專利名稱：紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法
技術領域：
本發明屬于植物生化檢測技術領域，具體地，涉及一種紫花苜蓿(Medicagosat iva L.)葉黃素循環組分的快速檢測方法。
背景技術：
紫花苜猜(Medicago sativa L.)是我國栽培歷史最久、分布最廣、種植最多的優良豆科牧草。紫花苜蓿具有產量高、品質好、蛋白質含量高、適口性好等特點，被譽為“牧草之王”。同時，它能保持水土、培肥地力、增加飼料，對改善農牧業生態環境、促進畜牧業發展有重要作用。由于種植條件粗放，紫花苜蓿經常受到強光、干旱和土壤貧瘠等逆境的脅迫而發生光抑制甚至光破壞，使其光合效率降低、品質下降。環境脅迫如高溫、干旱、強光和貧瘠等條件下，植物的光合能力下降，積累的過剩光能易導致光破壞，依賴于植物體內的葉黃素循環耗散過剩激發能，是光合器官在自然條件下免遭光破壞的重要途徑之一。葉黃素循環組分由玉米黃質(Z)、環氧玉米黃質(A)和紫黃質(V)構成。當光合器官吸收的光能不能全部被光合作用利用時，V在紫黃素脫環氧化酶催化下。經中間體A脫環氧生成Z，在沒有過剩光能條件下，Z在環氧化酶催化下經中間體A加環氧生成V。且Z隨著過剩光能的增加而增加，并直接參與熱耗散而將多余的激發能猝滅，起到光保護作用。因此，建立紫花苜蓿葉黃素循環組分的測定方法是十分必要的。目前對植物葉黃素循環組分的測定大多數采用的是Spherisorb C18色譜柱柱，使用的流動相是Tris-HCL緩沖液、甲醇和乙酸乙酯。該流動相要么形成不溶于水的晶體沉淀而堵塞管路系統，導致柱壓急劇升高，大大縮短了柱的有效使用壽命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要經常洗脫，不僅費時費力，且經常使得被測組分的峰形被破壞。所以建立對色譜柱無傷害、靈敏準確的紫花苜蓿葉黃素組分循環測定方法具有十分重要的作用。發明目的針對現有技術存在的上述不足，本發明旨在提供一種紫花苜蓿葉黃素循環組分的快速檢測技術，采用價格較Spherisorb C18相對便宜的Hypersil ODS色譜柱,采用對色譜柱無傷害的常用試劑乙腈作為流動相，為紫花苜蓿葉黃素循環組分的快速、準確檢測提供了節約人力、物力和財力的方法。從色素的提取到檢測全過程只需I小時即可完成，該方法快速、靈敏、準確。本發明的上述目的是通過下述的技術方案加以實現的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，取紫花苜蓿鮮葉O.1g,倒入液氮研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min,再加入100%丙酮，勻漿I min之后置于冰上15 min,1200g離心10 min，取上清液用0.45 Mm微孔濾膜過濾后進樣到高效液相色譜儀采用濃度線性梯度洗脫，從而檢測紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質(Z)、環氧玉米黃質(A)和紫黃質(V)的含量。所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述高效液相色譜儀使用美國Agilent 1100高效液相色譜儀,色譜柱使用美國Agilent Hypersil ODS的4. O X 250 mm, 5Mm色譜柱。所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述濃度線性梯度洗脫，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，濃度線性梯度洗脫程序為90% A液+ 10% B液洗脫15min，接著在5min內，90% A液濃度線性遞增至100%的A液,之后再洗脫20 min,流速I ml/min,檢測波長445 nm，柱子溫度30°C，進樣體積10 μ 。所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，所述紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質0119、環氧玉米黃質0231和紫黃質0259標樣購自瑞士 carotenature原裝,純度分別為 99. 6%, 95. 7% 和 98. 6%。所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述紫花苜蓿葉黃素提取過程在無光條件下進行。所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法中所述試劑丙酮為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。更具體地，本發明 的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法是準確稱量玉米黃質
O.96 mg,環氧玉米黃質1. 128 mg,紫黃質1. 536 mg,用甲醇定容100 ml容量瓶中，取上述儲備液I ml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍，分別取10 μ 稀釋后的標樣進樣到美國 Agilent 1100 高效液相色譜儀中，用美國 Agilent Hypersil ODS (4.0X250 mm, 5Mm)色譜柱，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min，接著在5 min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min，流速Iml/min，檢測波長445 nm，柱子溫度30°C，以它們的峰面積和濃度進行線性回歸，建立標準曲線，玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別為15. 38 min、10.20 min和6. 90min ;在暗室中，取紫花苜蓿鮮葉放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200 g離心10 11^11，取上清液用0.45 μ m微孔濾膜過濾后，取10 μ 體積進樣到美國Agilent 1100高效液相色譜儀中，用美國Agilent Hypersil ODS的4. 0X250 mm, 5 Mm色譜柱,流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測波長445nm，柱子溫度30°C，紫花苜蓿玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別與標樣的保留時間一致，測出玉米黃質、環氧玉米黃質、紫黃質的含量。
圖1葉黃素循環組分玉米黃質(Z)、環氧玉米黃質(A)和紫黃質(V)的標準曲線圖2徳欽野生紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質(Z)、環氧玉米黃質(A)和紫黃質(V)的峰值圖。圖3阿爾R金紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質(Z)、環氧玉米黃質(A)和紫黃質(V)的峰值圖。與現有技術相比，本發明的組培方法的優點在于本發明方法選取了價格較為便宜的液相色譜柱美國Agilent Hypersil ODS(4.0X250 mm, 5 Mm)色譜柱。選取了對色譜柱無傷害的常規液相色譜流動相乙腈，同時篩選出了靈敏、準確、快速的液相色譜檢測條件。從色素的提取到檢測全過程只需I小時即可完成。
具體實施例方式以下實施例用來進一步說明本發明的實質性內容。根據本發明技術方案和實施例的描述，也許同領域技術人員在本發明的基礎上還可以對本發明技術方案進行一些修改和改進。因此，在不偏離本發明主要技術方案基礎上所做的修改和改進，均應屬于本發明所要求保護的范圍。實施例1 :將購自瑞士 carotenature原裝玉米黃質(0119)準確稱量O. 96 mg、環氧玉米黃質(0231)1. 128 mg和紫黃質(0259)1. 536 mg，用甲醇定容100 ml容量瓶中。取上述儲備液Iml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍。分別取10 PL稀釋后的標樣進樣到美國Agilent1100高效液相色譜儀中，用美國Agi lent Hypersil ODS (4. 0X250 mm, 5 Mm)色譜柱，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測波長445 nm，柱子溫度30°C。以它們的峰面積和濃度進行線性回歸，建立標準曲線。玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別為15.38 min、10. 20 min和6. 90 min。(見附圖1)在暗室中，取德欽野生紫花苜蓿鮮葉片O.1g放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入4 ml 85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入Iml 100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200 g離心10 min，取上清液用O. 45 μ m微孔濾膜過濾后，取10 μ 體積進樣到美國Agilent 1100高效液相色譜儀中，用美國Agilent Hypersil 0DSC4. 0X250mm, 5 Mm)的色譜柱，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min。流速I ml/min,檢測波長445 nm,柱子溫度30°C,玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別為15. 308min、10. 217 min和6. 845min分別與標樣的保留時間一致，測得的玉米黃質的含量為1. 11112X10_3%，環氧玉米黃質的含量9. 87748X 10_4 %和紫黃質的含量為
6.87689XlCT3 % (見附圖 2)。實施例2 將購自瑞士 carotenature原裝玉米黃質(0119)準確稱量O. 96 mg、環氧玉米黃質(0231)1. 128 mg和紫黃質(0259)1. 536 mg，用甲醇定容100 ml容量瓶中。取上述儲備液Iml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍。分別取10 PL稀釋后的標樣進樣到美國Agilent1100高效液相色譜儀中，用美國Agilent Hypersil ODS (4. 0X250 mm, 5 Mm)色譜柱，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測波長445 nm，柱子溫度30°C。以它們的峰面積和濃度進行線性回歸，建立標準曲線。玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別為15.38 min、10. 20 min和6. 90 min。(見附圖1)在暗室中，取阿爾岡金紫花苜蓿鮮葉片O.1g放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入4 ml 85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入I ml 100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200 g離心10 min，取上清液用O. 45 μ m微孔濾膜過濾后，取體積10 μ 進樣到美國Agilent 1100高效液相色譜儀中，使用美國Agilent Hypersil ODS(4. O X 250 mm, 5 Mm)色譜柱，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min。流速I ml/min,檢測波長445 nm,柱子溫度30°C。玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別為15. 735 minUO. 402 min和6. 920 min分別與標樣的保留時間一致，測得的玉米黃質的含量為1. 16060X 10_3 %，環氧玉米黃質的含量7. 34. 48X 10_4 %和紫黃質的含量為1. 80011 X 10_3 %。(見附圖3)本發明的技術方案通過將玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的標樣連續進樣5次，每次 ο μ ，測定其峰面積，其相對標準偏差RSD分別為O. 87%，O. 32%和O. 96%的精密度實驗；將玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的標樣分別于制備后0、3、6、9、14、19、25、48 h,測定其峰面積，其相對標準偏差RSD分別為2. 15%，1. 29%和3. 57%的穩定性試驗；精密稱取同一樣品5份，測定其含量，計算得到玉米黃質相對標準偏差RSD為1. 88%、環氧玉米黃質相對標準偏差RSD為2. 63%和紫黃質RSD為O. 42%的重現性實驗，相對標準偏差都小于5%，表明該方法可較好的區分出葉黃素循環組分玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質，能反映樣品的真實含量，穩定性和重現性均較好，簡便準確。本發明的技術方案由于流動相使用乙腈，相比現有技術使用流動相Tris-HCL緩沖液、甲醇和乙酸乙酯的方法，對色譜柱無傷害，且較為靈敏準確。現有技術使用的流動相要么形成不溶于水的晶體沉淀而堵塞管路系統，導致柱壓急劇升高，大大縮短了柱的有效使用壽命；要么就是乙酸乙酯被吸附，要經常洗脫，不僅費時費力，且經常使得被測組分的峰形被破壞。而本發明克服了這些問題，具備對色譜柱無傷害、靈敏準確，提高效率，延長儀器使用壽命等優點。`
權利要求
1.紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，取紫花苜蓿鮮葉0.lg，倒入液氮研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿.1 min之后置于冰上15 min, 1200g離心10 min，取上清液用0. 45 Mm微孔濾膜過濾后，取.10μ1進樣到高效液相色譜儀采用濃度線性梯度洗脫，最后檢測出紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質(Ζ)、環氧玉米黃質(A)和紫黃質(V)的含量。
2.根據權利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，其特征在于所述高效液相色譜儀使用美國Agilent 1100高效液相色譜儀,色譜柱使用美國Agilent HypersilODS 的 4. 0 X 250 mm, 5 Mm 色譜柱。
3.根據權利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，其特征在于所述濃度線性梯度洗脫，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，濃度線性梯度洗脫程序為90% A液+ 10% B液洗脫15min，接著在5min內，90% A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫.20 min,流速1ml/min,檢測波長445 nm,柱子溫度30°C,進樣體積10 μl。
4.根據權利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，其特征在于所述紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質0119、環氧玉米黃質0231和紫黃質0259標樣購自瑞士carotenature 原裝，純度分別為 99. 6%,95. 7% 和 .98. 6%。
5.根據權利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，其特征在于所述紫花苜蓿葉黃素提取過程在無光條件下進行。
6.根據權利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，其特征在于所述試劑丙酮為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。
7.如權利要求1所述的紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，其特征在于準確稱量玉米黃質0. 96 mg,環氧玉米黃質1. 128 mg,紫黃質1. 536 mg,用甲醇定容100 ml容量瓶中，取上述儲備液1 ml，分別稀釋10倍、50倍、100倍和200倍，分別取10 μl稀釋后的標樣進樣到美國Agilent 1100高效液相色譜儀中，用美國Agilent Hypersil 0DSC4. OX250 mm,.5 Mm)色譜柱，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在5 min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速.1ml/min，檢測波長445 nm，柱子溫度30°C，以它們的峰面積和濃度進行線性回歸，建立標準曲線，玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別為15. 38 min、10. 20 min和6. 90min ;在暗室中，取紫花苜蓿鮮葉0.1g放入研缽中，然后倒入液氮迅速研磨至粉末狀，加入.85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿I min，之后將研缽置于冰上15 min, 1200g離心10 min,取上清液用0. 45 μ m微孔濾膜過濾后,取.10 μl體積進樣到美國Agilent.1100高效液相色譜儀中,用美國Agilent Hypersil ODS的.4. 0X250 mm, 5 Mm色譜柱,流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，梯度洗脫程序90%A液+10%B液洗脫15 min,接著在.5min內，90%A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min,流速I ml/min，檢測波長445 nm，柱子溫度30°C，紫花苜蓿玉米黃質、環氧玉米黃質和紫黃質的保留時間分別與標樣的保留時間一致，最后測出玉米黃質、環氧玉米黃質、紫黃質的含量。
全文摘要
紫花苜蓿葉黃素循環組分的檢測方法，取紫花苜蓿鮮葉0.1g,倒入液氮研磨至粉末狀，加入85%丙酮，勻漿2-3 min，再加入100%丙酮，勻漿1 min之后置于冰上15 min，1200g離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，取10 μl進樣到美國Agilent 1100高效液相色譜儀中采用濃度線性梯度洗脫，用美國Agilent Hypersil ODS(4.0×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相A液為100%乙腈，B液為100%水，濃度線性梯度洗脫程序為90% A液 + 10% B液洗脫15 min，接著在5min內，90% A液濃度線性遞增至100%的A液，之后再洗脫20 min，流速1 ml/min，檢測波長445 nm，柱子溫度30℃。最后檢測出紫花苜蓿葉黃素循環組分玉米黃質(Z)、環氧玉米黃質(A)和紫黃質(V)的含量。
文檔編號G01N30/02GK103063758SQ201210513000
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者姜華, 何承剛, 畢玉芬, 單貴蓮, 馬向麗, 辛培堯 申請人:云南農業大學