鏈部分所帶來的糖肽與非糖肽在親水性上的差異，從而實現糖肽的選擇性富集，此方法的特點是可以在不破壞糖肽本身結構的基礎上，對各種具有不同類型糖鏈的糖肽進行普適性的富集，同時操作條件溫和，且與后續液相-質譜聯用系統兼容。近年來，很多課題組都發展了不同類型的基于親水作用色譜的材料，包括商品化瓊脂糖凝膠顆粒、親水型聚合物微球、和表面親水修飾磁球等(S e I man，M.H.，McDonnell,L.A.，Palmbladj Μ.，Ruhaakj L.R.，Deelderj A.Μ.，Wuhrerj Μ.，Anal.Chem.20 10, 82，1073 - 1081.Yuj L.Li, X.Guoj Ζ.Zhang, X.Liang, X.Chem.Eur.J.2009，15，12618-12626 ;Yeh，C.H.Chen, S.Η.Li, D.Τ.Linj H.P.Huang, H.J.Chang, C.1.Shihj W.L Chernj C.L Shij F.K.Hsuj J.L J.Chromatogr.A2012，1224，70-78 ；)，這些材料的合成過程或操作流程相對來說比較繁瑣，同時離線操作進行糖肽的富集會帶來不可避免的樣品損失和時間消耗。進而，研究人員利用不同的材料發展了很多糖肽富集的裝置來克服上述問題，包括商品化的填充柱、開管柱和固相微萃取裝置(SPE tips)等(Lam，M.P.，Siuj S.0.，Lauj E.，Maoj X.，Sun，H.Z.，Chiu, P.C.，Yeungj W.S.，Coxj D.M.，Chuj 1.K.，Anal.Bioanal.Chem.2010，398，791-804 ；Luo, Q.，Rejtarj T.，Wuj S.L，Kargerj B.L，J.Chromatogr.A.2009，1216，1223 - 1231 ;Zhu，J.Wang, F.Chen, R.Cheng, K.Xuj B.Guoj Z.Liang, X.Yej M.Zouj H.，Anal.Chem.2012，84，5146-5153)。
【發明內容】
[0005]針對目前研究存在的問題，本發明的目的在于發展一種快速制備的糖肽富集專用的酰胺型整體柱，通過親水作用機理實現對糖肽良好的選擇性富集，能夠實現柱上操作，減少樣品的損失和實驗時間。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0007]以N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酰胺為單體，N, N’ -亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，在適當比例的致孔劑的條件下和適當溶劑體系中，通過光照聚合的方式在紫外透明石英毛細管中形成整體材料，從而快速制備得到一種基于親水作用機理富集糖肽的酰胺型整體柱。
[0008]所述酰胺型整體柱制備的具體步驟如下:
[0009]I)將摩爾比0.5:1-1.5:1的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和丙烯酰胺(AM)作為單體，加入摩爾量為單體量的50%-200%的N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)作為交聯劑，同時加入質量比0.5:1-2:1的致孔劑1，4-丁二醇和十二醇，混合溶液中交聯劑和致孔劑的質量比為1:5-1:10，以及引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)，其加入量為單體和交聯劑總質量的0.5%_2%，混合均勻后，再將二甲基亞砜加入到上述溶液中，使其體積分數為30%-70%，振蕩至澄清，通入30秒至90秒的N2 ；
[0010]2)將混合溶液通入透光毛細管中，紫外光照射條件下，反應5-20分鐘；
[0011 ] 3)反應結束后用乙腈(ACN)清洗毛細管內的柱體，即可獲得酰胺型整體柱。
[0012]制得的酰胺型整體柱可以用于糖肽親水機理選擇性富集，其技術方法的具體步驟如下:
[0013]I)稱取Img的蛋白樣品，經過變性、還原烷基化和酶解之后，溶于lmL85%-75%ACN(含0.1%FA)溶液中；
[0014]2)截取IOcm酰胺型整體柱，將2 μ L上述lmg/mL蛋白酶解產物，用85%_75%ACN(含 0.1%FA)以 0.25-2 μ L/min 的流速上樣，沖洗 10_30min ；
[0015]3)采用70%_50%ACN (含0.1%FA)的溶液對糖肽進行洗脫，收集洗脫下來的富集產物，直接進行質譜分析。
[0016]本發明具有如下優點:
[0017]1.本發明中的酰胺型整體柱，制備簡單快速，結構穩定均一，通透性好，同時具有良好的親水性和與液質聯用系統的兼容性。
[0018]2.本發明使用的兩種單體和交聯劑的親水性都比較好，酰胺基團同時存在于所采用的單體和交聯劑中，保證了制備的整體柱上能夠有足夠的酰胺功能基團用于糖肽的親水機理富集，提高了其選擇性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為酰胺型整體柱制備流程圖。
[0020]圖2為整體柱的掃描電鏡表征圖，a和b的放大倍數分別為1000和5000倍。
[0021]圖3-1為酰胺型整體柱對2 μ g人血清免疫球蛋白(IgG)中糖肽富集效果圖，a和b分別為原樣和富集產物。
[0022]圖3-2為圖3-1中富集產物在質荷比為2500-3500范圍內的放大圖。
[0023]圖4-1為酰胺型整體柱對糖蛋白(人血清免疫球蛋白，IgG)和非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)的混合溶液中(質量比為1:1)糖肽的富集效果圖，a和b分別為原樣和富集產物。
[0024]圖4-2為圖4-1中富集產物在質荷比為2500-3500范圍內的放大圖。[0025]圖5-1為酰胺型整體柱對糖蛋白(人血清免疫球蛋白，IgG)和非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)的混合溶液中(質量比為1:100000)糖肽的富集效果圖，a和b分別為原樣和富集產物。
[0026]圖5-2為圖5-1中富集產物在質荷比為2500-3500范圍內的放大圖。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]1.酰胺型整體柱的制備
[0029]如圖1所示，稱取11.5mg丙烯酰胺、22.2mg N-乙烯基吡咯烷酮和56mgN，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺，加入420 μ L 二甲基亞砜，振蕩溶解至澄清后，再加入0.9mg偶氮二異丁腈，混合至澄清；加入0.15gl, 4- 丁二醇和0.3g十二醇，混合均勻之后，通入N230秒除去溶液中的O2，將該溶液灌入到12cm長的紫外透明石英毛細管中，兩端用硅膠封口。在365nm紫外光照射下，反應15min。取出毛細管，通入乙腈Ih左右，除去未反應的物質，從而制得酰胺型整體柱。
[0030]2.整體柱材料內部表征
[0031]掃描電鏡圖如圖2所示，制備的整體柱結構穩定均一，整體材料貼壁緊密，從放大后的圖中能夠觀察到多級孔結構的存在。
[0032]實施例2
[0033]1.標準蛋白樣品預處理
[0034]稱取Img人血清免疫球蛋白(IgG)溶于lmL20mM碳酸氫銨溶液中，90°C下加熱反應1011^11，冷卻至室溫后，再加入41^現二硫蘇糖醇溶液(用20mM碳酸氫銨溶液配制)，在56°C下加熱反應1.5h ;冷卻至室溫后，加入8 μ LlM碘乙酰胺溶液(用20mM碳酸氫銨溶液配制)，在室溫下避光反應40min。反應結束后,加入40 μ Llmg/mL的胰蛋白酶溶液(用20mM碳酸氫銨溶液配制)，37°C下加熱反應20h，之后加入適量甲酸(FA)使溶液的pH在2-3左右以終止反應，最后得到lmg/mL標準蛋白酶解產物。
[0035]采用C18預柱對上述酶解產物進行除鹽、凍干，最后將樣品溶解在lmL80%ACN (含
0.1%FA)中。
[0036]2.糖肽的柱上富集
[0037]截取IOcm酰胺型整體柱，將2 μ L上述lmg/mL標準蛋白酶解產物，用80%ACN (含
0.1%FA)以I μ L/min的流速上樣，沖洗20min，然后采用70%ACN (含0.1%FA)的條件對糖肽進行洗脫lOmin，收集洗脫下來的富集產物，直接進行質譜分析。
[0038]3.MALD1-TOF MS (基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜)分析
[0039]將IyL富集產物與lyL2，5-二羥基苯甲酸(DHB)基質(20mg/mL DHB溶于含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液)依次點于MALDI靶板上，待樣品點干燥后進行質譜鑒定。MALD1-TOF MS 實驗是在 Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)上進行，檢測時采用線性反射正離子模式。如圖3-lb所示，IgG中的糖肽信號強度較原液(圖 3-la)顯著提高，通過對比文獻(Yu, L.Li, X.Guo, Z.Zhang, X.Liang, X.Chem.Eur.J.2009, 15，12618-12626)，經酰胺型整體柱富集之后，一共得到信噪比大于3的糖肽18條(圖3-2)，且大部分非糖肽都得到了去除，表明材料具有較好的糖肽富集能力和選擇性。[0040]實施例3
[0041]1.BSA酶解產物干擾下的糖肽選擇性富集
[0042]將制備好的lmg/mL IgG和BSA酶解產物(溶于含0.1%FA的80%ACN中)按質量比1:1和1:100000混合，截取IOcm酰胺型整體柱，上樣2 μ L上述標準蛋白酶解產物的混合溶液，用80%ACN (含0.1%FA)沖洗30min，然后采用70%ACN (含0.1%FA)的條件對糖肽進行洗脫lOmin，收集洗脫下來的富集產物，直接進行MALD1-TOF MS分析。
[0043]2.MALD1-TOF MS 分析
[0044]將I μ L富集產物與I μ LDHB基質(20mg/mL DHB溶于含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液)依次點于MALDI祀板上,待樣品點干燥后進行質譜鑒定。如圖4-1、4-2和圖5_1、5-2所示，質量比為1:1的混合樣品經酰胺型整體柱富集之后，該整體材料能夠選擇性的富集到IgG中的10條糖肽(圖4-2)，同時排除了大部分BSA酶解肽段的干擾。進一步增大干擾比例到1:100000，仍能夠選擇性的富集到IgG中的6條糖肽(圖5-2)，證明了該整體柱良好的抗干擾能力和在實際樣品中應用價值。
[0045]該類整體柱具有制作簡單快速、結構穩定均一、親水性較好、酰胺功能基團多等優點，本發明的整體柱可以實現對微量糖蛋白樣品中糖肽的基于親水作用機理的柱上富集。在糖蛋白樣品預處理和在線糖蛋白分析平臺的構建方面具有很好的實用價值和應用前景。
【權利要求】
1.基于親水作用機理富集糖肽的酰胺型整體柱，其特征在于:采用具有酰胺功能基團的單體和交聯劑，加入致孔劑和引發劑，通過光引發聚合的方法在紫外透明石英毛細管中制備結構均一且穩定的整體柱，所帶有的酰胺基團具有良好的親水性。
2.按照權利要求1所述的整體柱，其特征在于:所述的紫外透明石英毛細管為50-150 μ m內徑的紫外透明石英毛細管。
3.—種權利要求1所述酰胺型整體柱的制備方法，其特征在于:將聚合物混合溶液均勻引入紫外透明毛細管中，通過原位光引發聚合的方式，在毛細管中形成具有中空多孔結構的整體材料； 具體步驟為: 1)將單體、交聯劑、致孔劑和引發劑的混合溶液加入到溶劑體系中，振蕩混勻，混合液通入30秒至90秒的N2 ； 所述單體為摩爾比0.5:1-1.5:1的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和丙烯酰胺(AM)，所述交聯劑為N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)，混合溶液中單體和交聯劑的摩爾比為0.5:1-2:1 ;所述溶劑體系為二甲基亞砜，在反應溶液中所占體積為混合液總體積的30%-70% ； 2)將混合液通入紫外透明毛細管中，紫外光照射條件下，反應5-20分鐘； 3)反應結束后用乙腈(ACN)清洗毛細管內的柱體，即可獲得酰胺型整體柱。
4.按照權利要求3所述制備方法，其特征在于:所述引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)，其加入量為單體和交聯劑總質量的0.5%-2%。
5.按照權利要求3所述制備方法，其特征在于:所述致孔劑為1，4-丁二醇和十二醇，兩者之間的質量比為0.5:1-2:1，混合溶液中交聯劑和致孔劑的質量比為1:5-1:10。
6.一種權利要求1所述酰胺型整體柱的應用,酰胺型整體柱用于生物樣品中糖肽的富集。
【文檔編號】G01N1/40GK103877955SQ201210560167
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2012年12月20日
【發明者】張麗華, 蔣好, 袁輝明, 梁玉, 楊開廣, 張玉奎 申請人:中國科學院大連化學物理研究所