非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物的應用的制作方法

專利名稱：非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物樣品檢測領域，涉及非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物的應用。
背景技術：
胸水，又名胸腔積液，是臨床上常見的病癥之一，可因多個疾病引發。在我國，結核是第一位的病因，惡性腫瘤居病因的第二位。不同疾病引發的胸水，其應對措施和患者預后迥然不同。因此良惡性胸水的鑒別診斷具有至關重要的作用。惡性胸水是晚期腫瘤病人常見而又令人苦惱的一種并發癥，469Γ64%的胸腔積液患者為惡性腫瘤所致，近來有增加的趨勢。幾乎所有的惡性腫瘤(除原發性腦腫瘤)均可引
起胸腔積液，在臨床上引起胸水的惡性腫瘤中肺癌是占第一位的(249Γ4290，其次分別為原發灶不明的胸膜轉移性腺癌(34%)、乳腺癌(239Γ2590，惡性淋巴瘤(12°/Γ24%)。肺癌病人在其病程中，約有半數患者發展成胸水。有數據顯示約30%的肺癌患者最初的臨床表現是胸水。惡性胸水患者總的預后不佳。近年來國內外學者都在試圖尋找更為有效的檢測指標以提高惡性胸水的檢出率，腫瘤標志物就是其中研究的熱點。腫瘤標志物(tumour marker, TM)主要是指細胞在癌變的發生、發展、浸潤及轉移過程中所分泌的一些活性物質，這些物質在正常人體內缺乏或含量極低。它們在釋放入血的同時，也大量存在于腫瘤組織周圍和因腫瘤產生的胸水中，且其濃度可能遠遠高于血清[7]。故檢測胸水中的腫瘤標志物越來越受到臨床的重視。腫瘤標志物癌胚抗原(carcinoma embryonic antigen, CEA)是一種糖蛋白，其分子量較大,存在于胚胎胃腸粘膜上皮與一些惡性病變組織的細胞表面，可見于肺癌、乳腺癌、結腸癌等惡性腫瘤患者，其特異性不理想。當胸膜腔受到惡性腫瘤細胞侵犯時，由于快速的細胞轉換，多糖蛋白質復合物，包括CEA脫落至胸腔，CEA由于分子量較大，一旦在閉合的胸腔產生，便不易進入血液循環，故不易形成被腎臟清除的抗原抗體復合物，因此，惡性胸水中CEA水平較血清出現早且更明顯。細胞角質蛋白19片段(cytokeratin 19fragment, CYFRA 21_1)是利用鼠的單克隆抗體KS19和BM19-21在人體液中檢測細胞角蛋白19的一個可溶性片段。主要分布于肺、食道、乳腺上皮，是非小細胞肺癌尤其是肺鱗癌的首選標志物。神經元特異性烯醇化酶(neuron specificenolase,NSE)主要存在于神經元及外周神經內分泌組織中，與小細胞肺癌(small cell lungcancer, SCLC)有關,是公認的小細胞肺癌高特異性、高靈敏性的腫瘤標志物[9]。國內外通過檢測CEA、CYFRA 21-1和NSE來鑒別胸水性質的報道較多見，但其敏感性和特異性均不理想。因此，尋找診斷肺癌性胸水較為敏感和特異的指標，成為臨床迫切需要解決的問題。臨床上以細胞學檢查和組織活檢作為鑒別良惡性胸水的標準，前者雖然特異性高，但不夠敏感，其陽性檢出率僅為40%-50%，胸腔鏡檢查雖可大大提高診斷的敏感性(達90%左右)，但因損傷較大、費用高，又有一定的風險，臨床應用受限。由于以上多方面原因，迄今為止，臨床上仍未能有一個敏感性和特異性均較為理想的胸水腫瘤標志物。眾所周知，在胸水中找到腫瘤細胞是判斷惡性胸水的金標準。然而，只有當肺癌病灶浸破臟層胸膜，癌細胞脫入胸腔內，才能形成胸腔脫落癌細胞。首先，從胸膜上脫落下來的反應性間皮細胞也有腺癌細胞的一些形態特征，加之某些異形性不明顯的癌細胞與反應性間皮細胞幾乎無法區別。其次，由于癌細胞在積液中無組織及器官構架的束縛而自由漂浮和增生甚至經幾代繁殖，失去了原來在組織中的形態特征，故單純依靠形態學進行診斷，敏感性較低以至造成診斷結果中存在著相當數量的假陰性。細胞形態學診斷的敏感性僅為50%左右，特異性為80%。因此，建立一種科學、有效的細胞學診斷方法是提高肺癌性胸水診斷陽性率的有效途徑，也是提高肺癌患者生存率與治愈率的關鍵。目前，利用抗腫瘤單克隆抗體研究和確定相關的抗原分子在腫瘤結構和功能活動中的有關特性，對于研究這些分子在惡性腫瘤細胞生物學行為中的作用有十分重要的意義，并在近年取得長足進展。同時利用抗腫瘤單克隆抗體檢測各種體液中的腫瘤抗原用于惡性腫瘤的早期診斷也顯示出誘人的前景，受到廣泛關注。本實驗室前期以人肺腺癌細胞株SPC-Al為抗原，免疫BALB/c小鼠，常規細胞融合，間接細胞ELISA法篩選陽性細胞克隆，得到一株高效價并穩定分泌IgGl抗人非小細胞肺癌單克隆抗體的細胞株NJ001 ；Western blot顯示單抗NJOOl特異性結合的抗原相對分子質量(Mr)為70000左右，因此該蛋白被命名為SP70 ;免疫熒光法等證實單抗NJ001能特異地識別肺癌細胞系，其識別抗 原在非小細胞肺癌細胞的胞漿中和胞膜上均有表達，胞漿中表達量更豐富；免疫組化結果表明單抗NJ001與非小細胞肺癌組織有強陽性反應，而與小細胞肺癌、其他組織類型的腫瘤及正常肺組織呈弱陽性或陰性反應，因此證明了 SP70在非小細胞肺癌診斷中的特異性。通過雙抗體夾心ELISA方法，對臨床血清樣本中的SP70抗原進行檢測，證明該抗原在非小細胞肺癌的診斷中有重要的臨床價值。Fuhrman C (Fuhrman C，Duche JC, Chouaid C，AbdAlsamad I，Atassi K，Monnet I，Tillement JPj Housset B. Useof tumor markers fordifferential diagnosis of mesothelioma and secondary pleuralmalignancies. ClinBiochem，2000，33(5) :405-410.)對肺癌患者血清和胸水樣本中的(某些)腫瘤標志物(CEA，CYFRA 21-1，組織多肽抗原，透明質酸)同時進行檢測和比較分析，結果顯示胸水中的含量明顯高于血清中的含量，因此，可以認為檢測胸水中的腫瘤標志物是一種較好的鑒別良惡性胸水的方法。但是血清腫瘤標志物不一定能作為胸水腫瘤標志物，有文獻報道(宋志軍，吳廣平.CA724和CA199在肺癌患者臨床診斷意義.中國醫藥指南，2011，9 (19):18-19),CA72-4在肺癌患者血清中含量明顯升高，然而，CA72-4在肺癌患者胸水中的診斷價值遠遠小于血清中的診斷價值。SP70作為一種組織特異性強的新腫瘤標志物，它在非小細胞肺癌患者所致胸水中是否表達尚未見報道。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供SP70作為非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物的應用。本發明的另一目的是提供SP70的單克隆抗體的應用。本發明的又一目的是提供一種非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑盒。本發明的目的可通過如下技術方案實現SP70作為非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物在制備非小細胞肺癌胸水和/或胸水脫落細胞診斷試劑中的應用。SP70的單克隆抗體在制備非小細胞肺癌所致胸水和/或胸水脫落細胞診斷試劑中的應用。其中，所述的SP70的單克隆抗體優選保藏號為CCTCC NO C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌的單克隆抗體NJ001-1。所述的單克隆抗體NJ001-1在制備檢測非小細胞肺癌所致胸水的雙抗體夾心ELISA檢測試劑中的應用。一種非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑盒，包含熒光標記的SP70的單克隆抗體、5%BSA、1%PBS。其中，所述的SP70的單克隆抗體優選保藏號為CCTCC NO C201172的雜交瘤細胞·株分泌的抗人非小細胞肺癌的單克隆抗體NJ001-1。所述的熒光標記的SP70的單克隆抗體優選Mix - n-StainTMCF 488A抗體標記試劑盒標記的單克隆抗體NJ001-1。一種檢測非小細胞肺癌胸水脫落細胞的試劑盒，包含非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑，以及常規胸水脫落細胞HE染色檢測試劑；其中所述的非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑包含熒光標記的SP70的單克隆抗體，優選包括Mix - n-Stain CF 488A抗體標記試劑盒標記的單克隆抗體NJ001-1。一種非小細胞肺癌診斷方法，利用本發明所述的檢測非小細胞肺癌胸水脫落細胞的試劑盒分別通過直接免疫熒光法以及胸水脫落細胞HE染色檢測待檢胸水脫落細胞，若二者檢測均為陽性，則說明待檢胸水脫落細胞為非小細胞肺癌胸水脫落細胞。本發明的有益效果本發明通過大量實驗研究發現，SP70抗原可作為由非小細胞肺癌引起的惡性胸水的一個敏感、特異的檢測指標，同時檢測胸水中和胸水脫落細胞上的SP70抗原，可大大提高癌性胸水診斷的敏感性和特異性。采用本發明雙抗體夾心ELISA檢測試劑對胸水中SP70進行檢測，并用電化學發光技術對胸水中肺癌相關腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1和NSE進行同步檢測和比較分析，SP70的陽性率顯著高于CEA、CYFRA21-1和NSE的陽性率。SP70與CEA、CYFRA21-1和NSE相比較，具有更高的特異性。SP70在肺腺癌組中陽性率明顯高于其他病理類型所致胸水。David等研究認為CEA在鑒別良惡性胸水上有較高的敏感性和特異性。但本研究數據顯示，SP70作為一種新型的胸水腫瘤標志物其敏感性和特異性均明顯優于CEA。SP70作為一個潛在的肺癌胸水腫瘤標志物，在癌性胸水中的陽性符合率(72. 2% )顯著高于傳統的HE染色檢測法的陽性符合率(47. 2% )。本發明數據顯示，在36例脫落細胞學診斷為陰性的患者中，其胸水SP70的ELISA檢測結果均為陽性。造成這一現象的原因為操作者的取材局限性、制片技術以及病變是否典型等問題，從而出現延誤診斷或漏診的情況。與脫落細胞學檢測相比，利用本發明試劑盒，對胸水SP70進行ELISA檢測克服了上述缺點，可成為細胞病理學診斷的一種有價值的補充，使非小細胞肺癌所致惡性胸水的診斷敏感性大大提高。本發明通過熒光染料試劑盒對單克隆抗體NJ001進行標記，并利用該熒光標記單抗建立了直接免疫熒光檢測方法對肺癌性胸水脫落細胞上的SP70抗原進行檢測，研究結果顯示，直接熒光法的陽性符合率為45. 2% (42/93)，HE染色法的陽性符合率為48. 4%(45/93)，兩者陽性符合率無統計學差異(X 2 = 0. 19，P>0. 05)。因此，該法可成為傳統HE染色脫落細胞檢測技術的有力補充。國內外專家一直致力于尋找一些新的細胞診斷學方法，以彌補傳統脫落細胞學檢測中細胞形態不易辨別的缺點。本發明所建立的直接免疫熒光法作為一種新型的檢測技術，和HE染色法相比較，在肺癌所致的胸水脫落細胞檢測上，陽性率無顯著差異。且克服了細胞形態不易辨別這一缺點，既使沒有經驗的病理醫生也很容易掌握該檢測技術。兩種方法同時檢測可使陽性率提高至54.8%，降低了漏診率。同時，在辨別癌細胞和反應性間皮細胞方面也具有一定的優勢。綜上所述，利用本發明的試劑盒，將直接免疫熒光法檢測肺癌胸水脫落細胞上的SP70抗原與傳統的HE染色法相結合，可提高胸水脫落細胞學檢查的敏感性，對診斷肺癌性胸水有重要的臨床價值，具有廣闊的應用前景。


圖I胸水中SP70、CEA、CYFRA21-1和NSE的檢測陽性率 圖2不同病理類型胸水樣本SP70檢測結果圖3胸水中SP70的ELISA檢測與胸水脫落細胞HE染色檢測結果圖4肺癌患者胸水中SP70的ROC曲線分析圖5胸水脫落細胞SP70直接熒光檢測和HE染色法檢測結果圖6脫落細胞直接免疫熒光法檢測結果(400 X ) 生物材料樣品的保藏信息雜交瘤細胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢，武漢大學，保藏號為CCTCC NO :C201172。
具體實施例方式實施例II.材料與試劑I. I 材料收集南京醫科大學第一附屬醫院2011年7月至2012年2月收治的經病史、臨床表現、CT或病理學確診的肺癌患者胸水108例和非癌性胸水122例，癌性胸水患者中，男78例，女30例;年齡32 84歲、中位年齡65. O歲。非癌性胸水患者中，男82例，女40例；年齡58 90歲、中位年齡70. O歲。胸水患者疾病構成見表1，其中81例為有分期資料的肺癌患者，早期組(I / II期)為9例(肺腺癌6例，肺鱗癌3例)，晚期組(III / IV期)為72例(肺腺癌60例，肺鱗癌9例，小細胞肺癌3例)。表I胸水患者疾病構成(η = 230)
權利要求
1.SP70作為非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物在制備非小細胞肺癌胸水和/或胸水脫落細胞診斷試劑中的應用。
2.SP70的單克隆抗體在制備非小細胞肺癌所致胸水和/或胸水脫落細胞診斷試劑中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述的SP70的單克隆抗體為保藏號為CCTCC NO C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌的單克隆抗體NJOOl-I。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的單克隆抗體NJ001-1在制備檢測非小細胞肺癌所致胸水的雙抗體夾心ELISA檢測試劑中的應用。
5.一種非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于包含熒光標記的SP70的單克隆抗體、5%BSA、1%PBS。
6.根據權利要求5所述的直接免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于所述的SP70的單克隆抗體為保藏號為CCTCC NO C201172的雜交瘤細胞株分泌的抗人非小細胞肺癌的單克隆抗體 NJOO1-1。
7.根據權利要求5所述的直接免疫熒光檢測試劑盒，其特征在于所述的熒光標記的SP70的單克隆抗體為Mix - n-StainTMCF 488A抗體標記試劑盒標記的單克隆抗體NJ001-1。
8.—種檢測非小細胞肺癌胸水脫落細胞的試劑盒，其特征在于包含非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑，以及常規胸水脫落細胞HE染色檢測試劑；其中所述的非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑包含熒光標記的SP70的單克隆抗體，優選包括Mix - n-Stain CF 488A抗體標記試劑盒標記的單克隆抗體NJ001-1。
9.一種非小細胞肺癌診斷方法，其特征在于利用權利要求8所述的檢測非小細胞肺癌胸水脫落細胞的試劑盒分別通過直接免疫熒光法以及胸水脫落細胞HE染色檢測待檢胸水脫落細胞，若二者檢測均為陽性，則說明待檢胸水脫落細胞為非小細胞肺癌胸水脫落細胞。
全文摘要
本發明屬于生物樣品檢測領域，公開了非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物的應用。SP70作為非小細胞肺癌胸水腫瘤標志物在制備非小細胞肺癌胸水和/或胸水脫落細胞診斷試劑中的應用。SP70的單克隆抗體在制備非小細胞肺癌所致胸水和/或胸水脫落細胞診斷試劑中的應用。一種非小細胞肺癌胸水脫落細胞的直接免疫熒光檢測試劑盒，包含熒光標記的SP70的單克隆抗體、5%BSA、1%PBS。本發明通過大量實驗研究發現，SP70抗原可作為由非小細胞肺癌引起的惡性胸水的一個敏感、特異的檢測指標，同時檢測胸水中和胸水脫落細胞上的SP70抗原，可大大提高癌性胸水診斷的敏感性和特異性。
文檔編號G01N21/64GK102944681SQ20121047526
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者潘世揚, 王芳, 黃珮珺, 徐建, 楊瑞霞, 孫瑞紅, 黃蕾 申請人:潘世揚