專利名稱：一種快速測定三七愈傷組織中皂苷含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速測定三七愈傷組織中皂苷含量的方法。
背景技術：
三Al\_Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen]為五加科人參屬植物,根和根莖入藥，是云南的道地藥材。三七做為傳統中藥已有悠久的應用歷史，清代藥學著作《本草綱目拾遺》中記載“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥之最珍貴者”。三七具有活血和止血的雙重功效，是馳名中外的“云南白藥”的重要成分。三七主產于我國云南省文山州，均為栽培品，全世界98%的三七原藥材產于云南。
三七阜苷(saponins of Panax notoginseng, PNS)是三七的主要藥用成分，由多種達瑪烷型四環三萜皂苷組成，未發現含有齊墩果酸型皂苷，這與人參和西洋參有顯著區另IJ。三七在防治心腦血管疾病方面表現出安全、可靠的療效，以三七皂苷為主要活性成分的藥品市場已達20億人民幣/年。三七為多年生草本植物，一般需種植3年以上方可入藥，較長的生長周期、苛刻的生境要求以及巨大的市場需求導致藥材供需矛盾日益凸顯。2012年的三七藥材價格已經是2008年的5倍。傳統的藥材栽培已很難滿足日漸增加的市場需求，迫切需要采用現代生物技術手段解決三七藥材短缺問題。其中最有效而直接的方法就是通過體外培養三七愈傷組織獲得三七總皂苷。三七總皂苷含量測定的傳統過程為乙醇或甲醇粗提皂苷，然后過大孔樹脂進行純化，除去多糖等雜質，最后采用香草醛-冰乙酸顯色法，根據550 nm的吸光度值確定三七總皂苷的含量。該方法準確可靠，但需要用到柱層析操作，費時費力。本發明簡化了三七皂苷含量測定方法，對粗提皂苷進行直接顯色反應，大大簡化了操作步驟。該檢測過程采用化學計量學方法綜合分析多波長數據，引入多波長為自變量，可排除雜質干擾影響，實現三七愈傷組織中的三七總皂苷含量的測定。該法操作簡便，準確性高，具有較好的實用性和可推廣性，國內外未見相關研究報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速檢測三七愈傷組織中皂苷含量的方法。該方法的操作步驟如下
1)三七愈傷組織的皂苷提取精確稱取干燥至恒重的三七愈傷組織粉末，置于洗凈的三角瓶中，按I g樣品加入50-70 mL甲醇，采用常規的有機溶劑提取法對三七愈傷組織粉末進行常溫超聲波處理1-2 h，過濾，收集濾液，將濾液揮干后再用甲醇溶解，定容至超聲提取時溶液體積的二分之一，即得到提取液；
2)三七皂苷含量測定精確吸取上步獲得的提取液樣品300UL至帶塞的10 mL試管中(設3個重復)，水浴(溫度低于55°C )揮干溶劑，加入新配制的香草醛-冰乙酸(1:20，v/V)溶液0. 2 mL,高氯酸0. 8 mL,混勻后60°C以下水浴加熱15 min (過程中適當震蕩使其反應充分)，立即用冰水冷卻，加入5mL冰乙酸，混勻靜置10 min后對顯色液進行400-700 nm區間的吸光度掃描；
3)光譜數據分析和處理，采用化學計量學中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數據，數據采集范圍530-570 nm，基于可見光區的吸收光譜數據，建立測定三七總皂苷含量的回歸方程，應用回歸方程計算樣品中三七總皂苷的含量。以上發明方法沒有復雜的樣品前處理和分離純化過程，可在短時間內實現三七愈傷組織中三七皂苷含量的快速檢測，方便實用。當提取液中皂苷含量大于5 mg/L時，該發明方法的檢測誤差可小于1%，表明該方法具有較高的測量準確性，可滿足三七皂苷的含量檢測需求。目前，國內外還未見有關三七愈傷組織中皂苷簡便、快速測定的相關報道。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容。實施例I :快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，具體操作如下
1)三七愈傷組織的皂苷提取精確稱取干燥至恒重的三七愈傷組織粉末Ig，置于洗凈的100 mL三角瓶中，加入50 mL甲醇常溫超聲波處理lh，過濾，收集濾液，將濾液揮干后再用甲醇溶解，定容至25 mL,即得到提取液；
2)三七總皂苷含量測定精確吸取上步獲得的提取液樣品300UL至帶塞的10 mL試管中(設3個重復)，水浴(溫度50 °C)揮干溶劑，加入新配制的香草醛-冰乙酸溶液(1:20，v/v)0. 2 mL，高氯酸0.8 mL，混勻后55 1水浴加熱15 min (過程中適當震蕩使其反應充分)，立即用冰水冷卻，加入5 mL冰乙酸,混勻靜置10 min后對顯色液進行400-700 nm區間的吸光度掃描；
3)光譜數據分析和處理采用化學計量學中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數據，數據采集范圍545-555nm，基于可見光區的吸收光譜數據，建立測定三七總皂苷含量的回歸方程，本實施例中建立的回歸方程為
Y=1037. 7672+2215242. 4517x「2794868. 9232 x2-2740603. 4293x3+2034602. 7140 x4+4499565. 2244 x5_528134.5510 x6_4013518.1178 x7_1818522. 0241x8+1572072. 7991 x9+5058327. 3974 x10-3488339. 6909 X11
其中Y表示三七總皂苷的含量，X1-X11代表吸收光譜圖中545-555 nm波長范圍內每間隔I nm的吸光度數值，例如X1和X11分別是545 nm和555 nm下的吸光度值，用該回歸方程對8個樣品中三七總皂苷含量進行預測，結果如表I所示。表I樣品中三七總皂苷含量真實值和回歸方程預測值比較
擇號I真實值(Pg/mL)I預測值(Pg/mL)|預測相對誤差
1115.2~ 116.00.69%
287.2~86.9-0. 38%
396.9~96.90.01%
4101. 9— 101. 7-0. 17%
583.9~83.4-0. 58%
698. I~98.40.26%
7160.4— 160. I-0. 17%
8~丨54. 2丨54. 4|o. 34%如表I所示，選取545-555 nm下的吸光度數據，利用偏最小二乘法獲得回歸方程，預測值和真實值相對誤差小于1%，可以用該方程準確測定體系中三七總皂苷的含量。
實施例2 :快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，具體操作如下
I)三七愈傷組織的皂苷提取精確稱取干燥至恒重的三七愈傷組織粉末I g左右，置于洗凈的200 mL三角瓶中，加入70 mL甲醇常溫超聲波處理I h，過濾，收集濾液，將濾液揮干后再用甲醇溶解，定容至35 mL,得提取液。2)三七總皂苷含量測定精確吸取上步獲得的提取液樣品300 u L至帶塞的10mL試管中(設3個重復)，水浴(溫度50 °C)揮干溶劑，加入新配制的香草醛-冰乙酸溶液(1:20, v/v)0. 2 mL，高氯酸0.8 mL，混勻后55 1水浴加熱15 min (過程中適當震蕩使其反應充分)，立即用冰水冷卻，加入5 mL冰乙酸，混勻靜置10 min后對顯色液進行400-700nm區間的吸光度掃描；
3)光譜數據分析和處理。采用化學計量學中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數據，數據采集范圍530-544nm，基于可見光區的吸收光譜數據，建立測定三七總皂苷含量的回歸方程。本實施例中建立的回歸方程為
Y=555. 8740-14255. 8059xr6540. 6106x2+1675. 7567x3+9591. 2782x4+16293.1148x5+21311. 5804x6+23734. 2390x7+22819. 6828x8+18522. 4603x9+11054. 6866x10+1156. 1-087xn-10284. 7702x12-21796. 8781x13_33349. 2881x14_43911. 2139x15
其中Y表示三七總皂苷的含量，X1-X15代表吸收光譜圖中530-544nm波長范圍內每間隔I nm的吸光度數值,例如X1和X15分別是530 nm和544 nm下的吸光度值。用該回歸方程對8個樣品中三七總皂苷含量進行預測，結果如表2所示。表2樣品中三七總皂苷含量真實值和回歸方程預測值比較
權利要求
1.一種快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括 1)采用常規的有機溶劑提取法對干燥至恒重的三七愈傷組織粉末進行常溫超聲處理1-2 h，過濾，濾液揮干后用甲醇溶解，定容至超聲提取時溶液體積的二分之一，即得到提取液； 2)采用香草醛-冰乙酸顯色法對皂苷提取液直接進行顯色反應； 3)顯色液進行400-700nm區間的吸光度掃描，數據采用化學計量學中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數據，數據采集范圍530-570 nm，根據不同波長條件下的吸光度值，建立基于多自變量的用于測定三七總皂苷含量的回歸方程，應用回歸方程計算樣品中三七總皂苷的含量。
2.根據權利要求I所述快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，其特征在于有機溶劑為甲醇或乙醇。
全文摘要
本發明公開了一種快速測定三七愈傷組織中皂苷含量的方法，該方法通過對三七愈傷組織的皂苷進行提取，然后采用香草醛-冰乙酸顯色法對皂苷提取液直接進行顯色反應，最后采集數據，并進行光譜數據分析和處理，得到愈傷組織中皂苷含量；本發明方法操作簡便、效果良好，可以實現三七總皂苷含量的快速檢測，適用快速了解和認識三七培養細胞中總皂苷的含量，也可推廣用于三七藥材中皂苷含量的測定。
文檔編號G01N1/28GK102967569SQ201210493888
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者葛鋒, 于鋼, 劉迪秋, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學