專利名稱：一種快速檢測沙門氏菌的熒光量子點篩選分離檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物食源性致病菌檢測領域，具體地說是一種快速檢測沙門氏菌的熒光量子點篩選分離檢測試劑盒。
背景技術：
近年來食品安全事故頻頻發生。國家食品衛生監督局的一項統計顯示，在1994年至2003年間，由微生物細菌引起的食源性致病菌感染占食品中毒的37%到52%之間，其中沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌引起的食源性致病菌感染分別約占22%、6%、2%，而其中的鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌0157、福氏志賀氏菌是食源性致病菌中傳播最為廣泛的3種致病菌。許多食源性疾病大多都是由食源性致病菌引起的。而在細菌性食物中毒中發病率最高的是由沙門氏菌引起的食物中毒。沙門氏菌屬是腸桿菌科中重要的病原菌屬，是最常見的人畜共患疾病之一。沙門氏菌為革蘭氏陰性，其菌體大小為(O. 6 O. 9) X (I 3)微米，無芽胞，一般沒有莢膜，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌之外，通常具有周身鞭毛。潛伏期由數小時到1-2周，引起畏寒，發熱，惡心、嘔吐，腹痛和腹瀉等癥狀。常規的檢測方法，如經典的微生物方法需要先對樣品進行預處理，再選擇性增菌，而后分離培養，最后進行生理生化鑒定和血清分型。由于操作煩瑣、靈敏度低、特異性差，且傳統的沙門氏菌檢測方法從采樣到鑒定要4-7d，才能得出明確的診斷結果。顯然，這并不能滿足人們對有效的監測、預防作用的期望。現在，沙門氏菌的檢測方法趨于多樣化，并不局限于微生物方法。通過物理、化學、生物等學科的結合，許多新型的檢測方法陸續誕生。如分子生物學方法，這是對病原微生物中的核酸物質進行特征鑒定。其中包括擴增片段長度多態性技術(AFLP)、聚合酶鏈反應技術(PCR)、核酸探針、基因芯片技術、噬菌體裂解試驗；免疫學方法，這是以抗原和抗體的特異性結合反應為基礎，再輔以免疫放大技術來鑒別細菌，通過病原體刺激機體產生免疫球蛋白(抗體)的方法。其中包括酶聯免疫吸附、斑點酶聯免疫吸附、免疫磁性分離技術、免疫熒光標記、自動酶標免疫檢測儀、自動酶標免疫檢測儀；電阻抗法，它的檢出率和可靠性都非常高。這些方法具有操作簡便、快速、靈敏度高和特異性強等特點。雖然提高了檢測的靈敏度，大大縮短了檢測時間，但是都存在一定的缺陷。例如ELISA對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分；對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應；分析分子量很小的化合物或很不穩定的化合物有一定的困難。在致病菌的分子生物學檢測方法方面，由于檢樣中存在死的致病菌、特異性DNA或RNA片段存在同源性和檢樣中存在不可培養微生物的情況等問題，常常造成PCR檢測結果與常規方法相比，陽性率變高的現象，除存在不可培養微生物的情況外，均屬于假陽性范疇。免疫磁性分離技術是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病菌發生特異性的結合，載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌不斷得到分離、濃縮。免疫磁性分離技術代替了常規的選擇性增菌培養過程，可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。因此，可用來建立一種致病性沙門氏菌快速分離檢驗的體系。熒光半導體量子點有較長時間的熒光效應和較寬的激發光譜，能被任何短于發射峰的波長有效激發，發出穩定、均勻、狹窄的光譜。在同一波長光照下，不同尺寸的量子點有不同的發射峰。因其優良的光化學穩定性和光譜特性，免疫功能化量子點能對樣品中的目標致病菌進行特異性可視化標記，并在熒光條件下進行檢測。為了食品安全，為了尋求更簡便、快速、靈敏檢測食源性致病菌沙門氏菌，研發了一種快速檢測篩選沙門氏菌的方法。
發明內容
本發明在于針對現有技術的不足，提出一種以免疫功能化超順磁性納米粒子和免疫功能化的熒光量子點免疫識別目標微生物，實現特異性檢測食源性致病菌沙門氏菌的快速檢測沙門氏菌的方法。 本發明的技術方案如下一種快速檢測沙門氏菌的熒光量子點篩選分離檢測試劑盒，其特征在于，包括沙門氏菌分離試劑、沙門氏菌檢測試劑、Buffer UBuffer 2 ；所述沙門氏菌分離試劑為分散有免疫功能化磁珠的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化磁珠以Fe3O4核心，外層包裹二氧化硅的超順磁性納米磁珠顆粒，表面偶聯兔抗沙門氏菌多克隆抗體；所述沙門氏菌檢測試劑為分散有免疫功能化熒光量子點的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化量子點為粒徑為5-10nm，發射峰為530nm的CdTe量子點顆粒表面偶聯兔抗沙門氏菌多克隆抗體；所述Buffer I含有pH=6. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液；所述Buffer 2含有pH=7. 2,0. OlM磷酸鹽緩沖液。所述沙門氏菌分離試劑的制備方法包括如下步驟(I)氨基化磁珠的制備將Fe3O4納米粒子分散于TritonX-100、環己烷和正己醇的混合體系中，用氨水調整體系的PH至8-10，滴加TEOS進行水解，得表面包裹二氧化硅的磁性納米粒子，然后分散于甲醇和丙三醇的混合溶液(V甲醇^丙三醇=3:1)中，再加入AEAPS反應5-6h，得表面修飾氨基的納米粒子，即氨基化磁珠；(2)連接抗體將氨基化磁珠分散到磷酸緩沖液(O. 01mol/mL,pH=7. 4)中，加入終濃度為1%的戊二醛，室溫攪拌反應3-4h后，用上述磷酸緩沖液洗去多余的戊二醛，加入沙門氏菌抗體繼續反應3-4h后再加入4°C預冷的封閉液至終濃度為lmg/mL，4V反應2h，固液分離，洗凈多余抗體，得到的免疫化功能磁珠，將得到的免疫化功能磁珠重新分散于上述緩沖溶液中，4°C保存備用；所述封閉液為含10mg/mL牛血清白蛋白的緩沖液。所述沙門氏菌檢測試劑的制備方法包括如下步驟將表面修飾有羧基的CdTe量子點加入磷酸鹽緩沖液和交聯劑的混合溶液中，室溫下渦旋5-10min,再反應15_20min以活化量子點上的自由羧基；加入保護劑，室溫渦旋15-20min，反應60_70min ;與兔抗沙門氏菌多克隆抗體上的末端氨基交聯反應生成酰胺鍵，得到免疫化的量子點，分散于磷酸鹽緩沖液(O. Olmol/mL，pH=7.2)中，O 4°C保存；兔抗沙門氏菌多克隆抗體與量子點的摩爾比為I :10至I 30 ;交聯劑為I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽；保護劑為N-羥基丁二酰亞胺。所述交聯劑在混合溶液中的濃度為10mg/mL至50mg/mL ;所述保護劑在混合溶液中的濃度為5mg/mL至20mg/mL。本發明還提供使用上述試劑盒快速檢測沙門氏菌的方法，包括如下步驟(I)取沙門氏菌分離試劑加入到根據中國國家標準GB4789. 40-2010《食品微生物學檢驗》增菌處理后的樣品中，35-37°C振蕩2-3h，用Bufferl洗脫2_3次；(2)將經步驟(I)處理后的反應液與免疫功能化量子點混合，35_37°C振蕩2_3h，再用Buffer2洗脫3_4次；(3)按上海地方標準DB31/T455-2009《食品中沙門氏菌、志賀氏菌量子點抗體快速篩選法》對步驟(2)所得產物進行檢測。本發明的方法通過免疫功能化超順磁性納米粒子與沙門氏菌發生特異性結合，實現沙門氏菌的分離；通過免疫功能化的熒光量子點對沙門氏菌進行特異性可視化標記，實現快速識別目標菌。本發明方法中使用的磁珠、量子點和其它試劑均可事先制備，大大降低了檢測時間。
圖I為氨基化磁珠與抗體的連接示意圖。圖2為免疫量子點-沙門氏菌-免疫磁珠在可見光下的鏡檢圖。圖3為免疫量子點-沙門氏菌-免疫磁珠在紫外光激發下的鏡檢圖。圖4為空白對照組在可見光下的鏡檢圖。圖5為空白對照組在紫外光激發下的鏡檢圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明實施例I免疫功能化磁珠(沙門氏菌分離試劑)的制備I)氨基化超順磁性納米磁珠的制備將TritonX-100、環己烷、正己醇先按4 1 1比例混合，攪拌均勻，用超聲使其形成透明穩定的反相微乳液體系。加入2. 5g的Fe3O4粒子，再次用超聲使其分散均勻。將30mL濃氨水滴加到不斷攪拌的微乳液體系中，待濃氨水在體系中分散均勻之后，繼續向不斷攪拌的體系中緩慢滴加I. 5mLTE0S，整個加樣時間持續10h，靜置過夜。磁性分離后，用乙醇來洗滌納米粒子，收集表面包裹二氧化硅的磁性納米粒子(Si02/Fe304 MNPs)。隨后將制備得到的Si02/Fe304 MNPs分散于甲醇/丙三醇(V甲醇V丙三醇=3:1)混合溶液中。然后向攪拌體系加入5mL AEAPS,反應5h后進行離心分離，用乙醇和蒸餾水洗滌3 4次，得到了表面修飾氨基的納米粒子(NH2-Si02/Fe304 MNPs)。2)氨基化磁珠和兔抗沙門氏菌多克隆抗體的連接將O. 5mL氨基化納米磁珠分散到磷酸緩沖液中(O. 01mol/mL, pH=7. 4)，加入終濃度為1%的戊二醛，室溫攪拌反應3h后，用上述磷酸緩沖液洗去多余的戊二醛。加入Img的沙門氏菌抗體繼續反應3h后再加入4°C預冷的封閉液(含10mg/mL牛血清白蛋白的緩沖液)至終濃度為111^/1^，41反應211。通過磁性分離洗凈多余的抗體，并將得到的免疫磁珠重新分散于緩沖溶液中(O. Olmol/mL, pH=7. 4)，4°C保存備用。免疫功能化量子點(沙門氏菌檢測試劑)的制備將60uL (2. 6*l(T5mol)的 CdTe 量子點(QDs)加入到磷酸緩沖溶液 PBS (O. Olmol/L，pH 7.2)和6mg EDC · HCL(最終濃度為20mg/mL)的混合液中，混合液室溫下渦旋5min，再反應15-20min以便讓QDs上的自由羧基完全活化；將I. 5mg NHS (最終濃度為5mg/mL)加入到上面的混合液中，室溫渦旋15min，反應60min ;在這步中，QDs上的自由羧基和NHS上的羥基酯化反應生成半穩定的具有胺活性的NHS (羥基丁二酰胺)-酯；
接下來120uL抗體(2mg/mL)加到體系中，渦旋至少2h，沒反應的抗體分子最后通過超濾濃縮離心管去除掉，QDs和抗體通過強烈的共價鍵結合在一起，最后收集產品，O 4°C保存。實施例2用試劑盒對脫脂奶粉中的致病性沙門氏菌進行檢測Buffer INaCl 8. 00g/L, Na2HPO4 I. 44g/L, KCl 0. 2g/L, KH2PO4 0. 24g/L, pH 值為 6. 0。Buffer 2NaCl 8. OOg/L, Na2HPO4 I. 44g/L, KCl 0. 2g/L, KH2PO4 0. 24g/L, pH 值為 7. 2。本實例包括以下步驟(I)根據中國國家標準的食品衛生微生物檢驗(GB4789. 40-2010)，首先取IOOg奶粉到900mL的緩沖蛋白胨水中，分成兩份，一份作為實驗組，加入預先培養好的沙門氏菌，另一份作為空白對照，不作處理。(2)分別取100 μ I免疫功能化磁珠加入到兩份2mL處理后的樣品中，于磁力架上35-37°C振蕩 2-3h，用 Bufferl 洗脫 2-3 次，(3)將(I)中200μ I處理后的反應液與50μ I免疫功能化量子點混合，于磁力架上 35-37°C振蕩 2-3h，用 Buffer2 洗脫 3_4 次，(4)按上海地方標準DB31/T455-2009，將(3)中的最終產物，置于熒光顯微鏡下，先用低倍物鏡掃視整個標本，再換較高倍物鏡繼續觀察，選擇蓋玻片上、中、下均勻分布的3個視野，記錄樣本中出現的綠色熒光亮度與菌量等情況。菌體量子點標記情況表示如下+ :任一視野中可見綠色閃亮熒光，且菌體周圍及中心輪廓清晰。+/ (-):任一視野中綠色較弱熒光，且菌型尚可見；- 3個或以上視野無熒光，且菌型模糊；陽性及可疑陽性結果菌體綠色熒光亮度為+，菌體形態特征符合沙門菌，且任一視野中均能檢出有綠色熒光標記的菌體；陰性結果3個或以上視野無紅色與綠色熒光，且菌形模糊為陰性。綠色一。表示樣本中不含沙門氏菌。(5)對陽性及可疑陽性進行純(化)分離、生化學實驗和血清學實驗。
(6)報告結果。結果報告在加入沙門氏菌的實驗組中，檢測結果為陽性，即菌體綠色熒光亮度為+，菌體形態特征符合沙門菌。從圖2、圖3中可以看出，被免疫磁珠分離出的沙門氏菌可被免疫量子點特異性結合。從圖4、圖5中可以看出，在未加入沙門氏菌的空白對照樣品中，檢測結果為陰性，即3個或以上視野無紅色與綠色熒光。綠色一。表示樣本中不含沙門氏菌。以上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限于該實施例所公開的內容。所以凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的范圍。·
權利要求
1.一種快速檢測沙門氏菌的熒光量子點篩選分離檢測試劑盒，其特征在于，包括沙門氏菌分離試劑、沙門氏菌檢測試劑、Buffer 1> Buffer 2 ； 所述沙門氏菌分離試劑為分散有免疫功能化磁珠的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化磁珠以Fe3O4核心，外層包裹二氧化硅的超順磁性納米磁珠顆粒，表面偶聯兔抗沙門氏菌多克隆抗體； 所述沙門氏菌檢測試劑為分散有免疫功能化熒光量子點的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化量子點為粒徑為5-10nm，發射峰為530nm的CdTe量子點顆粒表面偶聯兔抗沙門氏菌多克隆抗體； 所述Buffer I含有pH=6. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液； 所述Buffer 2含有pH=7. 2,0. OlM磷酸鹽緩沖液。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的沙門氏菌分離試劑的制備方法包括如下步驟 (1)氨基化磁珠的制備將Fe3O4納米粒子分散于TritonX-100、環己烷和正己醇的混合體系中，用氨水調整體系的PH至8-10，滴加TEOS進行水解，得表面包裹二氧化硅的磁性納米粒子，然后分散于甲醇和丙三醇的混合溶液(V甲醇￥丙三醇=3:1)中，再加入AEAPS反應5-6h，得表面修飾氨基的納米粒子，即氨基化磁珠； (2)連接抗體將氨基化磁珠分散到磷酸緩沖液(O.01mol/mL,pH=7. 4)中，加入終濃度為1%的戊二醛，室溫攪拌反應3-4h后，用上述磷酸緩沖液洗去多余的戊二醛，加入沙門氏菌抗體繼續反應3-4h后再加入4°C預冷的封閉液至終濃度為lmg/mL，4°C反應2h，固液分離，洗凈多余抗體，得到的免疫化功能磁珠，將得到的免疫化功能磁珠重新分散于上述緩沖溶液中，4°C保存備用；所述封閉液為含10mg/mL牛血清白蛋白的緩沖液。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的沙門氏菌檢測試劑的制備方法包括如下步驟 將表面修飾有羧基的CdTe量子點加入磷酸鹽緩沖液和交聯劑的混合溶液中，室溫下渦旋5-10min,再反應15_20min以活化量子點上的自由羧基； 加入保護劑，室溫渦旋15-20min，反應60_70min ;與兔抗沙門氏菌多克隆抗體上的末端氨基交聯反應生成酰胺鍵，得到免疫化的量子點，分散于磷酸鹽緩沖液(O. Olmol/mL，ρΗ=7·2)中，O 4°C保存; 兔抗沙門氏菌多克隆抗體與量子點的摩爾比為I :10至I :30 ;交聯劑為I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽；保護劑為N-羥基丁二酰亞胺。
4.權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，交聯劑在混合溶液中的濃度為lOmg/mL至50mg/mLo
5.權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，保護劑在混合溶液中的濃度為5mg/mL至20mg/mLo
6.一種使用權利要求1-5任意一項所述試劑盒快速檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)取沙門氏菌分離試劑加入到根據中國國家標準GB4789.40-2010《食品微生物學檢驗》增菌處理后的樣品中，35-37°C振蕩2-3h，用Bufferl洗脫2_3次； (2)將經步驟(I)處理后的反應液與免疫功能化量子點混合，35-37°C振蕩2-3h，再用Buffer2 洗脫 3-4 次； (3)按上海地方標準DB31/T455-2009《食品中沙門氏菌、志賀氏菌量子點抗體快速篩選法》對步驟(2)所得產物進行檢測。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測沙門氏菌的熒光量子點篩選分離檢測試劑盒，本發明的試劑盒通過免疫功能化超順磁性納米粒子與沙門氏菌發生特異性結合，實現沙門氏菌的分離；通過免疫功能化的熒光量子點對沙門氏菌進行特異性可視化標記，實現快速識別目標菌。本發明中使用的磁珠、量子點和其它試劑均可事先制備，大大降低了檢測時間。
文檔編號G01N33/533GK102928590SQ20121048008
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者趙渝, 姚玉婷, 李先富, 趙琨, 陶珊珊 申請人:上海師范大學