專利名稱：雙試劑法檢測間接膽紅素試劑盒及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種測定血清、血漿或者尿液中膽紅素的試劑盒；或是利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法。
背景技術：
間接膽紅素(英文縮寫IBIL)主要是由紅細胞破壞而來，未在肝內經過葡萄糖醛酸化的叫做間接膽紅素。間接膽紅素經過肝臟代謝又可變為直接膽紅素，隨膽汁排入膽道，最后經大便排出。臨床意義間接膽紅素參考值1. O 20.0 μ mol/L。間接膽紅素偏高的原因1、肝臟疾患一些惡性疾病也會導致血中的間接膽紅素偏高，如急性黃疸型肝炎、急性肝壞死、慢性活動性肝炎、肝硬化等。2、溶血性貧血人體內紅細胞大量破壞，釋放出間接膽紅素，當·血中間接膽紅素過多時，超過了肝臟的轉化能力，使間接膽紅素在血中滯留，從而引起血中間接膽紅素偏高，這種情況也被稱之為溶血性黃疸，患者通常會有皮膚發黃、鞏膜發黃、尿色發黃癥狀。3、血型不合輸血當輸入血型不合的血液，會導致溶血，使體內紅細胞大量破壞，從而導致血液中的間接膽紅素偏高。4、新生兒黃疸當新生兒出生以后，48 72小時出現黃疸，精神不好，且2周內沒有消退，這主要是因為母子血型或者新生兒先天性膽道畸形等引起的，這種情況也會導致血液中的間接膽紅素偏高。目前膽紅素測定方法有改良J-G法、膽紅素氧化酶法、高效液相色譜法、經皮測定膽紅素法、釩酸鹽氧化法等測定方法，其中，改良J-G法為世界衛生組織和我國衛生部臨床檢驗中心推薦的實驗室測定方法，這些方法用于測定總膽紅素和直接膽紅素。以二甲亞砜法為例總膽紅素(TBIL)測定反應式為對氨基苯磺酸+HCl+NaN02 —氯化重氮苯磺酸+NaCl直接膽紅素+氯化重氮苯磺酸一偶氮膽紅素
二甲亞砜
間接膽紅素—— 破壞氫鍵后+氯化重氮苯磺酸- 偶氮膽紅素直接膽紅素測定采用的是在總膽紅素中不加入二甲亞砜，測定的即為直接膽紅素，目前實驗室測定間接膽紅素方法均為先測定總膽紅素，然后在測定直接膽紅素，兩者結果相減即為間接膽紅素的值，但此法工作量及試劑成本加倍，而且同時受兩個實驗誤差的影響，因此，本發明創造了應用雙試劑法一次測得間接膽紅素的方法。在同一反應體系中，直接膽紅素先與氯化重氮苯磺酸生成偶氮膽紅素反應完成后，加入二甲亞砜，間接膽紅素在二甲亞砜作用下，與氯化重氮苯磺酸生成偶氮膽紅素，儀器以第一步反應生成的偶氮膽紅素為空白，以第二步反應生成的偶氮膽紅素為測定反應計算出間接膽紅素的值，不受直接膽紅素的干擾，因此，測定結果為間接膽紅素的值。
發明內容
為了解決現有技術無法直接測定血清中間接膽紅素，本發明提供一種經濟方便易行，準確性更高、能夠直接測定血清間接膽紅素的雙試劑測定方法。解決該技術問題采用的技術方案是對氨基苯磺酸、鹽酸及亞硝酸鈉同在試劑I中，直接膽紅素先與氯化重氮苯磺酸生成偶氮膽紅素反應完成后，加入試劑II，間接膽紅素在二甲亞砜作用下，與氯化重氮苯磺酸生成偶氮膽紅素，儀器在540nm波長處檢測，以第一步反應生成的偶氮膽紅素為空白，由試劑II反應產生的偶氮膽紅素計算出間接膽紅素的含量。反應式第一步反應
對氨基苯磺酸+HCl+NaN02 —氯化重氮苯磺酸+NaCl直接膽紅素+氯化重氮苯磺酸一偶氮膽紅素第二步反應
權利要求
1.一種血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法，其特征在于重氮試劑在試劑I中，試劑II僅含有加速劑有效成分，其測定方法為血清先與試劑I于37°c溫浴3 5分鐘，血清中直接膽紅素與試劑I的反應生成偶氮膽紅素，再加入試劑II后于37°C溫浴4 7分鐘，間接膽紅素在加速劑的作用下，間接膽紅素氫鍵被破壞，與重氮試劑反應生成偶氮膽紅素，儀器在540nm波長處檢測，以試劑I反應產生的偶氮膽紅素為空白，由試劑II反應產生的偶氮膽紅素計算出間接膽紅素的含量，計算公式為0DIBiL = OD27-OD10X [(SV+W (SV+&'+R11V11)] 間接膽紅素濃度=F X ODibil 其中0D·是間接膽紅素產生的吸光度，OD10是樣品加入試劑I反應后測得的吸光度，OD27是樣品加入試劑II反應后測得的吸光度，SV是血清樣品的體積，R1V1是試劑I的體積，R11V11是試劑II的體積，F是校正因數。
2.根據權利要求I所述的血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法，其特征在于試劑I中含有鹽酸、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉及防腐劑。
3.根據權利要求I所述的血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法，其特征在于試劑II中僅含有二甲亞砜或者葡萄糖醛酸基轉移酶、或者咖啡因和苯甲酸鈉。
4.根據權利要求I所述的血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法，其特征在于試劑I中各組成成分為對氨基苯磺酸40 80mmol/L、鹽酸240 320mmol/L、亞硝酸鈉40 80mmol/L、Proclin 300 防腐劑 100μ I 300μ I。
5.根據權利要求I所述的血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法，其特征在于試劑II中僅有二甲亞砜(DMSO) 20 28mmol/L、Proclin 300 防腐劑 100μ I 300μ I。
6.根據權利要求I所述的血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法，其特征在于測定的體積比為樣品試劑I :試劑II = 3 7 120 180 30 70。
全文摘要
本發明公開了一種血清中間接膽紅素的雙試劑測定方法，屬于利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法。本發明的技術方案是重氮試劑在試劑I中，試劑II僅有加速劑有效成分，其測定方法為使用前試劑A與試劑B按20∶1體積比混合成試劑I，血清先與試劑I于37℃溫浴3～5分鐘，血清中直接膽紅素與反應液中氯化重氮苯磺酸反應生成偶氮膽紅素，再加入試劑II后于37℃溫浴4～7分鐘，間接膽紅素在加速劑的作用下，使間接膽紅素氫鍵破壞后與氯化重氮苯磺酸反應生成偶氮膽紅素。儀器在540～550nm波長處檢測，以試劑I反應產生的偶氮膽紅素為空白，由試劑II反應產生的偶氮膽紅素計算出間接膽紅素的含量。
文檔編號G01N21/31GK102944683SQ20121046003
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者李立和 申請人:李立和