專利名稱：基于石墨烯-貴金屬復合材料的電化學dna傳感器及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種電化學DNA生物傳感器及其所用電極材料的制備方法，屬于電化學和材料合成技術領域。
背景技術：
生物傳感器是目前發展最為迅速并被認為最有產業化前景的一種檢測器件。它具有高專一性、短時低費用分析、對分析物質沒有特殊的要求、操作安全、便于現場測定等優點。從1962年Clark和Lyons最先提出生物傳感器的設想至今，其在近幾十年獲得蓬勃而迅速的發展。在國民經濟的各個部門如食品、制藥、化工、臨床檢驗、生物醫學、環境監測等方面得到廣泛應用。隨著分子生物學研究的深入，對脫氧核糖核酸DNA的檢測手段變得越來越重要。傳統的凝膠電泳法需要經過放射性標記、聚合酶鏈式反應(PCR)、電泳等一系列操作過程，消耗時間長，勞動強度大。在這種情況下，以Watson-Crick堿基配對為基礎的DNA傳感器應運而生。DNA傳感器以DNA為敏感元件，DNA固定在用作換能器的電極上，并通過電極將DNA與DNA、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)、藥物、化合物、自由基等相互作用的生物學信號轉變成可檢測的光、電、聲波等物理信號。用DNA傳感器不僅省去了放射性標記的危險性，而且扣除了電泳操作的長時間浪費，因此近幾年來受到了全世界科技工作者的廣泛重視。除了 DNA檢測外，DNA傳感器還在環境監測、藥物研究、法醫鑒定及食品檢驗等多方面顯示了誘人的應用前景。在電化學DNA傳感器領域，電極材料對于電化學生物傳感器的性能表現至關重要。目前電化學DNA傳感器使用的主要是負載納米貴金屬的玻碳電極。誠然，納米貴金屬具有較高的電催化性能，但是納米材料的最大的缺點是因為顆粒較小，不能在電極上像微米級材料那樣緊密堆積，導致電流密度較少，因此傳感器的靈敏度和特異性較差。石墨烯(Graphene),是一種由碳原子以Sp2雜化軌道組成的六角型呈蜂巢晶格、只有一個碳原子厚度的二維材料。石墨烯特殊的結構使得石墨烯具有一系列優良的性質，它的理論比表面積高達2600m2/g，具有突出的導熱性能和力學性能以及室溫下高速的電子遷移率。石墨烯還具有完美的量子隧道效應、半整數的量子霍爾效應等一系列性質。石墨烯這些獨特的力學、電學、電化學以及場發射性能，使得它在導電材料、催化材料、儲能材料和納米電子元器件中具有重要的潛在應用價值。基于化學還原氧化石墨烯的DNA傳感器，不僅能同時檢測GATC四種堿基對(石墨電極和玻碳電極都不能),而且還能從單鏈(ssDNA)或雙鏈DNA中分離出四組堿基對；石墨烯修飾免疫電極發現可以用于檢測卵巢癌SK0V-3細胞。鑒于石墨烯作電極材料用于生物傳感器的優異特性，本發明將石墨烯-貴金屬復合材料引入DNA傳感器領域，大大提高DNA傳感器的特異性和靈敏度，以此復合材料構建的DNA生物傳感器，實現對目的基因，例如轉基因食品中花椰菜花葉病毒35s啟動子等的檢測。
發明內容
本發明目的在于克服納米貴金屬直接用作DNA傳感器電極材料時電流密度小的缺陷，制備具有高靈敏度和高選擇性的電化學DNA傳感器。本發明提供了一種高負載量納米貴金屬/石墨烯復合材料及其制備方法，其具體的特征為3. 5nm貴金屬粒子負載于約2-5 μ m的單層石墨烯上，構成貴金屬/石墨烯復合材料；然后黏附于玻碳電極上制備成修飾電極；將花椰菜花葉病毒35s啟動子5’ GCTCCTACAAATGCCATCA3’固載到電極上，然后與目的基因雜交制備成電化學DNA生物傳感器，實現對轉基因食品的檢測。一種基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器，包括電極和固載于電極上的單鏈DNA，所述電極上黏附有復合材料層，復合材料層為3. 5nm貴金屬粒子負載于2-5 μ m的單層石墨烯上構成。本發明所述電化學DNA生物傳感器的制備步驟如下( I)氧化石墨烯的制備利用Hummer法制備氧化石墨烯室溫下，在濃硫酸中攪拌石墨，并且加入硝酸鈉，一段時間后，加入高錳酸鉀，攪拌，綠色的懸浮液冷卻至室溫，繼續攪拌，然后將冰水倒入溶液中，最后加入過量的過氧化氫(3%)并且將混合液攪拌整晚，過濾，透析袋透析，超聲，最后得到氧化石墨烯。(2)貴金屬/氧化石墨烯材料的制備與表征將一定量的貴金屬前驅體溶液(氯鉬酸鉀、氯金酸、氯鈀酸等)加入氧化石墨烯溶液中，加入還原劑，控制反應條件，例如溫度、微波、超聲等，制備高負載量、高分散度M/G0(M=Au, Pt, Pd)。(3)電極的修飾將M/G0材料黏附在玻碳電極表面，然后將單鏈DNA溶液I滴加到電極表面，室溫下自然晾干，然后Tris-HCl緩沖溶液反復清洗電極。(4)電化學DNA生物傳感器的制備將單鏈DNA修飾電極浸入含目的基因的雜交液中，置于恒溫培養箱雜交反應后，取出電極，清洗，雜交前后的電極作工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為輔助電極，置于含[Co (phen)3]3+的Tris-HCl和NaCl緩沖液中浸泡并加一定的電壓，用雙蒸水沖洗電極，然后將電極浸入Tris-HCl和NaCl緩沖液中進行方波伏安法檢測，記錄雜交前后[Co (phen)3]3+的還原峰電流值，根據電流值的變化測定DNA含量。步驟(2)所述的貴金屬前驅體是指含鉬、鈀或金的化合物。如氯鈀酸鉀、氯鉬酸或
氯金酸等。步驟(2)所述的還原劑是指硼氫化鈉、L-抗壞血酸酯或檸檬酸。步驟(2)的反應溫度為10_90°C。步驟(3)所述的單鏈DNA包括花椰菜花葉病毒35s啟動子或NOS終止子的特異性單鏈DNA。
具體實施例方式
實施例(一)在500mL容器中依次加入25g的濃硫酸、2. 4g過硫酸鉀、2. 5g五氧化二磷，攪拌，在水浴下慢慢升溫至80°C，加入5. Og石墨，攪拌10小時，自然冷卻至常溫，抽濾后，干燥，得到預氧化石墨。在燒瓶中加入2. 5g預氧化石墨、1. 3g亞硝酸鈉、105g濃硫酸，冰浴下攪拌，緩慢加入7. 5g高錳酸鉀，控制溫度在0-5°C反應I個小時，然后改用35°C水浴加熱，保溫反應8小時，撤去水浴并用滴管滴加蒸餾水(T〈98°C )，水浴加熱升溫至96°C，保溫反應30分鐘，在溫度降為50-60°C時向瓶中加入7. 4g5%鹽酸和5mL30%雙氧水，用蒸餾水洗滌至中性，超聲剝離、透析，干燥，得到氧化石墨烯。稱取20mg氧化石墨烯于20mL水中，然后加入氯鈕酸鉀8mg,超聲分散30min,升溫至20°C，然后緩慢滴加L-抗壞血酸酯溶液，反應Ia后，離心，乙醇洗滌，干燥，得到Pd/G復合材料，經透射電子顯微鏡觀察(TEM)發現，Pd粒子大小為3. 5nm，石墨烯大小為3μπι.將Pd/G材料黏附在玻碳電極表面，然后將單鏈花椰菜花葉病毒35s啟動子溶液I滴加到電極表面，室溫下自然晾干，然后Tris-HCl緩沖溶液反復清洗電極。將單鏈DNA修飾電極浸入目的基因的雜交液中，置于恒溫培養箱雜交反應后，取出電極，清洗，雜交前后的電極作工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為輔助電極，置于含O.1mmol/L[Co (phen)3]3+ 的 5mmol/LTris-HCl 和 5mmol/L NaCl 緩沖液(pH=7. 5)中浸泡并加 O. 5V電壓，用雙蒸水沖洗電極，除掉未結合的[Co (phen)3]3+,然后將電極浸入5mmol/LTris_HCl和5mmol/L NaCl緩沖液中進行方波伏安法檢測，記錄雜交前后[Co (phen) 3]3+的還原峰電流值，根據電流值的變化測定 DNA含量，檢測信號和DNA濃度呈線性關系，檢出限達到
2.5*I(TicW)I/L。實施例(二)在500mL容器中依次加入25g的濃硫酸、2. 4g過硫酸鉀、2. 5g五氧化二磷,攪拌，在水浴下慢慢升溫至80°C，加入5. Og石墨，攪拌10小時，自然冷卻至常溫，抽濾后，干燥，得到預氧化石墨。在燒瓶中加入2. 5g預氧化石墨、1. 3g亞硝酸鈉、105g濃硫酸，冰浴下攪拌，緩慢加入7. 5g高錳酸鉀，控制溫度在0-5°C反應I個小時，然后改用35°C水浴加熱，保溫反應8小時，撤去水浴并用滴管滴加蒸餾水(T〈98°C )，水浴加熱升溫至96°C，保溫反應30分鐘，在溫度降為50-60°C時向瓶中加入7. 4g5%鹽酸和5mL30%雙氧水，用蒸餾水洗滌至中性，超聲剝離、透析，干燥，得到氧化石墨烯。稱取20mg氧化石墨烯于20mL水中，然后加入氯鉬酸鉀IOmg,超聲分散30min，升溫至30°C，然后緩慢滴加硼氫化鈉溶液，反應12h后，離心，乙醇洗滌，干燥，得到Pd/G復合材料，經透射電子顯微鏡觀察(TEM)發現，Pt粒子大小為2nm，石墨烯大小為3 μ m.將Pt/G材料黏附在玻碳電極表面，然后將單鏈花椰菜花葉病毒35s啟動子溶液I滴加到電極表面，室溫下自然晾干，然后Tris-HCl緩沖溶液反復清洗電極。將單鏈DNA修飾電極浸入目的基因的雜交液中，置于恒溫培養箱雜交反應后，取出電極，清洗，雜交前后的電極作工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為輔助電極，置于含O.1mmol/L[Co (phen)3]3+ 的 5mmol/LTris-HCl 和 5mmol/L NaCl 緩沖液(pH=7. 5)中浸泡并加 O. 5V電壓，用雙蒸水沖洗電極，除掉未結合的[Co (phen)3]3+，然后將電極浸入5mmol/LTris_HCl和5mmol/L NaCl緩沖液中進行方波伏安法檢測，記錄雜交前后[Co (phen) 3]3+的還原峰電流值，根據電流值的變化測定DNA含量，檢測信號和DNA濃度呈線性關系，檢出限達到1.2*I(TicW)I/L。實施例(三)
在500mL容器中依次加入25g的濃硫酸、2. 4g過硫酸鉀、2. 5g五氧化二磷，攪拌，在水浴下慢慢升溫至80°C，加入5. Og石墨，攪拌10小時，自然冷卻至常溫，抽濾后，干燥，得到預氧化石墨。在燒瓶中加入2. 5g預氧化石墨、1. 3g亞硝酸鈉、105g濃硫酸，冰浴下攪拌，緩慢加入7. 5g高錳酸鉀，控制溫度在0-5°C反應I個小時，然后改用35°C水浴加熱，保溫反應8小時，撤去水浴并用滴管滴加蒸餾水(T〈98°C )，水浴加熱升溫至96°C，保溫反應30分鐘，在溫度降為50-60°C時向瓶中加入7. 4g5%鹽酸和5mL30%雙氧水，用蒸餾水洗滌至中性，超聲剝離、透析，干燥，得到氧化石墨烯。稱取20mg氧化石墨烯于20mL水中，然后加入氯金酸12mg,超聲分散30min,升溫至80°C，然后緩慢滴加檸檬酸溶液，反應12h后，離心，乙醇洗滌，干燥，得到Au/G復合材料，經透射電子顯微鏡觀察(TEM)發現，Au粒子大小為10nm，石墨烯大小為3μπι.將Au/G材料黏附在玻碳電極表面，然后將單鏈花椰菜花葉病毒NOS終止子溶液I滴加到電極表面，室溫下自然晾干，然后Tris-HCl緩沖溶液反復清洗電極。將單鏈DNA修飾電極浸入目的基因的雜交液中，置于恒溫培養箱雜交反應后，取出電極，清洗，雜交前后的電極作工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為輔助電極，置于含O.1mmol/L[Co (phen)3]3+ 的 5mmol/LTris-HCl 和 5mmol/L NaCl 緩沖液(pH=7. 5)中浸泡并加 O. 5V電壓，用雙蒸水沖洗電極，除掉未結合的[Co (phen)3]3+,然后將電極浸入5mmol/LTris_HCl和5mmol/L NaCl緩沖液中進行方波伏 安法檢測，記錄雜交前后[Co (phen) 3]3+的還原峰電流值，根據電流值的變化測定DNA含量，檢測信號和DNA濃度呈線性關系，檢出限達到8. 9*I(TicW)I/L。
權利要求
1.一種基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于步驟如下Cl)制備氧化石墨烯用Hummer法從石墨粉制備氧化石墨烯水分散液；(2)制備納米貴金屬/石墨烯復合材料將一定量的貴金屬前驅體溶液加入氧化石墨烯溶液中，加入還原劑，一定溫度下水熱反應制備高負載量、高分散度納米復合材料；(3)制備單鏈DNA修飾電極將納米貴金屬材料黏附在玻碳電極表面，然后用單鏈DNA修飾；(4)電化學DNA生物傳感器的制備將單鏈DNA修飾電極浸入含目的基因的雜交液中，雜交后取出電極，清洗。
2.根據權利要求1所述基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的貴金屬前驅體是指含鉬、鈀或金的化合物。
3.根據權利要求2所述基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述的貴金屬前驅體是氯鈀酸鉀、氯鉬酸或氯金酸。
4.根據權利要求1所述基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的還原劑是指硼氫化鈉、L-抗壞血酸酯或檸檬酸。
5.根據權利要求1所述的一種基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)的反應溫度為10-90°C。
6.根據權利要求1所述的一種基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的單鏈DNA包括花椰菜花葉病毒35s啟動子或NOS終止子的特異性單鏈DNA。
7.一種基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器，包括電極和固載于電極上的單鏈DNA，其特征在于，所述電極上黏附有復合材料層，復合材料層為3. 5nm貴金屬粒子負載于2-5 μ m的單層石墨烯上構成。
全文摘要
本發明涉及一種基于石墨烯-納米貴金屬復合材料的電化學DNA生物傳感器及其制備方法，該方法包括(1)用Hummer法從石墨粉制備氧化石墨烯水分散液。(2)化學還原法制備納米貴金屬粒子/石墨烯復合材料。(3)將貴金屬/石墨烯復合材料黏附到玻碳電極上，用單鏈DNA修飾，修飾電極和目的基因雜交，制備得到電化學DNA傳感器。該傳感器能大幅提高DNA的檢出限至1.2*10-10mol/L。
文檔編號G01N27/327GK103033544SQ201210543668
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者秦勇, 儲富強, 陶永新, 孔泳, 黎珊 申請人:常州大學