專利名稱：一種家兔抗苦馬豆素抗體的elisa檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫學技術領域，涉及一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法及試劑盒。
背景技術：
瘋草(Iocoweed)是豆科(Leguminosae)棘豆屬(Oxytropis)和黃苗屬(Astragalas)有毒植物的統稱，由此而引起的中毒病稱為瘋草中毒(Locosim)或瘋草病(Locodisease)。我國瘋草主要分布于內蒙古、寧夏、甘肅、陜西、青海、新疆、西藏等省區。分布面積已超過1100萬hm2,約占全國草場總面積的2. 8%,占西部草場面積的3. 3%,且每年以3. 5%的速度蔓延。瘋草已成為我國西南、西北牧區危害草原畜牧業可持續發展的主要毒草。苦馬豆素(Swainsonine, SW)是瘋草的主要毒性成分之一,對瘋草中毒病的發病機理和防治有重要意義。新疆是我國五大草原畜牧業省份之一，天然草地總面積為5596. 16X 104hm2,其中可利用面積4800. 68X 104hm2，是已墾農地的10. 4倍，林地的18倍。然而，由于“超載過牧”等原因，現已引起瘋草等有毒植物的廣泛蔓延，優質牧草嚴重退化，造成大量放牧家畜中毒，其中阿克蘇地區每年中毒家畜在5% 10%，嚴重時可達50%，不利于新疆畜牧業的可持續發展。瘋草屬于豆科植物，除含有瘋草毒素外，還含有豐富的營養物質。其中黃花棘豆的粗蛋白含量高達20%，超過“飼料之王”的苜蓿，小花棘豆粗蛋白、鈣、磷含量及必需氨基酸組成接近于優質苜蓿，將甘肅棘豆的添加量控制在10%以內飼喂家兔，家兔的體質量增加量與棘豆飼喂量成正比，說明瘋草有較好的利用前景。目前多采用免疫學方法使動物獲得抗苦馬豆素抗體，以期在動物采食瘋草時獲得保護。其免疫效果的確定有賴于抗體的準確檢測，ELISA法因具有快速、敏感、準確等優點而得到廣泛應用。本課題組以家兔為試驗動物，通過制備苦馬豆素人工抗原，篩選包被抗原，制備陽性血清和陰性血清，制備HRP-羊抗兔酶標抗體，建立測定方法，從而得到檢測家兔血清抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測試劑盒，為家兔安全利用瘋草提供基礎。而到目前為止，并未有家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測試劑盒的研究報道和專利申請。
發明內容
為了解決上述技術問題，本發明提供一種設備簡單，操作方便的家兔血清抗苦馬豆素抗體檢測方法及試劑盒。通過該方法的實施，達到對家兔免疫效果的快速、敏感、準確的判斷，操作方法簡單易行，適用于科研院所和基層畜牧系統。具體技術方案為一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，間接ELISA法檢測家兔血清抗苦馬豆素抗體，包括以下步驟(I)包被使用抗原包被緩沖液將苦馬豆素人工抗原稀釋到工作濃度，加入96孔酶標板，每孔ΙΟΟμ L，4°C過夜；(2)封閉將孔內抗原液棄去，加入PBST洗滌液，每孔200 μ L，振蕩30s后棄去孔內液體，拍干。PBST洗滌液的配制方法十二水磷酸氫二鈉2. 9g，無水磷酸氫二鉀O. 2g，氯化鈉8. Og,氯化鉀O. 2g，吐溫-200. 5mL,溶解于IOOOmL蒸餾水；重復洗滌3次后，每孔加入20g/L明膠溶液，將酶標板置于37°C培養箱內培養Ih進行封閉；(3)添加待檢血清及陽性、陰性血清棄去孔內明膠溶液,洗滌3次后，向每孔加入100 μ L工作濃度的待檢血清、陽性血清和陰性血清，并以PBS溶液為空白對照，將酶標板置于37 °C培養箱內培養Ih ；(4)添加酶標二抗棄去孔內血清，洗滌3次后，向每孔加入100 μ L工作濃度的HRP-羊抗兔酶標抗體，將酶標板置于37°C培養箱內培養Ih ；(5)添加底物溶液棄去孔內溶液，洗滌3次后，向每孔加入ΙΟΟμ L底物溶液，底物使用四甲基聯苯胺，即ΤΜΒ，配置方法為底物顯色A液無水醋酸鈉13. 6g，檸檬酸1. 6g，30%雙氧水O. 3ml，用蒸餾水定容于500mL ;底物顯色B液乙二胺四乙酸二鈉O. 2g，檸檬酸
O.95g，甘油50mL，0. 15g TMB,3mL DMS0，用蒸餾水定容于500mL，使用時AB液等量混合，將酶標板置于37°C培養箱內培養30min ；(6)終止將酶標板拿出培養箱后，立即向每孔加入2mol/L H2SO4溶液終止反應，立即使用酶標儀測定OD45tl值，以待檢血清OD45tl值⑵和陰性血清OD45tl值(N)的比值(P/N)彡2.1判定樣品為陽性。所述的步驟(I)中，包被抗原選擇為SW-0VA，工作濃度為10μ g/mL，抗原包被緩沖液為PH9. 6的碳酸鹽緩沖液，配置方法為2. 93g碳酸氫鈉和1. 95g碳酸鈉溶解于IOOOmL蒸餾水。所述的步驟(3) 中，血清稀釋度為1: 200，稀釋液選用包被緩沖液。所述的步驟(4)中，酶標二抗稀釋度為1: 1500，稀釋液選用包被緩沖液。所述的步驟(5)中，底物更換為四甲基聯苯胺二鹽酸，即TMB*2Hcl，在底物顯色B液中棄去DMSO。一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測試劑盒，試劑盒中包括已包被完全的96孔酶標板(包被抗原為 ο μ g/mL的SW-0VA)、陽性血清(抗體效價212 214)、陰性血清、HRP-羊抗兔酶標抗體PBS溶液、PBST洗滌液、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液。本發明的有益效果(I)本發明建立了家兔血清抗苦馬豆素抗體檢測方法，優化了檢測條件，所需設備簡單，操作方便。(2)本發明中的陽性血清抗體效價較高，可檢測的范圍較大。(3)本發明中的檢測方法變異系數小于15%，有較好的精密性。(4)本發明中的試劑盒可在4°C保存6個月，有較好的穩定性。
圖1為活性酯的合成反應式；圖2為N-羧甲基苦馬豆素的合成反應式；圖3為SW-OVA的合成反應式；
圖4為SW-BSA的合成反應式。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的方法作進一步詳細地說明。檢測試驗中所需的包被抗原、陽性血清和酶標抗體制備方法如下(I)包被抗原的制備首先將溴乙酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應成活性酯，活性酯再與SW合成為N-羧甲基苦馬豆素，然后與N-羧甲基苦馬豆素與OVA縮合，透析后冷凍干燥即為SW-0VA，其化學反應式如圖1-圖3所示。(2)陽性血清的制備使用苦馬豆素人工抗原SW-BSA免疫家兔，對免疫兔使用弗氏完全佐劑(FAC)進行基礎免疫，IOd后進行首免，使用FAC和生理鹽水的混合液(體積比
I I)充分乳化制備的SW-BSA ;第一次和第二次加強免疫用弗氏不完全佐劑(FAI)和生理鹽水的混合液(體積比1:1)乳化；第三次加強免疫使用生理鹽水溶解SW-BSA，第三次加強免疫IOd后，所有試驗家兔耳緣靜脈采血，分離血清，即得到抗苦馬豆素陽性血清；(3)羊抗兔抗體的制備將家兔抗苦馬豆素血清采用硫酸銨沉淀法制備抗苦馬豆素抗體，通過DEAE純化，流水透析后凍干，即得到家兔抗苦馬豆素抗體，將家兔抗苦馬豆素抗體與FAIl l(m/v)混合，完全乳化后對和田羊進行接種，每IOd免疫一次，免疫劑量分別為5mg、10mg、15mg、20mg、30mg/只，共免疫5次。免疫結束后對和田羊頸靜脈采血，分離血清，硫酸銨沉淀，DEAE純化，流水透析后凍干，即得到羊抗兔抗體；(4)HRP標記羊抗兔抗體的制備使用改良過碘酸鈉法，取HRP 50mg溶于5mL去離子水,加入新配制的0. 06mol/L過碘酸鈉水溶液5mL,于4°C靜置反應30min,取出后加入
0.16mol/L乙二醇水溶液5mL,室溫放置,反應30min,加入上步制備的羊抗兔抗體50mg,混勻后透析過夜，透析液為0. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液,然后加入5mg硼氫化鈉，于4°C靜置反應2h，然后飽和硫酸銨沉淀，沉淀物以0. 02mol/L pH7. 4PBS液溶解后透析過夜，透析液為0. 02mol/LpH7. 4PBS液，次日取出離心，除去不溶物，即得到HRP標記羊抗兔抗體。實施例1使用苦馬豆素人工抗原對家兔進行免疫，通過由以下步驟組成的方法制成1.苦馬豆素人工抗原的制備首先將溴乙酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應成活性酯，活性酯再與SW合成為N-羧甲基苦馬豆素，然后與N-羧甲基苦馬豆素與BSA縮合，透析后冷凍干燥即為SW-BSA，其化學反應式如圖1、圖2、圖4所示。2.苦馬豆素人工抗原免疫家兔將家兔隨機分為陰性對照組(I只)和SW-BSA免疫組出只)，對免疫組使用弗氏完全佐劑(FAC)進行基礎免疫，首免時使用FAC和生理鹽水的混合液(體積比1:1)充分乳化制備的SW-BSA ;第一次和第二次加強免疫用弗氏不完全佐劑(FAI)和生理鹽水的混合液(體積比1:1)乳化；第三次加強免疫使用生理鹽水乳化SW-BSA。免疫組免疫劑量和次數見表I。對照組注射等體積的抗原乳化液。第三次加強免疫IOd后，所有試驗家兔耳緣靜脈采血，分離血清，-20°C保存。表I家兔免疫組的免疫時間和免疫劑量
權利要求
1.一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，間接ELISA法檢測家兔血清抗苦馬豆素抗體，包括以下步驟 (1)包被使用抗原包被緩沖液將苦馬豆素人工抗原稀釋到工作濃度，加入96孔酶標板，每孔100yL，4°C過夜； (2)封閉將孔內抗原液棄去，加入PBST洗滌液，每孔200μ L，振蕩30s后棄去孔內液體，拍干，PBST洗滌液的配制方法十二水磷酸氫二鈉2. 9g，無水磷酸氫二鉀O. 2g,氯化鈉8.Og,氯化鉀O. 2g，吐溫-200. 5mL,溶解于IOOOmL蒸餾水；重復洗滌3次后，每孔加入20g/L明膠溶液，將酶標板置于37°C培養箱內培養Ih進行封閉； (3)添加待檢血清及陽性、陰性血清棄去孔內明膠溶液，洗滌3次后，向每孔加入100 μ L工作濃度的待檢血清、陽性血清和陰性血清，并以PBS溶液為空白對照，將酶標板置于37 °C培養箱內培養Ih; (4)添加酶標二抗棄去孔內血清，洗滌3次后，向每孔加入100μ L工作濃度的HRP-羊抗兔酶標抗體，將酶標板置于37°C培養箱內培養Ih ； (5)添加底物溶液棄去孔內溶液，洗滌3次后，向每孔加入100μ L底物溶液，底物使用四甲基聯苯胺，即ΤΜΒ，配置方法為底物顯色A液無水醋酸鈉13. 6g，檸檬酸1. 6g，30 %雙氧水O. 3ml，用蒸餾水定容于500mL ;底物顯色B液乙二胺四乙酸二鈉O. 2g，檸檬酸O.95g，甘油50mL，0. 15g TMB,3mL DMSO，用蒸餾水定容于500mL，使用時AB液等量混合，將酶標板置于37°C培養箱內培養30min ； (6)終止將酶標板拿出培養箱后，立即向每孔加入2mol/LH2S04溶液終止反應，立即使用酶標儀測定OD45tl值，以待檢血清OD45tl值⑵和陰性血清OD45tl值(N)的比值(P/N)彡2.1判定樣品為陽性。
2.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟⑴中，包被抗原選擇為SW-0VA，工作濃度為10 μ g/mL,抗原包被緩沖液為pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，配置方法為2. 93g碳酸氫鈉和1. 95g碳酸鈉溶解于IOOOmL蒸餾水。
3.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟(3)中，血清稀釋度為1: 200，稀釋液選用包被緩沖液。
4.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟(4)中，酶標二抗稀釋度為1: 1500，稀釋液選用包被緩沖液。
5.根據權利要求1所述的家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的步驟(5)中，底物更換為四甲基聯苯胺二鹽酸，即TMB*2Hcl，在底物顯色B液中棄去DMS0。
6.一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括已包被完全的96孔酶標板(包被抗原為10 μ g/mL的SW-0VA)、陽性血清(抗體效價212 214)、陰性血清、HRP-羊抗兔酶標抗體PBS溶液、PBST洗滌液、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液。
全文摘要
本發明公開了一種家兔抗苦馬豆素抗體的ELISA檢測方法及試劑盒，采用間接ELISA法檢測家兔血清抗苦馬豆素抗體，包括以下步驟(1)包被；(2)封閉；(3)添加待檢血清及陽性、陰性血清；(4)添加酶標二抗；(5)添加底物溶液；(6)終止。通過該方法的實施，達到對家兔免疫效果的快速、敏感、準確的判斷，操作方法簡單易行，適用于科研院所和基層畜牧系統。
文檔編號G01N33/53GK103048444SQ20121052510
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者王帥, 馬春暉, 胡建軍, 席琳喬, 王連群, 陳根元 申請人:塔里木大學