專利名稱：分泌型抗精子抗體檢測試劑盒及使用方法
技術領域：
一種分泌型抗精子抗體酶免檢測試劑盒及其檢測方法，屬于酶免疫分析技術領域。
背景技術：
不孕不育，分為不孕癥和不育癥，根據發生的原因可分為器質性、免疫性、醫源性、感染性、生理性不孕，根據是否有過妊娠史可分為原發性不孕和繼發性不孕。還有10% 20%的患者原因不明，在此類患者中，免疫因素占據30 40%起著不可忽視的作用。因此免疫性不孕的臨床診治越來越被人們重視，它將有助于臨床的診斷與治療，為患者帶來福音。抗精子抗體(AsAb)主要有IgG、IgM、IgA3種類型，是一個復雜的病理產物，其作用主要表現為精子凝集、精子制動，影響精子的運送，抑制精子穿透宮頸黏液，限制精子與卵透明帶粘附，抑制精子頂體的活性，使精子不易穿透包繞卵細胞的放射冠和透明帶，阻礙精子與卵細胞膜的融合，阻止精子與卵子結合及影響胚胎的存活，導致死胎和流產等。分泌型IgA抗體(SIgA抗體)可分為血清型和分泌型，血清型多為IgA單體，分泌型多為IgA 二聚體和多聚體，IgA可以單體、二聚體甚至多聚體的形式存在，聚合體不僅結合抗原的能力增強，還可使IgA能結合分泌片，賦于IgA以特殊的活性。IgA型抗體也與習慣性流產密切相關，ASAb還可通過干擾細胞滋養層向合體滋養層的轉化，干擾細胞間信息的傳播等作用而導致流產。局部免疫SIgA是由J鏈連接成的雙聚IgA與SC(分泌片段)結合后形成的復合物，多為二聚體或多聚體而不易檢測。SIgA與IgA在免疫功能上具有不同之處，作用的最大特點是將抗原抗體的反應控制在膜免疫系統的局部，而且是以非炎癥的方式限制抗原物質對粘膜表面的侵入。SIgA的重鏈有一個含額外半胱氨酸的C端結構，可與B細胞產生的J鏈相結合，使IgA形成二聚體或多聚體。聚合體不僅結合抗原的能力增強，J鏈對于SIgA的形成有兩個重要的功能，除了使IgA形成雙聚體，在多聚IgA(多聚免疫球蛋白)與SC/pIgR(多聚免疫球蛋白受體)結合的親和性方面也起了重要作用，在排除抗原方面發揮了重要的作用，不僅可以通過聚集潛在入侵的病原體使之易于蠕動和粘液纖毛運動將其清除，而且SC能通過其糖類殘基使SIgA能與沿著表皮表面的粘膜抗體錨著于適當的組織處，破壞抗原的定位，進而清除抗原，SC上的N-糖基為抗原粘附和凝集素的結合提供了很多表位，因此，SIgA抗體在生殖免疫中起到重要作用。鹽酸氨溴索為粘液溶解劑，臨床上用于呼吸病人能增加呼吸道粘膜漿液腺的分泌，從而降低痰液粘度，促進肺表面活性物質的分泌，增加支氣管纖毛運動，使痰液易于咳出。本品的巰基(-SH)結構可使粘蛋白的雙硫(-S-S-)結構斷裂，降低宮腔分泌物粘度，碳酸氫鈉也可以降低分泌物的粘稠度，使分泌型抗精子抗體的多聚體轉變為單體而易于ELISA法檢測。采用聚苯乙烯反應板條固相吸附精子抗原，在反應過程中若被檢樣本存在抗精子抗體，則與板條中包被的精子抗原結合，形成抗原-抗體復合物，再與酶標記的二抗形成抗原-抗體-抗抗體復合物，并結合在微孔壁表面，通過底物作用在相應檢測孔中出現藍色，用以特異性的檢測分泌物中的抗精子抗體。
發明內容
本發明的目的是提供一種樣品前處理簡單，提取后可直接測定，簡便、快速、靈敏、準確的檢測分泌型抗精子抗體的方法。本發明試劑盒主要由盒體(I)，酶標板⑵中設有反應孔⑶的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(酶標記的抗精子二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶標板(2)均放在盒體(I)內。本發明的原理是采用鹽酸氨溴索分解宮腔分泌物分泌型抗體，然后采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測分泌型抗精子抗體。
具體實施例方式一、抗精子抗體酶標板的制備將精子抗原用包被液稀釋成1: 200倍，加入IOOu I包被微孔反應板的微孔，力口入含1%小牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液350 Ul/每孔，室溫封閉2小時，4°C過夜。甩盡孔內液體后，用洗滌液洗3次，每次3分鐘。二、酶標記抗體的制備(I)將辣根過氧化物酶5mg溶于0. 5ml 0. 2mol/L pH5. 6HAC-NaAc緩沖液中，滴入0. lmol/L NaIO4 0. 25ml,4°C 30 分鐘。(2)加入 2. 5% 乙二醇 0. Sml，室溫下 30min。(3)加入抗精子抗體5 IOmg,用1. Ommol/L pH9. 5碳酸鹽緩沖液調整反應液的pH至9.0左右，4°C過夜。(4)加入 NaHB4 0.1ml 混勻，4°C 2 小時后對 0. 01mol/L pH7. 4PBS 透析，4°C過夜。加入適量中性甘油后小量分裝。三、洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)配置:0. 15M KH2PO4 0. 2 克，Na2HPO4 12H20 2. 9 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，Tween-20 0. 05% 0. 5ml 加蒸餾水至 1000ml。四、前處理液的配置在IL洗滌液中加入鹽酸氨溴索30g，碳酸氫鈉IOg即為前處理液。
圖1分泌型抗精子抗體試劑盒示意圖。圖2酶標板示意圖。圖3酶標板條與反應孔示意圖。
具體實施例方式實施例I1.樣品處理取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到2ml前處理液中劇烈震蕩，靜至60min，待用。2.檢測方法使用前，將分泌型抗精子抗體試劑盒平衡至室溫，取IOOiU經鹽酸氨溴索溶解劑處理的分泌物溶液、陰陽性對照加入到酶標板孔中，震蕩混勻后，至37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入酶標液50 yl，至37 °C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍干，加入試劑D、試劑E各50 yl，至37°C水浴箱水浴lOmin，加I滴終止液，酶標儀讀取結果。3.結果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。也可測OD值在ELISA檢測儀上，于490nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
權利要求
1.一種分泌型抗精子抗體酶免疫檢測試劑盒，其特征在于由盒體(1)，酶標板(2)中設有反應孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶酶(酶標記的抗精子二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)， E試劑瓶(H2O2) (8)，F試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶標板(2)均安放在盒體(I)內。
2.根據權利要求I所述的分泌型抗精子抗體酶免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的塑料托架(10)上制有孔和凹槽。
3.根據權利要求I所述的分泌型抗精子抗體酶免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的酶標板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成均放在盒體(I)內。
4.一種分泌型抗精子抗體檢測方法，其特征在于取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到 2ml含有30g/L鹽酸氨溴索-PBS緩沖液中劇烈震蕩，靜至60min，分別取100 μ I經鹽酸氨溴索-PBS緩沖液液處理的分泌物溶液、陰陽性對照加入抗精子抗體ELISA反應孔中，震蕩混勻后，至37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入酶標液50 μ 1，至 37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍干，加入試劑D、E各50 μ 1，至37°C水浴箱水浴IOminJP I滴終止液酶標儀測定A49tlnm值。
5.按照權利要求4所述的分泌型抗精子抗體檢測方法，其特征在于所述的A試劑瓶 (分泌物前處理液)為含有30mg/L鹽酸氨溴索PBS-Tween緩沖液。
6.按照權利要求4所述的分泌型抗精子抗體檢測方法，其特征在于所述的B試劑瓶，為辣根過氧化物酶標記的抗精子二抗。
7.按照權利要求4所述的分泌型抗精子抗體檢測方法，其特征在于所述的酶底物液，D 試劑瓶為鄰苯二胺(OPD)試劑，E試劑瓶為比02。
全文摘要
本發明公開了一種分泌型抗精子抗體酶免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬于酶免疫分析技術領域，本發明配制的試劑盒，通過鹽酸氨溴索使宮頸分泌物中分泌型IgA抗精子抗體多聚體的雙硫鍵(-S-S-)結構斷裂轉變成可溶性單體，加入到抗精子抗體檢測酶標板上，采用酶免疫吸附(ELISA)法檢測分泌型抗精子抗體，經溫浴、洗滌、加酶標二抗，使兩者進行反應、洗滌、加入酶底物顯色。本發明前處理簡單，快速、靈敏、準確、廉價的檢測方法，適用于宮腔分泌物分泌型抗精子抗體檢測，可以作為不孕不育的重要檢查指標。
文檔編號G01N33/53GK102980994SQ20121046003
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者李立和, 常玉芝, 楊帥, 尹振宇 申請人:天津市寶坻區人民醫院