基于免疫的血清型a肉毒桿菌毒素活性測定的制作方法

專利名稱：：基于免疫的血清型a肉毒桿菌毒素活性測定的制作方法基于免疫的血清型A肉毒桿菌毒素活性測定本申請為分案申請，其原申請的申請日為2009年3月13日，申請號為200980117157.X(國際申請號PCT/US2009/037046)，名稱為“基于免疫的血清型A肉毒桿菌毒素活性測定”。本專利申請根據35U.S.C.§119(e)，要求以2008年3月14日提交的美國臨時專利申請No.61/036，723作為優先權基礎，該臨時申請的全部內容均以援引的方式納入本文。梭菌毒素-例如肉毒神經毒素(BoNT)BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風神經毒素(TeNT)——抑制神經元傳遞的能力已經被用于多種治療和美容用途，參見例如，WilliamJ.Lipham,CosmeticandClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack、Inc.,2004)。市售的梭菌毒素藥物組合物包括BoNT/A制劑，例如，BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine,CA),DYSPORT/RELOXIN(IpsenLtd.,Slough,England)、PtJRTOX!)(MentorCorp.,SantaBarbara,CA)、XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.，Frankfurt,Germany)、NEIJRONOX'(Medy-ToxjInc.,Ochang-myeon,SouthKorea)和BTX-A(Biogen-techLtd.,University,Yantai,Shandong,China)；以及BoNT/B制劑，例如MYOBLOC/NEUROBLOC(SolsticeNeurosciences,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)。例如，BOTOX*.目前已被美國批準用于在成年人中治療頸肌張力障礙以減輕與頸肌張力障礙有關的異常頭位和頸痛的嚴重度；用于治療外用劑不恰當處理的嚴重原發性腋部多汗癥；以及用于治療與張力障礙相關的斜視和瞼痙攣，包括年齡在12歲和以上的患者中的良性原發性瞼痙攣或VII神經病癥。現在，一種致死試驗小鼠LD5tl生物測定仍是所有藥物制造商用于表示其制劑效能的“黃金標準”。S.S.Arnonetal.,JAMA285:1059-1070(2001)事實上，藥物制劑標簽上的單位是小鼠LD5tl單位，并且產生統計學可用的LD5tl數據需要的動物數目是很大的。小鼠LD5tl生物測定的優點是，它測量對肉毒毒素攝取(例如，毒素結合于細胞表面受體、毒素-受體復合體內化、輕鏈易位至細胞質、底物的輕鏈剪切)所必需的所有步驟，而不只是對此中毒過程的一部分測定活性，例如僅測量輕鏈酶活的體外測定。不幸的是，小鼠LD5tl生物測定有許多缺點，包括由于需要大量實驗動物所導致的高操作成本，因為所有BoNT血清型都會引起相同的可測量終點而造成的無特異性，以及如果不使用大量動物的不準確的可能性。另外，動物權利組織已經向美國(FDA/NICEATM/1CCVAM)和歐洲(MHRA和EDQM)的監管機構以及制造肉毒神經毒素制品的制藥公司施壓，以減少動物試驗并且一更重要地一替換用于產品發布的小鼠LD5tl生物測定。監管機構要求制藥公司將三“R”原則應用于肉毒桿菌神經毒素的效能試驗減少(Reduce)、精簡(Refine)、替換(Replace)。D.Straughan，ProgressinApplyingtheThreeRstothePotencyTestingofBotulinumToxinTypeA，Altern.Lab.Anim.34(3):305-313(2006)。在最近幾年中，已經釆取了數項措施來減少和精簡小鼠LD5ci生物測定，目的是標準化方案以及在每次測定中使用更少的動物產生更一致的數據。因此，可以評估肉毒桿菌毒素攝取中必需的所有步驟的完整性的簡單、可靠、經驗證且政府機構可接受的肉毒毒素活性測定將會有重要價值，因為這種不基于動物的測定將減少對動物試驗的需求以及與這類基于動物的測定相關的所有缺點、成本和倫理問題。本說明書提供了測定可用于在多個產業例如制藥業和食品工業中的肉毒桿菌毒素A的活性的新型組合物、細胞和方法，并且還提供了相關的優點。這些組合物、細胞和方法不使用活動物或者取自活動物的組織，但能夠評估對神經毒素作用所必需的所有步驟。圖I為中樞和周圍神經元中的神經遞質釋放和梭菌毒素中毒的現行范例的示意圖。圖IA為中樞和周圍神經元中的神經遞質釋放機制的示意圖。所述釋放過程可被描述為包括兩個步驟1)囊泡停靠，其中含有神經遞質分子的囊泡上的與囊泡結合的SNARE蛋白和位于質膜上的與膜結合的SNARE蛋白相結合；和2)神經遞質釋放，其中囊泡與質膜相融合并以胞吐方式釋放神經遞質分子。圖IB為破傷風毒素和肉毒毒素在中樞和周圍神經元中活動的中毒機制的示意圖。這一中毒過程可被描述為包括四個步驟1)受體結合，其中梭菌毒素與梭菌受體復合體相結合并啟動中毒過程；2)復合體內化，其中在毒素結合之后，含有毒素/受體系統復合體的囊泡被胞吞至細胞內；3)輕鏈易位，其中認為發生了多個事件，包括囊泡內部pH的改變、包含梭菌毒素重鏈的Hn結構域的通道孔的形成、梭菌毒素輕鏈和重鏈的分離以及輕鏈的釋放；和4)酶促靶標修飾，其中梭菌毒素的輕鏈對其靶標SNARE底物(例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白)進行蛋白酶解剪切，由此阻止囊泡停靠和神經遞質釋放。圖2示出了通過蛋白質印跡分析對4種細胞系中的BoNT/A攝取的比較。圖2A示出了基于用于處理所述細胞系的BoNT/A的量檢測到的SNAP-25剪切產物的曲線圖。在SigmaPlot中使用4參數邏輯模型分析了這些數據，并獲得了每種細胞系的EC5tl值。檢測到的SNAP-25剪切產物信號的排序是SiMaNeuro-2a>LAl-55n>PC12。圖2B示出了對所述測定計算的300pM對OpM以及I.2pM對OpM的原始信號的信噪比。SiMa細胞產生了最高信噪比和最低EC5tl值。圖3示出了對已建立細胞系的細胞分化培養基的優化，所述細胞系可用于本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法。圖4示出了對已建立細胞系包含的細胞的細胞分化時間的優化，所述細胞系可用于本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法。圖5示出了對已建立細胞系包含的細胞的BoNT/A處理的優化，所述細胞系可用于本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法。結果表明，任一試驗的BoNT/A處理均獲得了小于2pM的EC5tl。圖6示出了本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法的靈敏度。結果表明，細胞對BoNT/A的攝取花不到I分鐘，然后產生相對背景顯著量的SNAP-25剪切產物。圖7示出了本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法特異性。結果表明，本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法可以測量BoNT/A中毒中包括的所有步驟。圖8示出了使用本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法用BoNT/A復合體處理的分化SiMa細胞的劑量反應曲線。圖9示出了使用本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法對制成制劑的BoNT/A藥物產品進行基于免疫的BoNT/A活性測定的結果。圖10示出了使用本說明書中公開的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法中和人血清中的a-BoNT/A抗體的檢測。具體實施例方式本說明書提供了用于測定樣品中是否存在活性BoNT/A以及用于測定BoNT/A制劑的活性/效能的新型測定。本說明書中公開的基于細胞的新型測定倚賴能夠使所述測定檢測樣品中皮摩爾量的BoNT/A的細胞、試劑和檢測方法。本說明書中公開的基于細胞的新型測定減少了對動物毒性研究的需求，但仍可用于分析有關BoNT/A的多種功能，即毒素的結合和細胞攝取，易位至細胞胞質溶膠，以及蛋白酶活性。如下文進一步討論的，所述新型方法和組合物可以用于分析粗樣品和大量樣品以及高度純化的雙鏈毒素和制成制劑的毒素產品，并且還可以適用于自動高通量測定形式。因此，本說明書中公開的一個方面提供了用于產生a-SNAP-25抗體的組合物，所述抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。組合物可包含佐劑和這樣的組成，即所述組成包含SNAP-25抗原、連接于SNAP-25抗原的載體或者連接于與SNAP-25抗原連接的柔性間隔物的載體，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體之間。可想象的是，可觸發產生a-SNAP-25抗體——該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的免疫反應的任一和所有SNAP-25抗原都可用作SNAP-25抗原，非限制地包括源自天然SNAP-25的SNAP-25抗原、源自非天然SNAP-25的SNAP-25抗原和包含天然或非天然SNAP-25的免疫反應性片段的SNAP-25抗原。可用于產生a-SNAP-25抗體——該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的SNAP-25抗原非限制地包括包含連接于載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25肽的SNAP-25抗原，非限制地包括SEQIDN0:38。用于制備a-SNAP-25抗體——該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的其他組合物非限制地包含這樣的組成，即該組成包含連接于與具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原連接的柔性連接體的載體，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體之間。可想象的是，任一和所有佐劑都可用于這類組合物中，非限制地包括聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)、聚乙烯醇(PVA)、完全和不完全弗氏佐劑。本說明書中公開的另一方面提供了生產a-SNAP-25抗體的方法，該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。該方法的一些方面包括以下步驟(a)給予動物本說明書中公開的組合物；(b)從所述動物采集包含a-SNAP-25抗體或產生a-SNAP-25抗體的細胞的樣品；和(C)從所述樣品分離所述a-SNAP-25抗體。所公開方法可用于制備a-SNAP-25單克隆抗體或a-SNAP-25多克隆抗體，所述單克隆抗體和多克隆抗體都可以結合含有SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位。本說明書中公開的又一方面提供a-SNAP-25抗體——該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。除了包括單克隆a-SNAP-25抗體或多克隆a-SNAP-25抗體之外，這類a-SNAP-25抗體還包括天然和非天然抗體。可用作a-SNAP-25抗體——該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的單克隆a-SNAP-25抗體非限制地包括雜交瘤細胞系1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2產生的單克隆a-SNAP-25抗體。本說明書中公開的再一方面提供了檢測BoNT/A活性的方法。該方法的一些方面包括步驟(a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A中毒是敏感的；(b)從所述處理的細胞分離包含在BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；(c)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；和(d)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；其中通過所述抗體-抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A活性。步驟c的a-SNAP-25抗體可任選地連接于固相支持物。本說明書中公開的再一方面提供了檢測BoNT/A活性的方法。該方法的一些方面包括步驟(a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞可攝取BoNT/A；(b)從所述處理的細胞分離包含在BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25組分；(c)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；和(d)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；其中通過所述抗體-抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A活性。步驟c的a-SNAP-25抗體可任選地連接于固相支持物。本說明書中公開的又一方面提供了檢測哺乳動物中的BoNT/A免疫抗性的方法。該方法的一些方面包括步驟(a)將BoNT/A添加至從被測試a-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動物獲得的試驗樣品中；(b)用所述試驗樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A中毒是敏感的；(c)從所述處理的細胞分離包含在BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；(d)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；(e)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；(f)以陰性對照樣品代替試驗樣品重復步驟a-e;和(g)將步驟(e)中檢測到的抗體-抗原復合體的量與步驟(f)中檢測到的抗體-抗原復合體的量對比，其中與步驟(f)中檢測到的抗體-抗原復合體的量相比，步驟(e)中檢測到的抗體-抗原復合體的較低量的檢測結果指示α-ΒοΝΤ/Α中和抗體的存在。步驟d的a-SNAP-25抗體可任選地連結于固相支持物。除了陰性對照樣品之外，步驟f中的對照樣品還可包括陽性對照樣品。由肉毒桿菌(Clostridiumbotulinum)、破傷風桿菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)產生的梭菌毒素非常廣泛地用于人和其他哺乳動物的治療性和美容性治療中。肉毒梭菌(C.botulinum)菌株產生七種具有不同抗原性的肉毒毒素(BoNT)血清型，它們通過研究人中(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F)和動物中(BoNT/Cl和BoNT/D)的肉毒菌中毒的發生而被識別；或從土壤中分離得到(BoNT/G)。雖然全部七種肉毒毒素血清型都具有相似的結構和生物學性質，但每一種也表現出不同特征，例如不同的藥理學性質。與之相反，破傷風毒素(TeNT)由唯一的破傷風梭菌(C.tetani)群產生。其他兩種梭菌-巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)——還產生分別與BoNT/F和BoNT/E類似的毒素。每種梭菌毒素都被翻譯成大約150kDa的單鏈多肽，該單鏈多肽隨后通過以下方式被剪切由天然蛋白酶例如內源性梭菌毒素蛋白酶或環境中產生的天然蛋白酶在二硫環內進行蛋白酶解切斷。該翻譯后加工產生雙鏈分子，該分子包含通過單個二硫鍵和非共價相互作用而連在一起的大約50kDa的輕鏈(LC)和大約IOOkDa的重鏈(HC)。每種成熟的雙鏈分子均包括三個功能上不同的結構域1)酶促結構域，位于LC上，含有具有鋅依賴性的內肽酶活性的金屬蛋白酶區域，可特異性地靶向于神經遞質釋放機構的核心組件；2)易位結構域，位于HC的氨基端一側(HN)，它促進LC從細胞內的囊泡中釋放至靶細胞的胞質中；和3)結合結構域，位于HC的羧基端一側(Hc)，它決定毒素與位于靶細胞表面的受體復合體的結合活性和結合特異性。這三個功能性結構域的結合活性、易位活性和酶促活性都是對毒性所必需的。雖然尚未精確地獲知這一過程中的所有細節，但不管是何種血清型或亞型，梭菌毒素進入神經元并抑制神經遞質釋放的總的細胞中毒機制是類似的。雖然本申請并不希望被下列描述所限制，但是該中毒機制可被描述為包括至少四個步驟1)受體結合；2)復合體內化；3)輕鏈易位；和4)酶促靶向修飾(見圖I)。這一過程開始于梭菌毒素的Hc結構域與位于靶細胞的質膜表面的毒素特異性受體系統的結合。受體復合體的結合特異性部分地來自于似乎獨特地構成每種梭菌毒素受體復合體的蛋白受體和神經節苷脂的特定組合。一旦結合，所述毒素/受體復合體通過胞吞作用內化，內化的囊泡被分派至特定胞內途徑。易位步驟似乎是通過囊泡區室的酸化而被引發的。這一過程似乎可以啟動重要的依賴于PH的結構重排，所述結構重排增加疏水性、促進孔隙形成并有利于毒素的重鏈和輕鏈分開。一旦分開，毒素的輕鏈內肽酶從胞內的囊泡釋放至胞質溶膠中，在此它似乎能特異性地靶向神經遞質釋放機構的核心組件。這些核心蛋白為囊泡相關膜蛋白(VAMP)/突觸小泡蛋白、25kDa的突觸體相關蛋白(SNAP-25)和突觸融合蛋白，它們是突觸囊泡在神經末梢上停靠和融合所必需的蛋白，并且它們都屬于可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)家族的成員。BoNT/A和BoNT/E剪切SNAP-25的羧基端區域，分別釋放九個氨基酸或二十六個氨基酸的片段，BoNT/Cl也剪切SNAP-25靠近羧基端的區域，釋放八個氨基酸的片段。肉毒毒素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風毒素作用于VAMP的保守中心部分，并使得VAMP的氨基端部分釋放至胞質溶膠中。BoNT/Cl剪切突觸融合蛋白中接近細胞質膜表面的單個位點。突觸SNARE蛋白被選擇性地蛋白酶解使得梭菌毒素可以在體內阻斷神經遞質釋放。對于在多種非神經元類型細胞中的胞吐作用，梭菌毒素的SNARE蛋白靶標是相同的；和在神經元中一樣，在這些細胞中，輕鏈的肽酶活性抑制胞吐作用，參見例如，YannHumeauetal.,HowBotulinumandTetanusNeurotoxinsBlockNeurotransmitterRelease，82(5)Biochimie.427-446(2000)；KathrynTurtonetal.,BotulinumandTetanusNeurotoxins:Structure,FunctionandTherapeuticUtility,27(11)TrendsBiochem.Sci.552-558.(2002)；GiovannaLallietal.,TheJourneyofTetanusandBotulinumNeurotoxinsinNeurons,11(9)TrendsMicrobiol.431-437，(2003)。本公開的一些方面部分地包括一種用于產生a-SNAP-25抗體的組合物，該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。本公開的另一些方面部分地包括一種用于產生a-SNAP-25抗體的誘導免疫反應的組合物，該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。本文中使用的“誘導免疫反應的組合物”是指一種包含SNAP-25抗原的組合物，當所述組合物被給予動物時可刺激對所述SNAP-25抗原的免疫反應，從而產生a-SNAP-25抗體——該抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。術語“免疫反應”是指動物免疫系統對誘導免疫反應的組合物的任何應答。示例性免疫反應包括但不限于局部的和全身的以及細胞的體液免疫，例如CTL應答，包括CD8+CTL的抗原特異性誘導；輔助T細胞應答，包括T細胞增殖應答和細胞因子釋放；以及B細胞應答，包括例如抗體產生應答。術語“誘導免疫反應”是指給予誘導免疫反應的組合物或者編碼所述誘導免疫反應的組合物的多核苷酸，這時免疫反應被影響，即被刺激、被啟動或者被誘導。組合物包含SNAP-25抗原。本文使用的術語“抗原”是指誘發免疫反應的分子，非限制地包括肽、多糖和脂質綴合物例如脂蛋白和糖脂。本文使用的術語“SNAP-25抗原”是指可誘發免疫反應的在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的任意抗原。在誘導免疫反應的組合物中使用的SNAP-25抗原必須大至足以在序列上基本是獨特的，從而降低產生與SNAP-25之外的抗原交叉反應的抗體的可能性。另外，在誘導免疫反應的組合物中使用的SNAP-25抗原必須小至足以基本上僅觸發對在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的免疫反應，從而增加產生將在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25與在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25區分開的a-SNAP-25抗體的可能性。再者，還非常希望以高產率生成單一氨基酸序列的a-SNAP-25抗體，所述抗體的選擇性是可以再現的，并且以滿足要求的親合力結合，以使得可設計高度靈敏的測定。存在于SNAP-25中的BoNT/A剪切位點周圍的序列表示為P5_P4_P3_P2_P1_p/-P2’-P/-P/-P5^WP1-P/代表所述易切斷鍵。在被BoNT/A剪切時，所形成的剪切產物包括包含P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包含P/-p2，-p/-p/-P5’的片段。因此，本文使用的術語“在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25”是指將所述P1殘基作為其羧基端氨基酸的任意SNAP-25。例如，人SNAP-25(SEQIDN0:5)Q197-R198代表所述BoNT/A剪切位點的P1-P/易切斷鍵。照此，“具有所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25”將為在其羧基端氨基酸位置上具有谷氨酰胺的任意SNAP-25剪切產物，這里所述谷氨酰胺代表所述易切斷鍵的Q197。又例如，石紋電鰩(Torpedomarmorata)SNAP-25(SEQIDNO:16)的K2tl4-H2tl5代表所述BoNT/A剪切位點的P1-P/易切斷鍵。照此，“具有所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端賴氨酸的SNAP-25”將為在其羧基端氨基酸位置上具有賴氨酸的任意SNAP-25剪切產物，這里所述賴氨酸代表所述易切斷鍵的K2tl4。可以將在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原進行修飾，以增強如下物質的免疫原性SNAP-25抗原、半抗原或者當未修飾時有免疫原性、無免疫原性或有弱免疫原性的任何其他抗原性化合物。在該實施方案的一個方面中，SNAP-25抗原的易切斷鍵的羧基端P1殘基可以被羧化。羧化可以在兩方面增加需要的SNAP-25抗原的免疫原性質。第一，因為帶電荷的氨基酸可增強免疫原性，所以將COO-基團添加至所述羧基端殘基將會增加SNAP-25抗原的總體免疫原性。第二，因為所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基在剪切時處于帶電荷狀態，所以將COO-基團添加至所述羧基端殘基將會更好地模擬這樣的實際抗原，即該抗原是本說明書中公開的a-SNAP-25抗體被設計以結合的。在該實施方案的一個方面中，SNAP-25抗原的氨基端殘基可通過添加適于將所述SNAP-25抗原連接于載體蛋白的氨基酸進行修飾，所述載體蛋白例如鑰孔慽血藍蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(multipleattachmentpeptide,MAP)。例如,可以將半胱氨酸殘基放置在氨基端，以綴合所述載體蛋白KLH。因此，在一個實施方案中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原的長度可以為例如至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25或至少30個氨基酸。在另一實施方案中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1S基處含有羧基端的SNAP-25抗原的長度可以為例如至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25或至多30個氨基酸。在又一實施方案中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原可以為例如7-12個氨基酸、10-15個氨基酸或13-18個氨基酸。在另一實施方案中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDN0:32。在該實施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的？:殘基處含有羧基端的所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:147或SEQIDNO:148。在又一實施方案中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDN0:38。仍在另一實施方案中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDN0:39。在該實施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42,SEQIDNO:43或SEQIDNO:44。在又一實施方案中，在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:45。可想象的是，觸發產生a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的免疫反應的任一和所有SNAP-25抗原都可以用作SNAP-25抗原。因此，包括SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41,SEQIDNO:42,SEQIDNO:43,SEQIDNO:44,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的氨基酸序列變體可用作觸發產生a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的免疫反應的SNAP-25抗原。10因此，在一個實施方案中，SNAP-25抗原可相對包括SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDN0:41、SEQIDN0:42、SEQIDN0:43、SEQIDNO:44,SEQIDN0:147或SEQIDNO:148的SNAP-25抗原具有至少I個、至少2個、至少3個、至少4個或至少5個氨基酸的置換、缺失或添加。在又一實施方案中，SNAP-25抗原與包括SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39,SEQIDNO:40、SEQIDNO:41,SEQIDNO:42,SEQIDNO:43,SEQIDNO:44,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的SNAP-25抗原可以有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一I"生。可想象的是，一種或多種載體可連接于SNAP-25抗原，目的是增強當未與所述載體締合時有免疫原性、無免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。非限制性實例包括，例如鑰孔慽血藍蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。如本領域中公知的，可以通過將無抗原性或弱抗原性的抗原偶聯于載體而使所述抗原有抗原性。用于將抗原偶聯于載體的多種其他載體和方法是本領域中公知的。參見，例如Harlow和Lane，見上文，1998a；Harlow和Lane,見上文，1998b;以及Davidff.Waggoner,Jr.等人，Immunogenicity-enhancingcarriersandcompositionsthereofandmethodsofusingthesame,美國專利公開文本No.20040057958(2004年3月25日)。表位還可以通過將所述表位作為融合蛋白表達而生成。用于表達多肽融合物的方法是本領域技術人員公知的，例如記載于Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999)中。由于所述SNAP-25抗原的羧基末端必須是所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基，因此載體必須連接于所述SNAP-25抗原的氨基端。可想象的是，一個或多個柔性間隔物可連接于SNAP-25抗原，目的是增強當未與所述柔性連接體締合時有免疫原性、無免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。柔性間隔物可增加所述SNAP-25抗原的總肽長度并提供柔性，從而有利于所述SNAP-25抗原正確地呈遞于所述免疫細胞。一個非限制性實例是，組合物可包含這樣的SNAP-25抗原，即該抗原連接于串聯的一個或多個柔性間隔物以將SNAP-25抗原更好地呈遞于免疫細胞，從而有利于所述免疫反應。由肽構成的柔性間隔物的長度為至少I個氨基酸，并且包含具有小側鏈R基團的不帶電荷氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或絲氨酸。因此，在一個實施方案中，柔性間隔物的長度可以為例如至少I個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個氨基酸。在另一個實施方案中，柔性間隔物的長度可以為例如至少I個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個或至多10個氨基酸。在又一個實施方案中，柔性間隔物的長度可以為例如1-3個氨基酸、2-4個氨基酸、3-5個氨基酸、4-6個氨基酸或5_7個氨基酸。柔性間隔物的非限制性實例包括例如G間隔物如GGG、GGGG(SEQIDNO:55)和GGGGS(SEQIDNO:56)或者A間隔物如AAA、AAAA(SEQIDNO:57)和AAAAV(SEQIDNO:58)。柔性間隔物在閱讀框內連接于所述SNAP-25抗原成為融合蛋白。如上文詳述的，柔性間隔物部分地用于增加所述SNAP-25抗原的總體肽長度。例如，5-10個氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接3_5個氨基酸的柔性間隔物而增加其總長度。再例如，5-10個氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接4_6個氨基酸的柔性間隔物而增加其總長度。再例如，5-10個氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接7-10個氨基酸的柔性間隔物而增加其總長度。再例如，7-12個氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接1-3個氨基酸的柔性間隔物而增加其總長度。再例如，7-12個氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接4-個6氨基酸的柔性間隔物而增加其總長度。由所述柔性間隔物提供的長度增加使得可選擇較小大小的SNAP-25抗原，從而增加所述SNAP-25抗原基本上僅觸發對在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的免疫反應的可能性，因此增加產生將在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25與在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25區分開的a-SNAP-25抗體的可能性。可想象的是，本說明書中公開的組合物可任選地包含本說明書中公開的SNAP-25抗原和一種或多種佐劑。本文使用的術語“佐劑”在述及SNAP-25組合物時是指可增加或改變對SNAP-25抗原的免疫反應的任何物質或物質混合物。佐劑可以例如用于減少免疫次數或者保護性免疫需要的抗原量。佐劑在誘導免疫反應的組合物中的用途是公知的。使用這些佐劑的主要目的是使得所述免疫反應增加。非限制性佐劑包括例如脂質體、油相，非限制性地包括弗氏類型的佐劑，例如弗氏完全佐劑(FCA);弗氏不完全佐劑(FIA);皂苷元糖苷如皂苷；聚羧乙烯；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(通常稱為胞壁酰二肽或“MDP”)；以及脂多糖(LPS)。這類佐劑通常以與水相形成的乳劑的形式使用，或者更通常地可由不溶于水的無機鹽組成。這些無機鹽可包括例如氫氧化鋁、硫酸鋅、氫氧化鐵膠體、磷酸鈣或氯化鈣。氫氧化鋁(Al(OH)3)是一種常用的佐劑。當前，FDA批準在人中使用的佐劑只有鋁鹽(Alum)，所述鋁鹽用于通過沉淀所述抗原而“貯藏”抗原。上面提供的佐劑僅僅是示例性的。事實上，任何佐劑都可以用于本說明書中公開的SNAP-25組合物中，條件是所述佐劑滿足誘導免疫反應的必要特征。本說明書中公開的載體也可以作為佐劑。具體的佐劑以及制備和使用方法公布于例如Guptaetal.Vaccine,11:993-306,1993；Arnon,R.(Ed.)SyntheticVaccines1:83-92,CRCPress,Inc.,BocaRaton,Fla.,1987；和Davidff.Waggoner,Jr.etal.,Immunogenicity-EnhancingCarriersandcompositionsThereofandMethodsofUsingtheSame，美國專利公開文本No.20040057958(Mar.25，2004)中。另外的佐劑包括"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"(eds.Powell,M.F.andNewman,M.J.)PharmaceuticalBiotechnology,Volume6,PlenumPress(NewYork)第7章(第141-227頁)中描述的任意化合物。來自該概論的實例包括胞壁酰二肽(MDP)和Montanide720。分子例如聚肌苷胞嘧啶(PolyI:C)或包含CpG基序的質粒DNA也可作為佐劑與封裝在微粒中的抗原組合給藥。再例如，所述佐劑是一種有利于所述抗原性化合物進入細胞胞質中的試劑，例如李斯特菌素、鏈球菌溶血素或它們的混合物。因此，在一個實施方案中，SNAP-25組合物包含連接于載體肽的具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原。在該實施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDN0:147或SEQIDN0:148。在該實施方案的另一方面中，SNAP-25抗原1包括SEQIDN0:38。在該實施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。在另一實施方案中，SNAP-25組合物包含連接于載體肽的具有羧化羧基端賴氨酸的SNAP-25抗原。在該實施方案的一些方面中，具有羧化羧基端賴氨酸的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:39,SEQIDN0:40、SEQIDN0:41、SEQIDN0:42、SEQIDN0:43或SEQIDN0:44。在該實施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDN0:45。在該實施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。仍在另一實施方案中，SNAP-25組合物包含連接于一個或多個柔性連接體和載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體肽之間。在該實施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37,SEQIDN0:147或SEQIDN0:148。在另一實施方案中，SNAP-25抗原包括SEQIDN0:46。在該實施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)0在該實施方案的一些方面中，所述柔性連接體為G間隔物或A間隔物。在又一實施方案中，SNAP-25組合物包含連接于柔性連接體和載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體肽之間。在該實施方案的一些方面中，具有羧化羧基端賴氨酸的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,SEQIDNO:42、SEQIDN0:43或SEQIDN0:44。在該實施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDN0:47。在該實施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。在該實施方案的一些方面中，所述柔性連接體為G間隔物或A間隔物。本公開的一些方面部分地包括用于生產a-SNAP-25抗體的方法，所述抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可通過本領域中熟知的多種方法制備。檢測和測量抗體結合特異性、結合親和性及結合親合力，以及制備和使用抗體的具體方案是本領域中已知的。參見，例如ANTIB0DIES:ALABORATORYMANUAL(EdwardHarlow&DavidLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1998a);和USINGANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL:PORTABLEPROTOCOLNo.I(EdwardHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998b)；MolecularCloning,ALaboratoryManual,2001以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,2004；DavidAndersonetal.,TherapeuticPolypeptides,NucleicAcidsEncodingSame,andMethodsofUse,美國專利7，034，132(2005年4月25日)；以及BeatrizM.Carrenoetal.,AntibodiesAgainstCTLA4，美國專利7，034，121(2006年4月25日)。作為非限制性實例，a-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可通過用本說明書中公開組合物的一種或多種注射劑注射動物如兔、山羊、小鼠或另一種哺乳動物而制備。作為另一非限制性實例，a-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可通過用本說明書中公開組合物的一種或多種注射劑注射卵如雞的卵而制備。免疫動物中的抗體效價可通過標準技術隨時間監測，例如通過使用固定抗原的酶聯免疫吸附測定(ELISA)或基于細胞的活性測定。根據需要，可以將a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的多克隆抗體從所述哺乳動物中(例如從血液中)分離并通過公知的技術例如為獲得IgG部分的蛋白A親和色譜法，或者通過對用于產生所述抗體的肽的親和純化進行進一步純化。作為另一個非限制性實例，a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結合在來自SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可使用雜交瘤方法產生。參見，例如MonoclonalAntibodies,pp.196-244，Harlow&Lane,見上文，1998a的第6章；和GrowingHybridomas,pp.245-282,Harlow&Lane,見上文，1998a的第7章；以及Goding,pp.59-103，MonoclonalAntibodies!PrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)。在該方法中，一般將宿主動物如小鼠、倉鼠或其他合適宿主動物暴露于本說明書中公開SNAP-25抗原的一種或多種注射劑，以誘發產生或者能夠產生a-SNAP-25抗體——該抗體會特異性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25——的淋巴細胞。免疫動物中的抗體效價可通過標準技術隨時間監測,例如通過使用固定抗原的酶聯免疫吸附測定(ELISA)或基于細胞的活性測定。或者，可以使用合適的培養細胞系在體外免疫所述淋巴細胞。在免疫后合適的時間，例如當抗體效價最高時，從所述動物分離產生抗體的細胞。一般而言，如果需要人源的細胞則可使用外周血淋巴細胞，如果需要非人哺乳動物來源則可使用脾細胞或淋巴結細胞。使用合適的融合試劑如聚乙二醇將所分離的產生抗體的細胞與一種永生化細胞系融合，以形成雜交瘤細胞。永生化細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類動物、牛和人源的骨髓瘤細胞。一般將鼠科動物骨髓瘤細胞系與從恰當免疫的小鼠中采集的脾細胞融合，以產生所述雜交瘤。優選的永生化細胞系是對含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT)的培養基敏感的小鼠骨髓瘤細胞系。多種骨髓瘤細胞系的每一種均可根據標準技術用作融合伴侶，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤細胞系。然后使用HAT培養基——其殺死未融合的和非增殖性融合的骨髓瘤細胞(未融合的脾細胞在培養數日后死亡，因為它們是未轉化的)一來選擇融合形成的雜交瘤細胞。然后，可以對培養所述雜交瘤細胞的培養基檢測a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的存在情況。例如，可以在免疫沉淀測定、體外結合測定例如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)中，或者在基于細胞的活性測定中，使用a-SNAP-25陽性培養基篩查雜交瘤上清液。這類技術和測定是本領域中已知的。參見，例如Harlow&Lane,見上文，1998a的第11章Immunoprecipitation,第421-470頁；Harlow&Lane,見上文,1998a的第12章Immunoblotting,第471-510頁；Harlow&Lane,見上文，1998a的第14章Immunoassays,第553-612頁。然后可進行另外的研究，以確定所述抗體是否還對在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25無反應性。還可例如通過Scatchard分析確定a-SNAP-25單克隆抗體的結合親和性。參見,例如PeterJ.MunsonandDavidRodbard,LigandAVersatileComputerizedApproachForCharacterizationofLigand-BindingSystems,107(I)Anal.Biochem.220-239(1980)。在鑒定出需要的雜交瘤細胞后，使用有限稀釋步驟來分離源自單個細胞的克隆，直至獲得表達需要的單克隆抗體的克隆細胞系。選擇那些對在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25有足夠的選擇性并以足夠高的親合力結合的抗體，用于進一步表征和研究。用于制備a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的另一可選方法是通過用SNAP-25肽和分離的免疫球蛋白文庫成員——該成員可結合在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25——篩查重組組合免疫球蛋白文庫如抗體噬菌體展示文庫。用于生成和篩查曬菌體展示文庫的試劑盒可市購，例如RecombinantPhageAntibodySystem(AmershamGEHealthcare,Piscataway,NJ)；和SurfZAPPhageDisplayKit(Stratagene,LaJolla,CA)。另外,用于生成和篩查抗體展示文庫的方法和試劑的實例可以見于例如Ladner等人，美國專利5，223,409;Borrebaeck等人，美國專利5，712，089；Griffiths等人，美國專利5，885，793!Griffiths等人，美國專利5，962，255；McCafferty等人，美國專利5,969，108!Griffiths等人,美國專利6，010,884Jespers等人,美國專利6，017，732；Borrebaeck等人，美國專利6，027，930Johnson等人，美國專利6，140，471；McCafferty等人,美國專利6，172，197,上述每一篇均通過援引的方式全文納入本文。本公開的一些方面部分地包括，采集包含a-SNAP-25抗體或產生a-SNAP-25抗體的細胞的樣品。本文使用的術語“包含a-SNAP-25抗體或產生a-SNAP-25抗體的細胞的樣品”是指包含或者可能包含至少一種a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的任何生物物質。可想象的是，可包含a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的任一和所有樣品都可用于該方法中，非限制地包括血液、血漿、血清和淋巴液。還可想象的是，能夠產生a-SNAP-25抗體-該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位一的任何細胞都可用于該方法中，所述細胞非限制地包括CD8細胞、CTL細胞、輔助T細胞和B細胞。多種公知的方法可用于從個體中采集包含所述a-SNAP-25抗體或產生a-SNAP-25抗體的細胞的樣品，參見，例如Harlow&Lane,見上文，1998a;和Harlow&Lane，見上文，1998b。類似地，多種公知的方法可用于加工樣品，以分離a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。可基于待分離的抗體的類型選擇用于采集樣品的方法。作為一個非限制性實例，當分離a-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——時，合適的樣品可以是包含這類a-SNAP-25抗體的血液樣品，而當分離a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——時，合適的樣品可以是產生a-SNAP-25抗體的細胞，例如脾細胞或雜交瘤細胞。本公開的一些方面部分地包括從所述樣品中分離a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。分離這類a-SNAP-25抗體例如a-SNAP-25多克隆抗體或a-SNAP-25單克隆抗體的方法是本領域技術人員公知的，所述a-SNAP-25多克隆抗體和a-SNAP-25單克隆抗體均可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。參見，例如HarlowandLane,見上文，1998a;和HarlowandLane,見上文，1998b。例如，可通過公知的技術從所述樣品中分離這類a-SNAP-25多克隆抗體，所述技術例如使用蛋白A或蛋白G的親和色譜法，該方法主要提供免疫血清的IgG部分。隨后或者另外，可以將特異性SNAP-25抗原固定于柱上或磁珠上，以通過免疫親和色譜法來純化a-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。可通過常規的免疫球蛋白純化方法從培養基或腹水液中分離a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位，所述常規免疫球蛋白純化方法例如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和色譜法。因此，在一個實施方案中，一種生產a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的方法包括步驟(a)給予動物包含連接于載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的組合物；(b)從所述動物中采集包含a-SNAP-25抗體或產生a-SNAP-25抗體的細胞的樣品；和(C)從所述樣品分離所述a-SNAP-25抗體組分。在該實施方案的一個方面中，所述a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是多克隆抗體。在該實施方案的另一方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是單克隆抗體。在該實施方案的又一方面中，產生的a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是IgG亞型。在該實施方案的其他方面中，SNAP-25組合物還包含佐劑，例如聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。在另一實施方案中，一種生產a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的方法包括步驟(a)給予動物包含連接于柔性連接體和載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的組合物，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25肽和所述載體肽之間；(b)從所述動物采集包含a-SNAP-25抗體或產a-SNAP-25抗體的細胞的樣品；和(C)從所述樣品分離所述a-SNAP-25抗體。在該實施方案的一個方面中，所述a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是多克隆抗體。在該實施方案的另一方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是單克隆抗體。在該實施方案的又一方面中，產生的a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是IgG亞型。在該實施方案的其他方面中，SNAP-25組合物還包含佐劑，例如聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。本公開的一些方面部分地包括一種分離的a-SNAP-25抗體，該抗體可選擇性地16結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。本文中使用的術語“分離的”是指通過人的介入從分子的天然環境中分離分子。本文使用的“抗體”是指由免疫系統生成的分子，該分子通過應答特定抗原而產生并可特異性地結合于該抗原，抗體包括天然抗體和非天然抗體。本文使用的術語“a-SNAP-25”與“SNAP-25抗體”同義，是指可結合于SNAP-25抗原的抗體。例如，抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙功能抗體、細胞相關抗體如Ig受體、線式抗體、雙鏈抗體或微抗體一只要所述片段表現出需要的生物活性一以及它們的單鏈衍生物。抗體可以是包含Vh和'區以及輕鏈恒定區(CJ和重鏈恒定區CH1、Ch2和Ch3的全長免疫球蛋白分子，或者全長免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如Fab片段、F(ab')2片段、Fe片段、Fd片段或Fv片段。抗體可源自于任何脊椎動物物種(例如人、山羊、馬、驢、鼠科動物、大鼠、兔或雞)，并且可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或亞類(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。對天然抗體、非天然抗體和它們的抗原性化合物結合片段的結構的一般性公開，參見例如PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994);Borrabeck,AntibodyEngineering,第2版(OxfordUniversityPress1995),以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。天然抗體通常是約150，000道爾頓的異四體糖蛋白，由兩條相同輕(L)鏈和兩條相同重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接于重鏈，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈中的二硫鍵的數目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變區(VH)，隨后是多個恒定區。每條輕鏈在一端具有一個可變區(')，在其另一端具有一個恒定區。所述輕鏈的恒定區與所述重鏈的第一個恒定區對齊，所述輕鏈的可變區與所述重鏈的可變區對齊。特定的氨基酸殘基被認為形成了所述輕鏈和重鏈可變區之間的界面。完整的抗原識別和抗原結合位點位于抗體可變區內，即Fv片段。該片段包括緊密非共價締合的一個重鏈可變區(Vh)和一個輕鏈可變區的二聚體。每個區包含4個主要采取β片層構型的骨架區(FR)，這些框架區由3個超變區連接，所述超變區形成連接所述β片層結構的環，并且在一些情形下形成所述β片層結構的一部分。每個超變區包含對應于互補決定區(⑶R)的氨基酸序列。總之，是所述6個⑶R區的三維構型界定了所述Vh-'二聚體表面上的賦予抗原結合特異性的抗原結合位點。參見，例如CyrusChothiajetal.，ConformationsofImmunoglobulinHypervariableRegions,Nature342(6252):877-883(1989);ElvinA.KabatjetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)，以上每一篇通過援引的方式全文納入本文。抗體恒定區并不直接參與抗體抗原結合，但呈現多種效應物功能，例如使抗體參與抗體依賴的細胞毒性。靶抗原通常具有一個或多個結合位點，也稱為表位，它們可被CDR形成的抗原結合位點識別。本文中使用的“表位”與“抗原決定簇”同義，是指能夠特異性地結合于免疫球蛋白或T細胞受體或者以另外的方式與一個分子相互作用的靶抗原上的位點，所述靶抗原例如肽、多糖或包含脂質的分子。特異性地結合于不同表位的每種抗體均具有不同結構。17因此，一種抗原可以具有多于一種對應的抗體。多克隆抗體是指異質的抗體分子群，包含至少2種能夠結合于特定抗原的抗體。根據定義，多克隆抗體包括結合至少兩種不同表位的兩種不同抗體。本文使用的術語“單克隆抗體”或“多個單克隆抗體”是指基本同質的抗體分子群，僅包含一種能夠結合特定抗原的抗體，即除了可能微量存在的可能的天然突變之外，該群包含的各個抗體是相同的。根據定義，單克隆抗體結合于單一表位。單克隆抗體是高度特異的，針對單一抗原性位點。再者，與多克隆抗體不同，每種單克隆抗體均針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體的優點還在于，它們可不被其他抗體污染地合成。修飾語“單克隆的”是指從基本同質的抗體群獲得的抗體特征，而不可解釋為需要以任何具體方法生產所述抗體。例如，可根據本公開使用的單克隆抗體可通過雜交瘤方法制備，該方法首先被Kohleretal(1975)Nature256:495記載，或者可通過重組DNA方法制備(參見，例如美國專利No.4，816，567;美國專利No.5，807，715)。還可使用例如Clacksonetal(1991)Nature,352:624-628;Marksetal(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597中記載的技術從噬菌體抗體文庫分離所述單克隆抗體。因此，在一個實施方案中，a-SNAP-25抗體包含重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vl),該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25。在該實施方案的一個方面中，所述重鏈可變區(Vh)為SEQIDNO:72,SEQIDNO:74,SEQIDNO:76,SEQIDN0:80或SEQIDN0:82。在該實施方案的另一方面中，所述輕鏈可變區為SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90或SEQIDN0:92。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體包含重鏈可變區(Vh)⑶Rl區、⑶R2區、⑶R3區或它們的任意組合，該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25。在該實施方案的一個方面中，所述重鏈可變區(Vh)CDRI為SEQIDNO:93,SEQIDNO:94,SEQIDNO:95,SEQIDNO:118,SEQIDNO:119或SEQIDNO:120。在該實施方案的另一方面中，所述重鏈可變區(VH)CDR2區是SEQIDNO:96,SEQIDN0:97、SEQIDNO:98,SEQIDNO:99,SEQIDN0:121、SEQIDNO:122或SEQIDNO:123。仍在該實施方案的另一方面中，所述重鏈可變區(Vh)CDR3區是SEQIDNO:100,SEQIDNO:10USEQIDNO:102或SEQIDNO:124。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體包含輕鏈可變區(Vj⑶Rl區、⑶R2區、⑶R3區或它們的任意組合，該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25。在該實施方案的一個方面中，所述輕鏈可變區(\)CDRl區是SEQIDN0:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDN0:107、SEQIDNO:125、SEQIDNO:126、SEQIDNO:127、SEQIDN0:128或SEQIDNO:129。在該實施方案的另一方面中，所述輕鏈可變區(八)CDR2區是SEQIDNO:108,SEQIDNO:109,SEQIDNO:110、SEQIDNO:111或SEQIDNO:112。仍在該實施方案的另一方面中，所述輕鏈可變區(Vl)CDR3區是SEQIDNO:113、SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116或SEQIDNO:117。仍在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體特異性地結合在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的表位。在該實施方案的一個方面中，所述表位包括SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDN0:147或SEQIDN0:148。在該實施方案的一個方面中，所述表位包括SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,SEQIDNO:42,SEQIDN0:43或SEQIDN0:44。如上文詳述的，存在于SNAP-25中的BoNT/A剪切位點周圍的序列表示為P5-P4-P3-P2-P1-P/-P2，-P/-P/-P5^WP1-P/代表所述易切斷鍵。在被BoNT/A剪切時，所形成的剪切產物包括包含P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包含P/-p2’-p3’-p4’-p5’的片段。本文使用的術語“a-SNAP-25抗體——該抗體可結合在SNAP-25剪切產物的所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端”是指這樣的a-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結合于包含所述P5-P4-P3-P2-P1序列的任何SNAP-25剪切產物片段，但不結合于包含所述P/-P2，-P3，-P4，-P5’序列的任何SNAP-25剪切產物片段或者具有BoNT/A剪切位點的完整P1-P/易切斷鍵的任何SNAP-25。本文使用的術語“a-SNAP_25197抗體”是指這樣的抗體，即該抗體可選擇性地結合于具有對應于SEQIDNO:5的谷氨酰胺197的羧基端P1殘基的SNAP-25。本文使用的術語“a-SNAP-25204抗體”是指這樣的抗體，即該抗體可選擇性地結合于具有對應于SEQIDNO:16的賴氨酸204的羧基端P1殘基的SNAP-25。本文使用的術語“選擇性地”是指具有獨特的效應或影響，或者僅以一種方式或者僅與一種物質反應。本文使用的術語“選擇性地結合”在述及抗體時是指所述抗體與指定靶表位的區分性結合，結果是所述抗體基本不與非靶表位交叉反應。本文定義的肽表位的最小大小是約5個氨基酸,肽表位一般包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20個氨基酸。肽表位可以是不連續的，即它包含在肽一級結構上不相鄰、但通過所述肽的二級、三級或四級結構集合成表位的氨基酸殘基。再者，還應指出，表位可能包含氨基酸序列之外的分子部分，例如碳水化合物部分、脂質部分如脂蛋白或糖脂，或者化學修飾的氨基酸部分如磷酸化的氨基酸。在該實施方案的一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——可選擇性地結合包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20個氨基酸的在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——可選擇性地結合包含至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多15或至多20個氨基酸的在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。選擇性結合包括諸如結合親和性、結合特異性和結合親合力的結合性質。參見DavidJ.King,ApplicationsandEngineeringofMonoclonalAntibodies,pp.240(1998)。結合親和性是指抗體停留在其表位結合位點的時長，可以看作是抗體結合其表位的強度。結合親和性可以描述為抗體的平衡解離常數(KD)，該常數定義為平衡時的Kd/Ka比。其中Ka是抗體的締合速率常數，kd是抗體的解離速率常數。結合親和性由締合和解離共同決定，僅高締合或低解離都不能確保高親和性。所述締合速率常數(Ka)或結合速率常數(Kon)測量每單位時間結合事件的數目，或者抗體和抗原可逆地締合成其抗體-抗原復合體的傾向性。締合速率常數以M^1s-1表示，用符號表示如下[Ab]X[Ag]XKon。締合速率常數越大，抗體結合于其抗體越快，或者抗體和抗原之間的結合親和性越大。解離速率常數(Kd)或分離速率常數(KofT)測量每單位時間解離事件的數目，或者抗體-抗原復合體可逆地分離(解離)成其組分分子(即抗體和抗原)的傾向性。解離速率常數以s—1表示，用符號表示如下[Ab+Ag]XKofT。解離速率常數越小，抗體越牢固地結合于其抗原，或者抗體和抗原之間的結合親和性越大。平衡解離常數(KD)測量平衡時形成的新抗體-抗原復合體的與抗體-抗原復合體解離速率相等的速率。平衡解離常數以M表示，定義為Koff/Kon=[Ab]X[Ag]/[Ab+Ag]，其中[Ab]是抗體的摩爾濃度，[Ag]是抗原的摩爾濃度，[Ab+Ag]是抗體-抗原復合體的摩爾濃度，其中所有濃度都是這些組分在體系平衡時的濃度。平衡解離常數越小，抗體越牢固地結合于其抗原，或者抗體和抗原之間的結合親和性越大。因此，在一個實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有例如小于IXIO5IT1S'小于1\106]\^8'小于1\107]^或者小于1Χ108Μ的締合速率常數。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有例如大于IXIO5M-1S'大于IXIO6M-1S'大于IXIOIV1或者大于1Χ108Μ的締合速率常數。在另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有IXIO5M-1S^1-IXIO8MWIX106ΜXIO8MWIXIO5M-1S^1-IXIO7ITV1或IXIO6M-1S^1-IXIO7M-1S-1的締合速率常數。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有小于IX10、'小于IXKT4iT1或小于IXKT5iT1的解離速率常數。在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有例如小于I.OXKT4s'小于2.OX104S\小于3.OX104S\小于4.OX104S\小于5.OX104S\小于6.OX104S\小于7.OXιοΛτ1、小于8.OXιοΛτ1或小于9.OXKT4iT1的解離速率常數。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有例如大于IXKT3s'大于IXKT4iT1或大于IXKT5iT1的解離速率常數。在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有例如大于I.OXΙΟΛΓ1、大于2.OXΙΟΛΓ1、大于β.ΟΧΙΟ、1、大于‘.ΟΧΙΟ、1、大于δ.ΟΧΙΟ、1、大于Θ.ΟΧΙΟ、1、大于7.0x104s1、大于8.OXKT4iT1或大于9.OXKT4iT1的解離速率常數。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有小于0.500nM的平衡解離常數。在該實施方案的一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有例如小于0.500nM、小于0.450nM、小于0.400nM、小于0.350nM、小于0.300nM、小于0.250nM、小于0.200nM、小于0.150nM、小于0.IOOnM或小于0.050nM的平衡解離常數。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有大于O.500nM的平衡解離常數。在該實施方案的一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合親和性可以具有例如大于O.500nM、大于O.450nM、大于O.400nM、大于O.350nM、大于O.300nM、大于O.250nM、大于O.200nM、大于O.150nM、大于O.IOOnM或大于O.050nM的平衡解離常數。仍在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對完整SNAP-25的結合親和性可以具有例如小于IXIOcT1s'小于IXIO1M-1S'小于IXΙΟ1、小于IXlO3M-1S-1或小于IXlO4M-1S-1的締合速率常數。在另一實施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對完整SNAP-25的結合親和性可以具有例如至多IXKAf1S'至多IXIO1M-1s'至多IXIO2M-1s'至多IXIO3M-1S-1或至多IXIO4M-1S-1的締合速率常數。結合特異性是抗體區分包含其表位的分子和不包含該表位的分子的能力。一種測量結合特異性的方式是比較抗體對于包含其表位的分子的Kon締合速率與抗體對于不包含該表位的分子的Kon締合速率。例如，比較a-SNAP-25抗體對在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位與對不含該表位的SNAP-25的締合速率常數(Ka)，所述不含該表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25表位，或者具有BoNT/A剪切位點的完整P1-P/易切斷鍵的SNAP-25表位。在該實施方案的一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對不包含其表位的SNAP-25具有例如小于IXIOcT1S'小于IXIO1IT1S'小于IXIO2IT1S'小于1Χ103Μ或小于IXlO4M4iT1的締合速率常數(Ka)。在該實施方案的其他方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對不包含其表位的SNAP-25具有例如至多IXKAf1s'至多IXIO1M-1S'至多IXIO2M-1S—1、至多IXIO3MY1或至多IXlO4M-1S-1的締合速率常數(Ka)。在該實施方案的再一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對其表位具有相對于對不包含該表位的SNAP-25例如至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍的締合速率常數(Ka)。在該實施方案的又一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對其表位具有相對于對不包含該表位的SNAP-25例如至少10倍、至少100倍、至少1，000倍或至少10，000倍的締合速率常數(Ka)。仍在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對其表位具有相對于對不包含該表位的SNAP-25例如至多I倍、至多2倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍或至多9倍的締合速率常數(Ka)。仍在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對其表位具有相對于對不包含該表位的SNAP-25例如至多10倍、至多100倍、至多1，000倍或至多10，000倍的締合速率常數(Ka)。a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結合特異性還可表征為a-SNAP-25抗體可以區分其SNAP-25表位與不包含該表位的SNAP-25的這樣一個比值，所述不含該表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25表位或者具有BoNT/A剪切位點的完整P1-P/易切斷鍵的SNAP-25表位。在該實施方案的一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對其SNAP-25表位與對不包含該表位的SNAP-25具有例如至少2:I、至少3:I、至少4:I、至少5:I、至少64:I、至少7:I、至少8:I、至少9:1、至少10:I、至少15:I、至少20:I、至少25:I、至少30:I、至少35:1或至少40:1的結合特異性比。仍在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對其SNAP-25表位與對在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25具有例如至少2:I、至少3:I、至少4:I、至少5:I、至少6:I、至少7:I、至少8:I、至少9:I、至少10:I、至少15:I、至少20:I、至少25:I、至少30:I、至少35:1或至少40:1的結合特異性比。又在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對其SNAP-25表位與對具有BoNT/A剪切位點的完整P1—P/易切斷鍵的SNAP-25具有例如至少2:I、至少3:I、至少4:1、至少5:1、至少64:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:I、至少15:1、至少20:1、至少25:I、至少30:I、至少35:1或至少40:1的結合特異性比。結合親合力(也稱為功能性親和性)是指多價抗體和其抗原之間的功能性結合強度的總和。抗體分子可以具有不止一個結合位點(例如IgG有2個，IgM有10個)，并且許多抗原包含不止一個抗原性位點。雖然抗體的結合親合力取決于各個抗體結合位點的結合親和性，但結合親合力大于結合親和性，因為要完全解離抗體必須使所有抗體-抗原相互作用同時斷裂。可想象的是，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——可選擇性地結合于該抗體相應的任一和所有表位。因此，在一個實施方案中，a-SNAP-25抗體是這樣的a-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。在該實施方案的一些方面中，a-SNAP-25抗體是這樣的a-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結合于具有羧基端谷氨酰胺的SNAP-25表位，或者可選擇性地結合于具有羧基端賴氨酸的SNAP-25表位。在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體是這樣的a-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結合于具有對應于SEQIDNO:5的谷氨酰胺197的羧基端P1殘基的SNAP-25表位，或者可選擇性地結合于具有對應于SEQIDNO:16的賴氨酸204的羧基端？1殘基的SNAP-25表位。又在該實施方案的另一些方面中，a-SNAP-25抗體是這樣的a-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結合于具有SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41,SEQIDNO:42,SEQIDNO:43,SEQIDNO:44,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的羧基端氨基酸序列的SNAP-25表位。本公開的一些方面部分地包括一種基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法。本說明書中公開的基于免疫的方法可通過數個參數進行評估，所述參數包括例如準確度、精度、檢出限(L0D)、定量限(L0Q)、范圍、特異性、選擇性、線性、耐用性和系統適用性。方法的準確度是分析方法的正確性的度量，或者測量值與通常公認的真實值或公認參考值之間相符的接近度。方法的精度是當將方法重復地應用于同質樣品的多次采樣時，各個試驗結果之間相符的程度。照此，精度可評估I)測定內變異性；2)日內變異性(重復性);和3)日間變異性(中間精度)；以及4)實驗室間精度(再現性)。變異系數(CV%)是相對于觀測或理論平均值表達的精度的定量量度。本說明書中公開的一種基于免疫的方法必須能夠檢測包含具有在BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的a-SNAP-25抗體-抗原復合體相對于背景的存在情況。方法的檢出限(LOD)是指開始給出明顯不同于陰性對照或空白對照的信號的分析物的濃度，代表可以與背景區分開的分析物的最低濃度。因此，在一個實施方案中，本說明書中公開的基于免疫的方法可以檢測其量明顯不同于陰性對照或空白對照的BoNT/A的L0D。在該實施方案的一個方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的BoNT/A的LOD。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、800pg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的BoNT/A的LOD。在該實施方案的又一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的BoNT/A的L0D。在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的L0D。仍在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的BoNT/A的LOD。在該實施方案的另一方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者InM或更少的BoNT/A的LOD。在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者IOOpM或更少的BoNT/A的L0D。在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者IOpM或更少的BoNT/A的LOD。仍在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOpM或更少的BoNT/A,9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者IpM或更少的BoNT/A的L0D。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOOfM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者IOOfM或更少的BoNT/A的LOD。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的LOD。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOfM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者IfM或更少的肉毒神經毒素A的L0D。定量限(LOQ)是可以以可接受的準確度和精度水平測量的樣品或樣本中的分析物的最低和最高濃度。定量下限是指檢測方法始終可以從背景中測量出的最低劑量。定量上限是指檢測方法在信號飽和之前始終可以測量出的最高劑量。所述方法的線性范圍是定量上限和下限之間的區域。線性范圍通過定量上限減去定量下限計算。本文使用的術語“下限的信噪比”是指所述方法在檢測下限檢出的信號除以背景信號。本文使用的術語“上限的信噪比”是指所述方法在檢測上限檢出的信號除以背景信號。因此，在一個實施方案中，本說明書中公開的基于免疫的方法可以檢測其量明顯不同于陰性對照或空白對照的BoNT/A的L0Q。在該實施方案的方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、800pg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的BoNT/A的L0Q。在該實施方案的又一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的BoNT/A的L0Q。在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOQ0仍在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的BoNT/A的LOQ。在該實施方案的另一方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者InM或更少的BoNT/A的LOQ。在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者IOOpM或更少的BoNT/A的LOQ0在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者IOpM或更少的BoNT/A的L0Q。仍在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOpM或更少的BoNT/A,9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者IpM或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOOfM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者IOOfM或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、2490fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOfM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者IfM或更少的BoNT/A的LOQ。可用于實施本公開的方法的一個方面的基于免疫的測定必須具有不超過50%的精度。在該實施方案的一些方面中，基于免疫的測定有不超過50%、不超過40%、不超過30%或者不超過20%的精度。在該實施方案的另一些方面中，基于免疫的測定有不超過15%、不超過10%或者不超過5%的精度。在該實施方案的另一些方面中，基于免疫的測定有不超過4%、不超過3%、不超過2%或者不超過1%的精度。可用于實施本公開的方法的一個方面的基于免疫的測定必須具有至少50%的準確度。在該實施方案的一些方面中，基于免疫的測定有至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的準確度。在該實施方案的另一些方面中，基于免疫的測定有至少85%、至少90%或至少95%的準確度。在該實施方案的另一些方面中，基于免疫的測定有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的準確度。本說明書中公開的基于免疫的方法必須具有統計上顯著的下限信噪比，和具有統計上顯著的上限信噪比。在該實施方案的一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如至少3:I、至少4:I、至少5:I、至少6:I、至少7:I、至少8:I、至少9:I、至少10:I、至少15:1或至少20:1的下限信噪比。在該實施方案的另一些方面中，基于免疫的方法具有例如至少10:I、至少15:I、至少20:I、至少25:I、至少30:I、至少35:I、至少40:I、至少45:I、至少50:I、至少60:I、至少70:I、至少80:I、至少90:I、至少100:I、至少150:I、至少200:I、至少250:I、至少300:I、至少350:I、至少400:I、至少450:I、至少500:I、至少550:1或至少600:1的上限信噪比。方法的特異性定義了所述方法為排除其他相關組分例如部分活性的分析物或無活性的分析物而測量目的分析物的能力。方法的選擇性描述了分析方法區分樣品中不同物質的能力。方法的線性是所述方法得出與所述樣品中分析物濃度成正比或者通過定義明確的數學變換而成比例的結果的能力。因此，在一個實施方案中，本說明書中公開的基于免疫的方法可以區分部分活化的BoNT/A與完全活化的BoNT/A，所述部分活化的BoNT/A具有例如70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少的完全活化BoNT/A的活性。所述方法的耐用性是在正常(但可變的)試驗條件下對相同樣品獲得的測試結果的再現性。方法的魯棒性是對所述方法不受方法參數的小而有意的改變影響的能力的量度，并提供了所述方法在正常使用中的可靠性的指示。因此，耐用性可評估不可避免的變化，而魯棒性可評估有意的改變。用耐用性和魯棒性評價的一般參數包括凍/融的影響、孵育時間、孵育溫度、試劑壽命、樣品制備、樣品保存、細胞傳代數、毒素批次、純化間變異和切刻(nicking)反應間變異。基于細胞的測定的魯棒性參數包括細胞庫(冷凍的開始、中期和終末)、細胞傳代水平、細胞接種密度、細胞原種密度(培養天數)、燒瓶中的細胞年齡(接種的等待時間)、孵育時間、不同的板、過量的血清和試劑來源。方法的系統適用性是通過分析參比標準確定隨時間的測定性能(包括試劑性能和儀器性能)。系統適用性在FDA指導中就以下事實進行了強調設備、電子器件、測定性能和待分析的樣品組成一個整合的系統。系統適用性可以通過平行性測試進行評估，也就是在將對數劑量相對于反應作圖時，參照的連續稀釋和樣品的連續稀釋應給出平行的曲線。本公開的一些方面部分地包括來自已建立細胞系的細胞。本文使用的術語“細胞”是指對由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的任何真核生物細胞，或者可以攝取BoNT/A的任何真核生物細胞。術語細胞涵蓋來自多種生物的細胞，例如鼠科動物細胞、大鼠細胞、豬細胞、牛細胞、馬細胞、靈長類細胞和人細胞；來自多種細胞類型的細胞，例如神經細胞和非神經細胞；并且可從異質細胞群、組織或生物體分離或者為它們的一部分。本文使用的術語“已建立細胞系”與“永生化細胞系”或“轉化細胞系”同義，是指從源自生物體、組織或器官來源的細胞群中選擇用于無限增殖的細胞的細胞培養物。根據定義，已建立細胞系排除了原代細胞的細胞培養物。本文使用的術語“原代細胞”是直接從新鮮組織或器官采集的細胞，不具備無限增殖的能力。已建立細胞系可以包括異質細胞群或均質細胞群。源自單細胞的已建立細胞系被稱為克隆細胞系。已建立細胞系可以是這樣的細胞系，即其細胞內源性地表達細胞進行全部細胞機制——藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結合、神經毒素/受體復合體的內化、BoNT/A輕鏈從細胞內囊泡至細胞質的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切-必需的所有組分。或者，已建立細胞系可以是這樣的細胞系，即其細胞已從外源導入至少一種對所述細胞進行全部細胞機制——藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結合、神經毒素/受體復合體的內化、BoNT/A輕鏈從細胞內囊泡至細胞質的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切一必需的組分。還要提及的是通過遺傳工程建立的細胞系，來自這種已建立細胞系的細胞可以表達例如外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2、外源性SNAP-25或者它們的任意組合。本公開的一些方面部分地包括一種來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞。本文使用的術語“對BoNT/A中毒敏感的細胞”、“對由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的細胞”或“來自對由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞”是指可以進行全部細胞機制一一藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結合、神經毒素/受體復合體的內化、BoNT/A輕鏈從細胞內囊泡至細胞質的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的細胞。根據定義，對BoNT/A中毒敏感的細胞必須表達或者被工程化以表達至少一種BoNT/A受體和至少一種SNAP-25底物。本文使用的術語“可以攝取BoNT/A的細胞”或“可以攝取BoNT/A的已建立細胞系包含的細胞”是指可以進行全部細胞機制一藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結合、神經毒素/受體復合體的內化、BoNT/A輕鏈從細胞內囊泡至細胞質的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的細胞。根據定義，可以攝取BoNT/A的細胞必須表達或者被工程化以表達至少一種BoNT/A受體和至少一種SNAP-25底物。因此，在一個實施方案中，來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A中毒是敏感的。在該實施方案的一些方面中，來自已建立細胞系的細胞對由例如約500pM或更少、約400pM或更少、約300pM或更少、約200pM或更少或者約IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞對由例如約90pM或更少、約80pM或更少、約70pM或更少、約60pM或更少、約50pM或更少、約40pM或更少、約30pM或更少、約20pM或更少或者約IOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。又在另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞對由例如約9pM或更少、約8pM或更少、約7pM或更少、約6pM或更少、約5pM或更少、約4pM或更少、約3pM或更少、約2pM或更少或者約IpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。仍在另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞對由例如約O.9pM或更少、約O.8pM或更少、約O.7pM或更少、約O.6pM或更少、約O.5pM或更少、約O.4pM或更少、約O.3pM或更少、約O.2pM或者約O.IpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。本文使用的術語“約”在修飾陳述項目、數目、百分數或條件的值時，是指所陳述項目、數目、百分數或條件的值加減百分之十的范圍。在另一實施方案中，已建立細胞系包含的細胞可以攝取BoNT/A。在該實施方案的一些方面中，已建立細胞系包含的細胞可以攝取例如約500pM或更少、約400pM或更少、約300pM或更少、約200pM或更少或者約IOOpM或更少的BoNT/A。在該實施方案的另一些方面中，已建立細胞系包含的細胞具有攝取約90pM或更少、約80pM或更少、約70pM或更少、約60pM或更少、約50pM或更少、約40pM或更少、約30pM或更少、約20pM或更少或者約IOpM或更少的BoNT/A的能力。還在另一些方面中，已建立細胞系包含的細胞具有攝取約9pM或更少、約8pM或更少、約7pM或更少、約6pM或更少、約5pM或更少、約4pM或更少、約3pM或更少、約2pM或更少或者約IpM或更少的BoNT/A的能力。仍在另一些方面中，已建立細胞系包含的細胞具有攝取約0.9pM或更少、約0.8pM或更少、約0.7pM或更少、約0.6pM或更少、約0.5pM或更少、約0.4pM或更少、約0.3pM或更少、約0.2pM或更少或者約0.IpM或更少的BoNT/A的能力。本公開的一些方面部分地包括BoNT/A。本文使用的術語“BoNT/A”與“血清型A肉毒神經毒素”或“A型肉毒桿菌神經毒素”同義，是指天然BoNT/A和非天然BoNT/A，除了包括約150kDa的BoNT/A神經毒素自身之外，還包括包含約150kDa的BoNT/A神經毒素和關聯的非毒素相關蛋白(NAP)的BoNT/A復合體。BoNT/A復合體的非限制性實例包括例如900-kDa的BoNT/A復合體、500_kDa的BoNT/A復合體、300_kDa的BoNT/A復合體。約150kDa的BoNT/A神經毒素的非限制性實例包括例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDN0:4。本文使用的術語“天然BoNT/A”是指通過天然過程產生的任何BoNT/A，非限制地包括從翻譯后修飾、可變剪接轉錄或自發突變產生的BoNT/A異型體(isoform);以及BoNT/A亞型，例如BoNT/AI亞型、BoNT/A2亞型、BoNT/A3亞型、BoNT/A4亞型和BoNT/A5亞型。天然BoNT/A非限制地包括SEQIDNO:KSEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDN0:4，或者從SEQIDNO:KSEQIDNO:2,SEQIDN0:3或SEQIDN0:4置換、缺失或添加例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個氨基酸而得到的序列。可市購的天然BoNT/A的藥物組合物非限制地包括BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine,CA)、DYSPORT/RELOXIN(IpsenLtd.,Slough,England)、PURTOX(MentorCorp.,SantaBarbara,CA)、XEOMIN*(MerzPharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)>NElJRONOX!)(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)或BTX-A。27本文使用的術語“非天然BoNT/A”是指其結構借助人的操作被修飾的任何BoNT/A，非限制地包括通過使用隨機誘變或合理設計的遺傳工程產生的氨基酸序列被改變的BoNT/A;或者通過體外化學合成產生的BoNT/A。非天然BoNT/A的非限制性實例記載于例如Steward,L.E.etal.,Post-translationalModificationsandClostridialNeurotoxins,美國專利7,223,577;Dolly,J.0.etal.,ActivatableClostridialToxins,美國專利No.7,419,676；Steward,L.E.etal.,ClostridialNeurotoxincompositionsandModifiedClostridialNeurotoxins,US2004/0220386；Steward,L.E.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTargetingCapabilitiesForEndogenousClostridialToxinReceptorSystems,美國專利公開文本No.2008/0096248;Steward,L.E.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithAlteredTargetingCapabilitiesForClostridialToxinTargetCells,美國專利公開文本No.2008/0161543；Steward,L.E.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells，美國專利公開文本No.2008/0241881中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。因此，在一個實施方案中，所要檢測的BoNT/A活性來自天然BoNT/A。在該實施方案的一些方面中，所要檢測的BoNT/A活性來自BoNT/A異型體或BoNT/A亞型。在該實施方案的一些方面中，所要檢測的BoNT/A活性來自SEQIDN0:USEQIDNO:2,SEQIDN0:3或SEQIDN0:4的BoNT/A。在該實施方案的另一些方面中，所要檢測的BoNT/A活性來自與SEQIDNO:I、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3或SEQIDNO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的BoNT/A。在該實施方案的另一些方面中，所要檢測的BoNT/A活性來自ΒΟΤΟΧκ)、DYSPORT/RELOXIN、PIJRTOXw,XEOMIN、NEURONOX或BTX-A。在另一實施方案中，所要檢測的BoNT/A活性來自非天然BoNT/A。在該實施方案的另一些方面中，所要檢測的BoNT/A活性來自與SEQIDN0:USEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A變體。在該實施方案的另一些方面中，所要檢測的BoNT/A活性來自相對于SEQIDNO:1、SEQIDNO:2,SEQIDN0:3或SEQIDN0:4具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多非連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A變體。仍在該實施方案的另一些方面中，所要檢測的BoNT/A活性來自相對于SEQIDNO:I、SEQIDNO:2,SEQIDN0:3或SEQIDN0:4具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A變體。本公開的一些方面部分地包括SNAP-25。本文使用的術語“SNAP-25”是指優先被BoNT/A剪切的天然SNAP-25或非天然SNAP-25。本文使用的術語“優先被......剪切”是指，BoNT/A對BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A對任何其他底物的剪切速率高至少I個數量級。在該實施方案的一些方面中，BoNT/A對BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A對任何其他底物的剪切速率高至少2個數量級、高至少3個數量級、高至少4個數量級或者高至少5個數量級。本文使用的術語“天然SNAP-25”是指通過天然過程產生的任何SNAP-25，非限制地包括從翻譯后修飾、可變剪接轉錄或自發突變產生的SNAP-25異型體，以及SNAP-25亞型。天然SNAP-25非限制地包括SEQIDNO:5,SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDN0:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDN0:23或SEQIDN0:24，或者從SEQIDNO:5,SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24置換、缺失或添加例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多氨基酸而得到的序列。本文使用的術語“非天然SNAP-25”是指其結構借助人的操作被修飾的任何SNAP-25,非限制地包括通過使用隨機誘變或合理設計的遺傳工程產生的SNAP-25;或者通過體外化學合成產生的SNAP-25。非天然SNAP-25的非限制性實例記載于例如Steward，L.E.etal.,FRETProteaseAssaysforClostridialToxins,美國專利7,332,567；Fernandez-Salasetal.,LipohilicDye-basedFRETAssaysforClostridialToxinActivity，美國專利公開文本2008/0160561，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。非天然SNAP-25可以從SEQIDNO:5,SEQIDNO:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDN0:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDN0:23或SEQIDNO:24置換、缺失或添加例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多氨基酸。因此，在一個實施方案中，SNAP-25是天然SNAP-25。在該實施方案的一些方面中，所述SNAP-25是SNAP-25異型體或SNAP-25亞型。在該實施方案的一些方面中，所述天然SNAP-25是SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDN0:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。在該實施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是與SEQIDNO:5,SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDN0:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一實施方案中，SNAP-25是非天然SNAP-25。在該實施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是與SEQIDNO:I、SEQIDNO:2,SEQIDN0:3或SEQIDN0:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在該實施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相對于SEQIDNO:5,SEQIDNO:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDN0:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多非連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在該實施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相對于SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:IUSEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。SNAP-25可以是內源性SNAP-25或外源性SNAP-25。本文使用的術語“內源性SNAP-25”是指天然存在于細胞中的SNAP-25，因為它天然地在所述細胞的基因組中被編碼，使得所述細胞固有地表達所述SNAP-25，而不需要外源SNAP-25或者編碼SNAP-25的外源遺傳物質。內源性SNAP-25的表達可以需要也可以不需要環境刺激例如細胞分化。根據定義，內源性SNAP-25只能是天然SNAP-25或其變體。例如，如下已建立細胞系表達內源性SNAP-25BE(2)-Ml7,Kelly、LAl_55n、N1E-115、N4TG3、N18、Neuro_2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。本文使用的術語“外源性SNAP-25”是指通過人的操作導入外源性SNAP-25或編碼SNAP-25的外源性遺傳物質而在細胞中表達的SNAP-25。外源性SNAP-25的表達可以需要也可以不需要環境刺激，例如細胞分化。作為一個非限制性實例，來自已建立細胞系的細胞可以通過SNAP-25的瞬時或穩定轉染而表達外源性SNAP-25。作為另一個非限制性實例，來自已建立細胞系的細胞可以通過SNAP-25的蛋白轉染而表達外源性SNAP-25。外源性SNAP-25可以是天然SNAP-25或其變體，或者非天然SNAP-2或其變體。因此，在一個實施方案中，來自已建立細胞系的細胞可表達內源性SNAP-25。在該實施方案的一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性SNAP-25是天然SNAP-25。在該實施方案的另一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性SNAP-25是SEQIDNO:5,SEQIDNO:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDN0:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDN0:2USEQIDNO:22,SEQIDN0:23或SEQIDN0:24。在該實施方案的再一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性SNAP-25是天然SNAP-25，例如SNAP-25異型體或SNAP-25亞型。在該實施方案的另一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性SNAP-25是與SEQIDNO:5,SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一實施方案中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達外源性SNAP-25。在該實施方案的一個方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達天然SNAP-25。在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:IUSEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15、SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。仍在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達天然SNAP-25，例如SNAP-25異型體或SNAP-25亞型。又在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達與SEQIDNO:5,SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDN0:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在該實施方案的另一方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達非天然SNAP-25。在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達與SEQIDN0:5、SEQIDNO:6,SEQIDN0:7、SEQIDNO:8,SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15、SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDN0:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達相對于SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDN0:23或SEQIDN0:24具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多非連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達相對于SEQIDN0:5、SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDN0:23或SEQIDN0:24具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。檢測BoNT/A底物在暴露于BoNT/A后的剪切的測定可用于評估細胞是否表達內源性或外源性SNAP-25。在這些測定中，SNAP-25剪切產物的生成會在BoNT/A處理后的表達SNAP-25的細胞中檢測到。成熟的試劑、條件和方案以及具體蛋白質印跡分析的非限制性實例可容易地獲自商業的供應商，非限制地包括AmershamBiosciences,Piscataway,NJ;Bio-RadLaboratories,Hercules,CA;PierceBiotechnology,Inc.，Rockford,IL;PromegaCorporation,Madison,WI，andStratagene，Inc.，LaJolla,CA。應理解的是，對SNAP-25剪切的這些測定和類似測定可用于鑒定表達內源性或外源性SNAP-25的細胞。作為非限制性實例，使用可識別BoNT/ASNAP-25剪切產物或者可識別剪切和非剪切兩種形式SNAP-25的抗體的蛋白質印跡分析可用于測定BoNT/A的攝取。可用于這些測定中的a-SNAP-25抗體實例非限制地包括a-SNAP-25小鼠單克隆抗體SMI-81(SternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville,MD)、小鼠a-SNAP-25單克隆抗體Cl71.I(SynapticSystems,Goettingen,Germany)>a-SNAP-25小鼠單克隆抗體Cl71.2(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、a-SNAP-25小鼠單克隆抗體SP12(Abeam,Cambridge,MA)、a-SNAP-25兔多克隆抗血清(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、a-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abeam,Cambridge,MA)和a-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma,StLouis,MO)。本公開的一些方面部分地包括一種BoNT/A受體。本文使用的術語“BoNT/A受體”是指以誘發BoNT/A中毒反應的方式優先與BoNT/A相互作用的天然BoNT/A受體或非天然BoNT/A受體。本文使用的術語“優選與......相互作用”是指BoNT/A對BoNT/A受體的平衡解離常數(KD)比BoNT/A對細胞表面的任何其他受體的平衡解離常數低至少一個數量級。所述平衡解離常數是一種測量BoNT/A-BoNT/A受體復合體可逆地分離(解離)成其組分分子(即BoNT/A和BoNT/A受體)的具體平衡常數類型，定義為KD=Ka/Kd(平衡時)。所述締合常數(Ka)定義為Ka=[C]/[L][R]，所述解離常數(KD)定義為Kd=[L][R]/[C]，其中[L]等于BoNT/A的摩爾濃度，[R]是BoNT/A受體的摩爾濃度，[C]是BoNT/A-BoNT/A受體復合體的摩爾濃度，并且所有濃度都是當系統平衡時這些組分的濃度。解離常數越小，BoNT/A與其受體的結合越牢固，或者BoNT/A和BoNT/A受體之間的結合親和性越大。在該實施方案的一些方面中，BoNT/A對BoNT/A受體的解離常數比BoNT/A對任何其他受體的解離常數低至少2個數量級、低至少3個數量級、低至少4個數量級或者低至少5個數量級。在該實施方案的另一些方面中，優先與BoNT/A受體相互作用的BoNT/A的結合親和性可以具有例如500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小或者IOOnM或更小的平衡解離常數(KD)。在該實施方案的另一些方面中，優先與BoNT/A受體相互作用的BoNT/A的結合親和性可以具有例如90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM,50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小或者IOnM或更小的平衡解離常數(KD)。本文使用的術語“誘發BoNT/A中毒反應”是指BoNT/A受體與BoNT/A相互作用以形成神經毒素/受體復合體并隨后使該復合體內化至細胞質中的能力。本文使用的術語“天然BoNT/A受體”是指通過天然過程產生的任何BoNT/A受體，非限制地包括通過翻譯后修飾、可變剪接轉錄或自發突變產生的BoNT/A受體異型體，以及BoNT/A受體亞型。天然BoNT/A受體非限制地包括成纖維細胞生長因子2(FGFR2)、成纖維細胞生長因子3(FGFR3)、突觸囊泡糖蛋白(SV2)和復合神經節苷脂如GTlb，例如以下文獻中描述的那些EsterFernandez-Salas,etal.,BotulinumToxinScreeningAssays,美國專利公開文本2008/0003240；EsterFernandez-Salas,etal.，BotulinumToxinScreeningAssays,美國專利公開文本2008/0182799;MinDongetal.,SV2istheProteinReceptorforBotulinumNeurotoxinA,Science(2006)；S.Mahrholdetal,TheSynapticVesicleProtein2CMediatestheUptakeofBotulinumNeurotoxinAintoPhrenicNerves,580(8)FEBSLett.2011-2014(2006)，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。天然FGFR2非限制地包括SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69和SEQIDNO:70，或者從SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDN0:67、SEQIDN0:68、SEQIDN0:69和SEQIDNO:70置換、缺失或添加例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多氨基酸而得到的序列。天然FGFR3非限制地包括SEQIDNO:25,SEQIDN0:26和SEQIDN0:27，或者從SEQIDNO:25,SEQIDN0:26和SEQIDNO:27置換、缺失或添加例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多氨基酸而得到的序列。天然SV2非限制地包括SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30和SEQIDNO:31，或者從SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30和SEQIDNO:31置換、缺失或添加例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多氨基酸而得到的序列。本文使用的術語“非天然BoNT/A受體變體”是指借助人的操作或設計產生的任何BoNT/A受體，非限制地包括通過使用隨機誘變或合理設計的遺傳工程產生的BoNT/A受體以及通過化學合成產生的BoNT/A受體。非天然BoNT/A變體的非限制性實例包括例如保守BoNT/A受體變體、非保守BoNT/A受體變體、BoNT/A受體嵌合變體和活性BoNT/A受體片段。本文使用的術語“非天然BoNT/A受體”是指其結構借助人的操作被改變的任何BoNT/A受體，非限制地包括通過使用隨機誘變或理性設計的遺傳工程產生的BoNT/A受體以及通過體外化學合成產生的BoNT/A受體。非天然BoNT/A變體的非限制性實例記載于例如EsterFernandez-Salas,etal.,BotulinumToxinScreeningAssays,美國專利公開文本2008/0003240；EsterFernandez-Salas,etal.,BotulinumToxinScreeningAssays,美國專利公開文本2008/0182799中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。非天然BoNT/A受體可以從SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65,SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68,SEQIDN0:69或SEQIDNO:70置換、缺失或添加例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更33多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多氨基酸。因此，在一個實施方案中，BoNT/A受體是天然BoNT/A受體，例如FGFR2、FGFR3或SV2。在該實施方案的一些方面中，所述BoNT/A受體是BoNT/A受體異型體或BoNT/A受體亞型。在該實施方案的一些方面中，所述天然BoNT/A受體是SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31,SEQIDNO:59、SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDN0:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69或SEQIDNO:70的天然BoNT/A受體。在該實施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是與SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDN0:3USEQIDN0:59、SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDN0:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受體。在另一實施方案中，BoNT/A受體是非天然BoNT/A受體，例如通過遺傳工程產生的FGFR2、通過遺傳工程產生的FGFR3或通過遺傳工程產生的SV2。在該實施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是與SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDN0:67、SEQIDNO:68,SEQIDN0:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受體。在該實施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是相對于SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68、SEQIDN0:69或SEQIDNO:70具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多非連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。仍在該實施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是相對于SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDN0:3USEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:6USEQIDN0:62、SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDN0:69或SEQIDNO:70具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。BoNT/A受體可以是內源性BoNT/A受體或外源性BoNT/A受體。本文使用的術語“內源性BoNT/A受體”是指在細胞中天然存在的BoNT/A受體，因為它天然地在所述細胞的基因組中被編碼，使得所述細胞固有地表達所述BoNT/A受體，而不需要外源的BoNT/A受體或編碼BoNT/A受體的外源遺傳物質。內源性BoNT/A受體的表達可以需要也可以不需要環境刺激，例如細胞分化或啟動子活化。例如，如下已建立細胞系可表達至少一種內源性BoNT/A受體BE(2)-M17、Kelly、LAl-55n、NlE-115、N4TG3、N18、Neuro-2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。內源性BoNT/A受體只能是天然BoNT/A受體或者其天然變體。本文使用的術語“外源性BoNT/A受體”是指通過經人的操作導入外源BoNT/A受體或編碼BoNT/A受體的外源遺傳物質在細胞中表達的BoNT/A受體。外源性BoNT/A受體的表達可以需要也可以不需要環境刺激，例如細胞分化或啟動子活化。作為非限制性實例，通過編碼BoNT/A受體例如FGFR2、FGFR3或SV2的多核苷酸分子的瞬時或穩定轉染，來自已建立細胞系的細胞可以表達一種或多種外源性BoNT/A受體。作為非限制性實例，通過所述BoNT/A受體例如FGFR2、FGFR3或SV2的蛋白轉染，來自已建立細胞系的細胞可以表達一種或多種外源性BoNT/A受體。外源性BoNT/A受體可以是天然BoNT/A受體或其天然變體，或者非天然BoNT/A受體或其非天然變體。因此，在一個實施方案中，來自已建立細胞系的細胞可表達內源性BoNT/A受體。在該實施方案的一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性BoNT/A受體是天然BoNT/A受體。在該實施方案的另一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性BoNT/A受體是SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30,SEQIDN0:3USEQIDNO:59,SEQIDN0:60,SEQIDN0:6USEQIDN0:62、SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68、SEQIDN0:69或SEQIDN0:70。在該實施方案的再一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性BoNT/A受體是天然BoNT/A受體，例如BoNT/A受體異型體或BoNT/A受體亞型。在該實施方案的另一些方面中，由來自已建立細胞系的細胞表達的內源性BoNT/A受體是與SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63、SEQIDNO:64,SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受體。在另一實施方案中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達外源性BoNT/A受體。在該實施方案的一個方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達天然BoNT/A受體。在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDN0:3USEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68,SEQIDN0:69或SEQIDNO:70的天然BoNT/A受體。仍在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達天然BoNT/A受體，例如BoNT/A受體異型體或BoNT/A受體亞型。又在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達與SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDNO:31,SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受體。在該實施方案的另一方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達非天然BoNT/A受體。在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達與SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30,SEQIDN0:31、SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDN0:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68,SEQIDN0:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受體。在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達相對于SEQIDNO:25,SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多非連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。仍在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達相對于SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29,SEQIDNO:30、SEQIDN0:3USEQIDNO:59,SEQIDNO:60,SEQIDN0:6USEQIDNO:62,SEQIDNO:63,SEQIDNO:64,SEQIDN0:65、SEQIDN0:66、SEQIDN0:67、SEQIDN0:68、SEQIDN0:69或SEQIDN0:70具有例如I個或更多、2個或更多、3個或更多、4個或更多、5個或更多、6個或更多、7個或更多、8個或更多、9個或更多、10個或更多、20個或更多、30個或更多、40個或更多、50個或更多或者100個或更多連續氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。在另一實施方案中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2或它們的組合。在該實施方案的一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達天然FGFR2、天然FGFR3、天然SV2或它們的任意組合。仍在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達非天然FGFR2、非天然FGFR3、非天然SV2或它們的任意組合。又在該實施方案的另一些方面中，來自已建立細胞系的細胞被瞬時或穩定地工程化以表達天然FGFR2或非天然FGFR2、天然FGFR3或非天然FGFR3、天然SV2或非天然SV2或者它們的任意組合。表達一種或多種內源性或外源性BoNT/A受體的細胞可以通過常規的方法包括毒素攝取的直接和間接測定進行鑒定。確定BoNT/A結合或攝取性質的測定可用于評估細胞是否表達BoNT/A受體。這類測定非限制地包括使用標記的BoNT/A例如[125I]BoNT/A、[1251]的交聯測定，參見，例如NorikoYokosawaetal.,BindingofClostridiumbotulinumtypeCneurotoxintodifferentneuroblastomacelllines,57(I)Infect.Tmmun.272-277(1989);NorikoYokosawaetal.,BindingofbotulinumtypeCl,DandEneurotoxinstoneuronalcelllinesandsynaptosomes,29(2)Toxicon261_264(1991);andTei-ichiNishikietal.,IdentificationofproteinreceptorforClostridiumbotulinumtypeBneurotoxininratbrainsynaptosomes,269(14)J.Biol.Chem.10498-10503(1994)。其他非限制性測定包括使用標記或非標記抗體檢測BoNT/A結合的免疫細胞化學測定，參見例如AtsushiNishikawaetal.，ThereceptorandtransporterforinternalizationofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinintoHT-29cells,319(2)Biochem.Biophys.Res.Commun.327-333(2004)；以及使用標記或非標記抗體檢測結合的毒素的免疫沉淀測定，參見例如YukakoFujinagaetal.,MolecularcharacterizationofbindingsubcomponentsofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinforintestinalepithelialcellsanderythrocytes,150(Pt5)Microbiology1529-1538(2004)。可用于這些測定的抗體非限制地包括選擇對抗BoNT/A的抗體；選擇對抗BoNT/A受體如FGFR2、FGFR3或SV2的抗體；以及/或者選擇對抗神經節苷脂如⑶la、⑶lb、⑶3、GQlb或GTlb的抗體。如果抗體被標記，那么分子的結合可以通過多種方式檢測，包括蛋白質印跡分析、抗體細胞位置的直接顯微鏡觀察、在洗滌步驟后對細胞或結合有底物的抗體的測量、流式細胞術、電泳或毛細管電泳、本領域技術人員公知的應用技術。如果抗體是未標記的，可應用標記的二級抗體來間接地檢測所述結合的分子，檢測可同標記的抗體那樣進行。應理解的是，確定BoNT/A攝取性質或特征的這些測定和類似測定可用于鑒定表達內源性或外源性BoNT/A受體的細胞。檢測暴露于BoNT/A后的分子釋放的測定還可用于評估細胞是否表達一種或多種內源性或外源性BoNT/A受體。在這些測定中，對分子釋放的抑制將出現于BoNT/A處理后的表達BoNT/A受體的細胞中。公知的測定包括測量對放射標記的兒茶酚胺從神經元釋放的抑制，例如[3H]去甲腎上腺素或[3H]多巴胺釋放，參見例如AFassioetal.,Evidenceforcalcium—dependentvesiculartransmitterreleaseinsensitivetotetanustoxinandBotulinumToxintypeF，90(3)Neuroscience893-902(1999)；和SaraStiglianietal.,ThesensitivityofcatecholaminereleasetoBotulinumToxinClandEsuggestsselectivetargetingofVesiclessetintothereadilyreleasabIepool，85(2)J.Neurochem.409-421(2003);或者使用焚光測定量方法測量兒荼酌■胺釋放，參見，例如AntondePaivaetal.，ArolefortheinterchaindisulfideoritsparticipatingthiolsintheinternalizationofbotulinumNeurotoxinArevealedbyatoxinderivativethatbindstoecto-acceptorsandinhibitstransmitterreleaseintracellularly,268(28)J.Biol.Chem.20838-20844(1993)；GaryW.Lawrenceetal.,Distinctexocytoticresponsesofintactandpermeabilisedchromaffincellsaftercleavageofthe25—kDasynaptosomal-associatedprotein(SNAP-25)orsynaptobrevinbyBotulinumToxinAorB，236(3)Eur.J.Biochem.877-886(1996)和；PatrickForanetal.，BotulinumNeurotoxinClcleavesbothsyntaxinandSNAP—25inintactandpermeabilizedchromaffincells:correlationwithitsblockadeofcatecholaminerelease,35(8)Biochemistry2630-2636(1996)0其他非限制性實例包括測量對激素從內分泌細胞例如垂體前葉細胞或卵巢細胞釋放的抑制的測定。應理解的是，對于分子釋放的這些測定和類似測定可用于鑒定表達內源性或外源性BoNT/A受體的細胞。檢測暴露于BoNT/A后對BoNT/A底物的剪切的測定還可以用于評估細胞是否表達一種或多種內源性或外源性BoNT/A受體。在這些測定中，BoNT/A底物剪切產物的生成或完整BoNT/A底物的消失可在BoNT/A處理后的表達BoNT/A受體的細胞中檢測到。成熟的37試劑、條件和方案以及具體蛋白質印跡分析的非限制性實例可容易地獲自商業的供應商，非限制地包括AmershamBiosciences,Piscataway,NJ;Bio-RadLaboratories,Hercules,CA;PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL;PromegaCorporation,Madison,WI,andStratagene,Inc.，LaJolla,CA。應理解的是，用于BoNT/A底物剪切的這些測定或類似測定可用于鑒定表達內源性或外源性BoNT/A受體的細胞。作為非限制性實例，使用識別BoNT/ASNAP-25剪切產物或者剪切和非剪切兩種形式的SNAP-25的抗體的蛋白質印跡分析可以用于測定BoNT/A的攝取。用于這些測定的a-SNAP-25抗體的實例非限制地包括a-SNAP-25小鼠單克隆抗體SMI-81(SternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville,MD)、小鼠a-SNAP-25單克隆抗體Cl71.I(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、a-SNAP-25小鼠單克隆抗體Cl71.2(SynapticSystems,Goettingen,Germany)>a-SNAP-25小鼠單克隆抗體SP12(Abeam,Cambridge,MA)、a-SNAP-25兔多克隆抗血清(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、a-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma,St.Louis,MO)和a-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abeam,Cambridge,MA)。本公開的方面可提供這樣的細胞，即這種細胞通過遺傳操作或重組工程化制備以表達外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性BoNT/A受體。用于通過遺傳操作或重組工程化表達外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性BoNT/A受體的細胞包括可以表達或者不表達內源性SNAP-25和/或一種或多種內源性BoNT/A受體的神經元細胞和非神經元細胞。還應理解的是，這類遺傳操作的或重組工程化的細胞可在組成型、組織特異性、細胞特異性或誘導型啟動子元件和/或增強子元件的控制下表達外源性SNAP-25和一種或多種外源性BoNT/A受體。應理解的是，可以使用任何細胞，條件是所述細胞可被遺傳操作或者被重組工程化以表達外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性BoNT/A受體，并且能夠發生BoNT/A中毒。用于向細胞導入編碼對細胞進行全部細胞機制一藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物如SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的組分的外源性多核苷酸分子的方法非限制地包括化學介導的遞送方法，例如磷酸鈣介導的遞送方法、二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖介導的遞送方法、脂質介導的遞送方法、聚乙烯亞胺(PEI)介導的遞送方法、聚賴氨酸介導的遞送方法和聚凝胺介導的遞送方法；物理介導的遞送方法，例如基因槍、顯微注射、原生質體融合和電穿孔；以及病毒介導的遞送方法，例如反轉錄病毒介導的轉染，參見例如IntroducingClonedGenesintoCulturedMammalianCells,pp.16.1-16.62(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001)；AlessiaColosimoetal.,TransferandExpressionofForeignGenesinMammalianCells,29(2)Biotechniques314-318，320-322，324(2000)；PhilipWashbourne&A.KimberleyMcAllister，TechniquesforGeneTransferintoNeurons,12(5)Curr.Opin.Neurobiol.566-573(2002);和CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,pp9.16.4-9.16.11(2000)，它們的每一篇均通過援引的方式全文納入本文中。本領域技術人員可以理解的是，對將多核苷酸分子導入細胞的具體方法的選擇將部分地依賴于所述細胞是否會瞬時或穩定地包含對所述細胞進行全部細胞機制——藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的組分。編碼對細胞進行全部細胞機制——藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的組分的多核苷酸分子的非限制性實例如下SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2多核苷酸分子；SEQIDNO:139、SEQIDNO:140或SEQIDNO:141的FGFR3多核苷酸分子；SEQIDNO:142、SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2多核苷酸分子；以及SEQIDNO:145或SEQIDNO:146的SNAP-25多核苷酸分子。化學介導的遞送方法是本領域普通技術人員公知的，并且記載于例如MartinJordan&FlorianWorm,TransfectionofAdherentandSuspendedCellsbyCalciumPhosphate,33(2)Methods136-143(2004);ChunZhangetal.，PolyethylenimineStrategiesforPlasmidDeliverytoBrain-DerivedCells,33(2)Methods144-150(2004)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。這類化學介導的遞送方法可以通過標準步驟進行并且有市售，參見例如CellPhectTransfectionKit(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)；MammaIianTransfectionKit,CalciumphosphateandDEAEDextranj(Stratagene,Inc.,LaJolla,CA)；LipofectamineTransfectionReagent(Invitrogen,Inc.，Carlsbad,CA)；ExGen500Transfectionkit(Fermentas，Inc.，Hanover,MD)，以及SuperFectandEffecteneTransfectionKits(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)物理介導的遞送方法是本領域普通技術人員公知的，并且記載于例如JeikeE.Biewengaetal.，Plasmid-MediatedGeneTransferinNeuronsusingtheBiolisticsTechnique,71(I)J.Neurosci.Methods.67-75(1997)；John0，Brien&SarahC.R.LummisjBiolisticandDiolisticTransfection:UsingtheGeneGuntoDeliverDNAandLipophilicDyesintoMammalianCellsj33(2)Methods121-125(2004)；M.Golzioetal.,InVitroandInVivoElectricField-MediatedPermeabilizationjGeneTransfer，andExpression,33(2)Methods126-135(2004)；和OliverGreschetal.,NewNon-ViralMethodforGeneTransferintoPrimaryCllsj33(2)Methods151-163(2004)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。病毒介導的遞送方法是本領域普通技術人員公知的，并且記載于例如ChooiM.Laietal.,AdenovirusandAdeno-AssociatedVirusVectors,21(12)DNACellBiol.895-913(2002);IlyaFrolovetal.,Alphavirus-BasedExpressionVectors:StrategiesandApplications,93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996);RolandWolkowiczetal.,LentiviralVectorsfortheDeliveryofDNAintoMammalianCells,246MethodsMol.Biol.391-411(2004);A.Huser&C.Hofmann,BaculovirusVectors:NovelMammalianCellGene-DeliveryVehiclesandTheirApplications,3(I)Am.J.Pharmacogenomics53-63(2003);TizianaToninietal.，TransientProductionofRetroviral-andLentiviral-BasedVectorsfortheTransductionofMammalianCells,285MethodsMol.Biol.141-148(2004);ManfredGossen&HermannBujardjTightControlofGeneExpressioninEukaryoticCellsbyTetracycline-ResponsivePromoters,美國專利No.5，464，758;HermannBujard&ManfredGossen，MethodsforRegulatingGeneExpression,美國專利No.5，814，618;DavidS.HognessjPolynucleotidesEncodingInsectSteroid39HormoneReceptorPolypeptidesandCellsTransformedWithSame,美國專利No.5，514，578;DavidS.HognessjPolynucleotideEncodingInsectEcdysoneReceptor,美國專利6，245，531;ElisabettaVegetoetal.,ProgesteroneReceptorHavingC.TerminalHormoneBindingDomainTruncations,美國專利No.5，364，791;ElisabettaVegetoetal.,MutatedSteroidHormoneReceptors，MethodsforTheirUseandMolecularSwitchforGeneTherapy,美國專利No.5，874，534，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。這類病毒介導的遞送方法可以通過標準步驟進行并且有市售，參見例如ViraPowerAdenoviralExpressionSystem(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和ViraPowerAdenoviralExpressionSystemInstructionManual25-0543versionA，InvitrogenjInc.，(Jul.15，2002)；以及AdEasyAdenoviralVectorSystem(Stratagene,Inc.，LaJolla,CA)和AdEasyAdenoviralVectorSystemInstructionManual064004f，Stratagene,Inc0再者，這類病毒介導的遞送方法可以通過標準方法進行并且有市售，參見例如BDTet-0ffandTet-OnGeneExpressionSystems(BDBiosciences-ClonetechjPaloAlto,CA)ΛBDTet-OffandTet-OnGeneExpressionSystemsUserManual，PT3001-1，BDBiosciencesClonetechj(Mar.14，2003)、GeneSwitchSystem(Invitrogen,Inc.，Carlsbad，CA)、GeneSwitchSystemAMifepristone-RegulatedExpressionSystemforMammalianCellsversionD，25—0313,InvitrogenjInc.,(Nov.4,2002)；ViraPowerLentiviralExpressionSystem(Invitrogen,Inc.，Carlsbad,CA)andViraPowerLentiviralExpressionSystemInstructionManual25-0501versionE，InvitrogenjInc.，(Dec.8，2003)；以及CompleteControlRetroviralInducibleMammalianExpressionSystem(Stratagene,LaJollajCA)和CompleteControlRetroviralInducibleMammalianExpressionSystemInstructionManual,064005eo因此，在一個實施方案中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞瞬時包含編碼對細胞進行全部細胞機制——藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的一種組分的多核苷酸分子。在另一實施方案中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞瞬時包含編碼對細胞進行全部細胞機制一藉此機制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的多種組分的多核苷酸分子。在該實施方案的一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞瞬時包含編碼FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在該實施方案的一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞瞬時包含編碼SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在該實施方案的另一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞瞬時包含編碼SEQIDNO:139,SEQIDNO:140或SEQIDNO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在該實施方案的另一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞瞬時包含編碼SEQIDNO:142,SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在該實施方案的另一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞瞬時包含編碼SEQIDNO:145或SEQIDNO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。在另一實施方案中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞穩定地包含編碼對細胞進行全部細胞機制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的一種組分的多核苷酸分子。在另一實施方案中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞穩定地包含編碼對細胞進行全部細胞機制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物-所必需的多種組分的多核苷酸分子。在該實施方案的一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞穩定地包含編碼FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在該實施方案的一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞穩定地包含編碼SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在該實施方案的另一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞穩定地包含編碼SEQIDNO:139,SEQIDNO:140或SEQIDNO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在該實施方案的另一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞穩定地包含編碼SEQIDNO:142、SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在該實施方案的另一些方面中，來自對BoNT/A中毒敏感的已建立細胞系的細胞穩定地包含編碼SEQIDNO:145或SEQIDNO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。如上述，可以將對于細胞進行全部細胞機制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本說明書中公開的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的組分導入細胞。可用于用遞送試劑將這類外源性組分導入細胞群的任一和所有方法都可使用，條件是該方法可將本說明書中公開的外源性組分瞬時導入給定細胞群的至少50%的細胞中。因此，該實施方案的一些方面可包括這樣的細胞群，即其中該給定細胞群的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%瞬時包含對于細胞進行全部細胞機制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本說明書中公開的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的外源性組分。本文使用的術語“遞送試劑”是指能夠實現或者增強共價連接、非共價連接或者以任意其他方式關聯的多肽至細胞中的內化的任何分子。因此，術語“遞送試劑”非限制地涵蓋非限制地將共價或非共價連接的分子轉運至細胞膜、細胞質或核的蛋白、肽、擬肽、小分子、多核苷酸分子、脂質體、脂質、病毒、反轉錄病毒和細胞。還應理解的是，術語“遞送試劑”涵蓋通過任何機制內化的分子，包括經受體介導的胞吞作用發揮功能的遞送試劑，以及不依賴于受體介導的胞吞作用的遞送試劑。遞送試劑還可以是例如通過化學軛合或者借助遺傳產生的融合蛋白實現或者增強共價連接的組分如FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的細胞攝取的試劑。共價連接遞送試劑的方法以及使用這類試劑的方法記載于例如StevenF.Dowdy,ProteinTransductionSystemandMethodsofUseThereof,國際公開文本NoWO00/34308;GerardChassaing&AlainProchiantz,PeptideswhichcanbeUsedasVectorsfortheIntracellularAddressingofActiveMolecules,美國專利No.6，080，724;AlanFrankeletal.,FusionProteinComprisingTAT-derivedTransportMoiert,美國專利No.5,674,980;AlanFrankeletal.,TAT-derivedTransportPolypeptideConjugates,美國專利No.5，747，641;AlanFrankeletal.,TAT-derivedTransportPolypeptidesandFusionProteins,美國專利No.5，804，604;PeterF.J.0，Hareetal.,UseofTransportProteins,美國專利No.6，734，167;Yao-ZhongLin&JackJ.Hawiger,MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells,美國專利No.5，807，746;Yao-ZhongLin&JackJ.Hawiger,MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells,美國專利No.6，043，339;Yao-ZhongLinetal.,SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國專利No.6，248，558;Yao-ZhongLinetal.,SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國專利No.6，432，680;JackJ.Hawigeretal·，MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells，美國專利No.6，495，518;Yao-ZhongLinetal.,SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國專利No.6，780，843;JonathanB.Rothbard&PaulAWender,MethodandcompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes,美國專利No.6，306，993;JonathanB.Rothbard&PaulAWender,MethodandcompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes,美國專利No.6，495，663;andPamelaB.Davisetal.,FusionProteinsforProteinDelivery,美國專利No.6，287，817中，它們的每一篇均通過援引的方式全文納入本文。遞送試劑還可以是實現或者增強非共價連接的組分如FGFR2、FGFR3、SV2c或SNAP-25的細胞攝取的試劑。在無共價連接的情況下發揮功能的方法以及使用這類試劑的方法記載于例如GillesDivitaetal，Peptide-MediatedTransfectionAgentandMethodsofUse，美國專利No.6，841，535;PhilipLFeignerandOlivierZelphatijIntracellularProteinDeliverycompositionsandMethodsofUse,美國專利公開文本No.2003/0008813;和MichaelKaras,IntracellularDeliveryofSmallMolecules,ProteinsandNucleicAcids，美國專利公開文本2004/0209797中，它們的每一篇均通過援引的方式全文納入本文。這類肽遞送試劑可以通過標準方法制備和使用并且有示售，參見例如CHARIOTReagent(ActiveMotif，Carlsbad,CA);BIO-PORTERReagent(GeneTherapySystems,Inc.,SanDiego，CA)、BIOTREKProteinDeliveryReagent(Stratagene，LaJolla,CA)和PRO-JECTProteinTransfectionReagent(PierceBiotechnologyInc.，Rockford,IL)。本公開的一些方面部分地包括一種包含BoNT/A的樣品。本文使用的術語“包含BoNT/A的樣品”是指包含或可能包含活性BoNT/A的任何生物物質。多種樣品可依照本說明書中公開的方法測定，所述樣品非限制地包括純化的、部分純化的或未純化的BoNT/A;天然或非天然序列的重組單鏈或雙鏈毒素；具有改良蛋白酶特異性的重組BoNT/A;細胞特異性改變的重組BoNT/A；大體積BoNT/A;制成制劑的BoNT/A產品，包括例如BOTOX'DYSPORTrtVRELOXiN'XEOMIN'PIJRTOXr,NEURONOX、BTX-A;以及來自例如細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物來源的細胞或者粗的、分離的或部分純化的細胞裂解液；血液、血漿或血清；生、半熟、熟或經加工的食物；飲料；動物飼料；土壤樣品；水樣；池塘底泥；洗劑；化妝品；以及臨床制劑。應理解的是，術語樣品涵蓋組織樣品，非限制地包括哺乳動物組織樣品；家畜組織樣品如綿羊、牛和豬組織樣品；靈長類組織樣品；以及人組織樣品。這類樣品非限制地包括腸樣品如嬰兒腸樣品以及獲自傷口的組織樣品。作為非限制性實例，檢測皮摩爾量的BoNT/A活性的方法可用于確定BoNT/A在血液或飲料樣品中的存在情況或活性；可用于測定來自例如暴露于BoNT/A或者具有一種或多種肉毒中毒癥狀的人或動物的樣品；可用于在大體積BoNT/A的產生和純化中跟蹤活性；可用于測定在藥物或化妝品應用中使用的制成制劑的BoNT/A產品；或者可用于測定受:試者血清中是否存在中和α-BoNT/A抗體。因此，在一個實施方案中，包含BoNT/A的樣品是包含任意量BoNT/A的樣品。在該實施方案的一些方面中，包含BoNT/A的樣品包含約IOOng或更少、約IOng或更少、約Ing或更少、約IOOpg或更少、約IOpg或更少或者約Ipg或更少的BoNT/A。在該實施方案的另一些方面中，包含BoNT/A的樣品包含約IμM或更少、約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約IOOpM或更少、約IOpM或更少、約IpM或更少、約IOOfM或更少、約IOfM或更少或者約IfM或更少的BoNT/A。本公開的一些方面部分地包括從處理細胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25組分。本文使用的術語“包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25組分”是指包含所述SNAP-25剪切產物的細胞組分。可想象的是，可以使用適合用于富集或分離SNAP-25組分的任何方法，非限制地包括細胞裂解方案、離心柱(spin-column)純化方案、免疫沉淀、親和純化和蛋白質色譜。本公開的一些方面部分地包括連接于固相支持物的a-SNAP-25抗體。本文使用的術語“固相支持物”與“固相”同義，是指可以用于固定化本說明書中公開的a-SNAP-25抗體的任何基質。固相支持物的非限制性實例包括例如管；盤；柱；針或“插棒”；磁性顆粒、小珠或其他球狀或纖維狀色譜介質,例如瓊脂糖(agarose)、瓊脂糖凝膠(sepharose)、二氧化硅和塑料；以及片或膜，例如硝酸纖維素和二氟化樹脂聚偏氟乙稀(PVDF)。所述固相支持物可以使用很多材料例如玻璃、炭、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、重氮纖維素或淀粉構建。所選的固相支持物可以具有這樣的物理性質，即該物理性質使得它易于與可溶性或未結合的物質分離，并且通常可使得未結合的物質如過量試劑、反應副產物或者溶劑從與固相支持物結合的測定組分中分離或者除去(通過例如洗滌、過濾、離心等)。如何制備以及使用固相支持物的非限制性實例記載于例如MolecularCloning,ALaboratoryManual,見上文，(2001)jPCurrentProtocolsinMolecularBiology,見上文，(2004)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。本公開的一些方面部分地包括檢測一種包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產物的抗體_抗原復合體的存在情況，所述a-SNAP-25抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切產物在所述BοNT/A剪切位點易切斷鍵的Pi殘基處含有羧基端。可想象的是，任何檢測體系均可以用于實施這種公開的基于免疫的方法的一些方面，條件是信噪比可以以統計顯著的程度將來自所述抗體-抗原復合體的信號與背景信號區分開。基于免疫的檢測體系的非限制性實例包括免疫印跡分析如蛋白質印跡和斑點印跡、免疫沉淀分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)和夾心ELISA。所述信號的檢測可以借助如下技術使用放射自顯影實現成像或磷光成像(AU)、化學發光(CL)、電化學發光(ECL)、生物發光(BL)、熒光、共振能轉移、平面極化、比色法或流式細胞術(FC)。基于免疫的檢測系統的描述公開于例如MichaelM.Rauhut,Chemiluminescence,InKirk-OthmerConciseEncyclopediaofChemicalTechnology(Ed.Grayson,3rded,JohnWileyandSons,1985);A.ff.Knight,AReviewofRecentTrendsinAnalyticalApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescence,TrendsAnal.Chem.18(1):47-62(1999);K.A.Fahnrich,etal.,RecentApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescenceinChemicalAnalysis,Talanta54(4):531-559(2001);CommonlyUsedTechniquesinMolecularCloning,pp.A8.1-A8-55(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001);DetectionSystems,pp.A9.I-A9-49(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001);ElectrogeneratedChemiluminescence,(Ed.AllenJ.Bard,MarcelDekker,Inc.，2004)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。夾心ELISA(或夾心免疫測定)是基于結合所述抗原上不同表位的兩種抗體的方法。將對目的抗原具有高度結合特異性的捕獲抗體結合于固體表面。然后加入所述抗原，并隨后添加被稱為檢測抗體的二抗。所述檢測抗體結合不同于針對捕獲抗體的抗原表位。所述抗原因此“被夾在”所述兩種抗體之間。所述抗體對所述抗原的結合親和性通常是免疫測定靈敏度的主要決定因素。隨著所述抗原濃度的增加，檢測抗體的量也增加，導致測量到更高的反應。為了定量結合的程度，可以使用不同的報告體系，例如連接于二抗的酶和報告底物，這里酶促反應可形成作為檢測信號的讀數。所形成的信號與樣品中存在的靶抗原的量成比例。用于測量所述結合事件的報告底物決定所述檢測模式。分光光度計板式酶標儀用于比色法檢測。已經開發出了化學發光和電化學發光底物，所述底物可進一步放大信號并且可以在發光酶標儀上讀取。所述報告值還可以是熒光讀數，這里以熒光團代替所述測定的酶步驟，然后使用熒光酶標儀測量所述讀數。對進行ECL夾心ELISA所必需的試劑和方案有市售，非排他地包括MSD夾心ELISA-ECL檢測平臺(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MD)。因此，在一個實施方案中，可以使用免疫印跡分析、免疫沉淀分析、ELISA或夾心ELISA檢測包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況，所述a-SNAP-25抗體可選擇性地結合于在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切產物在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。在該實施方案的一些方面中，使用AU、CL、ECL或BL免疫印跡分析；AU、CL、ECL、BL或FC免疫沉淀分析；AU、CL、ECL、BL或FCELISA;或者AU、CL、ECL、BL或FC夾心ELISA進行所述檢測。本公開的一些方面可以以單路或多路的方式實施。以單路方式實施的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法僅檢測包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況，所述SNAP-25剪切產物在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。以多路方式實施的基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法同時檢測兩種或多種抗體_抗原復合體的存在情況；其中一種是包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產物的抗體_抗原復合體，所述SNAP-25剪切產物在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端；其他的是針對第二、第三、第四等不同蛋白的抗體-抗原復合體。例如可以使用第二蛋白作為內部對照物，以通過將檢出的a-SNAP-25/SNAP-25抗體-抗原復合體的量相對于對所述第二蛋白檢出的抗體-抗原復合體的量標準化而最小化樣品與樣品之間的變異性。照此，所述第二蛋白通常是由所述細胞恒定表達的蛋白，例如管家蛋白。可用的第二蛋白的非限制性實例包括例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、突觸融合蛋白、細胞因子。以多路方式進行基于免疫的測定的方法記載于例如U.B.NielsenandB.H.Geierstanger,MultiplexedSandwichAssaysinMicroarrayFormat，J.Immunol.Methods.290(1-2):107-1202004);R.BarryandMjSoloviev,QuantitativeProteinProfilingusingAntibodyArrays,Proteomicsj4(12):3717-3726(2004);M.M.Lingetal.,MultiplexingMolecularDiagnosticsandImmunoassaysusingEmergingMicroarrayTechnologies,ExpertRevMolDiagn.7(I):87-98(2007);S.X.Lengetal.,ELISAandMultiplexTechnologiesforCytokineMeasurementinInflammationandAgingResearch,JGerontolABiolSciMedSci.63(8):879-884(2008)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。因此，在一個實施方案中，基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法通過以下方式以單路的方式實施僅檢測包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況，所述SNAP-25剪切產物在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。在另一實施方案中，基于免疫的檢測BoNT/A活性的方法通過以下方式以多路的方式實施同時檢測包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體以及針對SNAP-25之外的其他蛋白例如GAPDH或突觸融合蛋白的至少一種其他抗體-抗原復合體的存在情況，所述SNAP-25剪切產物在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。本公開的一些方面部分地提供了一種測定BoNT/A免疫抗性的方法。本文使用的術語“BoNT/A免疫抗性”是指哺乳動物對于BoNT/A治療不完全反應，或者由于以下原因顯示出降低的BoNT/A治療的有利效應所述哺乳動物的免疫反應直接或間接地降低所述治療的有效性。有效性降低的非限制性實例可以是在哺乳動物中存在至少一種中和a-BoNT/A抗體，所述中和a-BoNT/A抗體可以以降低或阻斷所述毒素特異性或活性的方式結合于BoNT/A毒素。本文使用的術語“BoNT/A治療”是指使用BoNT/A毒素或者給予哺乳動物具有醫學、治療、治愈、美容、矯正或任何其他有利效應的一個或多個受控劑量的BoNT/A毒素的藥劑、制劑或混合物，抵消需要神經調制的哺乳動物中的不利事物的治療、矯正、治愈、愈合、康復或者任何其他方式。BoNT/A治療非限制地涵蓋與任何載體或活性成分組合并通過任何給藥途徑給藥的任何制劑形式的其任何天然或修飾片段的使用。例如，公知的BoNT/A治療是BOTOX治療。本公開的一些方面部分地提供了一種從被測試是否存在a-BoNT/A中和抗體的哺乳動物中獲得的試驗樣品。本文使用的術語“試驗樣品”是指包含或可能包含至少一種a-BoNT/A抗體的任何生物物質。a-BoNT/A抗體可以是中和抗BoNT/A抗體或非中和抗BoNT/A抗體。本文使用的術語“中和BoNT/A抗體”是指任何這樣的a-BoNT/A抗體，即該a-BoNT/A抗體在生理條件下會以減少或阻止所述毒素在BoNT/A治療中發揮其效應的方式結合于BoNT/A毒素的一個區域。本文使用的術語“非中和a-BoNT/A抗體”是指任何這樣的a-BoNT/A抗體，即該a-BoNT/A抗體在生理條件下會結合于BoNT/A毒素的一個區域，但不阻止所述毒素在BoNT/A治療中發揮其效應。可想象的是，可包含a-BoNT/A抗體的任一和所有樣品均可用于該方法中，所述樣品非限制地包括血液、血漿、血清和淋巴液。另外，能夠產生抗BoNT/A毒素的a-BoNT/A抗體的任一和所有生物均可用作樣品來源，所述生物非限制地包括鳥和哺乳動物，所述哺乳動物包括小鼠、大鼠、山羊、綿羊、馬、驢、牛、靈長類和人。用于血液采集和血清制備的具體方案的非限制性實例記載于例如MarjorieSchaubDiLorenzo&SusanKingStrasinger,BLOODCOLLECTIONINHEALTHCARE(F.A.DavisCompany,2001)jPDianaGarza&KathleenBecan-McBride,PHLEBOTOMYHANDBOOK:BLOODCOLLECTIONESSENTIALS(PrenticeHall,6thed.,2002)中。這些方案是本領域技術人員公知并且在本文中有教導的常規方法。試驗樣品可在如下時間從生物體獲得暴露于BoNT/A毒素之前、單次BoNT/A處理后、多次BoNT/A毒素處理后、對BoNT/A治療的抗性發生之前或對BoNT/A治療的抗性發生之后。本公開的一些方面部分地提供了一種對照樣品。本文使用的術語“對照樣品”是指已知其中是否存在試驗樣品的任何樣品，包括陰性和陽性對照樣品。對于中和a-BoNT/A抗體，陰性對照樣品可以獲自未曾暴露于BoNT/A的個體，并且可非限制地包括來自提供所述試驗樣品的相同個體、但在進行BoNT/A治療前采集的樣品；從未曾暴露于BoNT/A的不同個體中采集的樣品；從多個未曾暴露于BoNT/A的不同個體中采集的混合樣品。對于中和a-BoNT/A抗體，陽性對照樣品可以獲自表現出BoNT/A免疫抗性的個體，所述個體非限制地包括在基于患者的測試中測試為陽性的個體；在體內生物測定中測試為陽性的個體；以及顯示高免疫性的抗體，例如已接種BoNT/A的個體。還可預知的是，a-BoNT/A抗體可以從樣品中純化。BoNT/A抗體可以通過多種方法從樣品中純化，所述方法非限制地包括蛋白A/G色譜法和親和色譜法。從樣品中純化抗體的具體方案的非限制性實例記載于例如ANTIB0DIES:ALABORATORYMANUAL(EdwardHarlow&DavidLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1998)；USINGANTIB0DIES:ALABORATORYMANUAL:PORTABLEPROTOCOLNO.I(EdwardHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998);和MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL，見上文，(2001)中，它們通過援引的方式納入本文。另外，成熟的試劑、條件和方案以及抗體純化方法的非限制性實例可容易地獲自商業的供應商，非限制地包括PierceBiotechnology,Inc.，Rockford,IL;和ZymedLaboratories,Inc.,SouthSanFrancisco,CA。這些方案是本領域技術人員熟知的常規方法。因此,在一個實施方案中,樣品包括血液。在該實施方案的一個方面中，所述樣品包括小鼠血、大鼠血、山羊血、綿羊血、馬血、驢血、牛血、靈長類血或人血。在另一實施方案中，樣品包括血漿。在該實施方案的一個方面中，試驗樣品包括小鼠血漿、大鼠血漿、山羊血漿、綿羊血漿、馬血漿、驢血漿、牛血漿、靈長類血漿或人血漿。在另一實施方案中，樣品包括血清。在該實施方案的一個方面中，所述樣品包括小鼠血清、大鼠血清、山羊血清、綿羊血清、馬血清、驢血清、牛血清、靈長類血清和人血清。在另一實施方案中，樣品包括淋巴液。在該實施方案的一個方面中，樣品包括小鼠淋巴液、大鼠淋巴液、山羊淋巴液、綿羊淋巴液、馬淋巴液、驢淋巴液、牛淋巴液、靈長類淋巴液或人淋巴液。仍在另一實施方案中，樣品是試驗樣品。仍在另一實施方案中，樣品是對照樣品。在該實施方案的一些方面中，對照樣品是陰性對照樣品或陽性對照樣品。本公開的一些方面部分地提供了，對在步驟(d)中檢出的在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的量與在步驟(e)中檢出的在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的量進行比較。在一個實施方案中，所述試驗樣品中SNAP-25剪切產物的量高于所述對照樣品中SNAP-25剪切產物的量。在該實施方案的一個方面中，所述試驗樣品中SNAP-25剪切產物的量比陽性對照樣品中的高指示所述哺乳動物中BoNT/A免疫抗性降低或者無BoNT/A免疫抗性。在該實施方案的另一方面中，所述試驗樣品中SNAP-25剪切產物的量與陰性對照樣品中的相當指示所述哺乳動物中BoNT/A免疫抗性降低或者無BoNT/A免疫抗性。在另一實施方案中，所述試驗樣品中SNAP-25剪切產物的量比對照樣品中的低。在該實施方案的一個方面中，所述試驗樣品中SNAP-25剪切產物的量比陽性對照樣品中的低或與之相當指示所述哺乳動物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性。在該實施方案的另一方面中，所述試驗樣品中SNAP-25剪切產物的量比陰性對照樣品中的低指示所述哺乳動物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性。可想象的是，適合用于檢測樣品中的中和a-BoNT/A抗體存在情況的任一和所有測定條件均可用于本說明書中公開的方法中，例如線性測定條件或非線性測定條件。在一個實施方案中，所述測定條件是線性的。在該實施方案的一個方面中，BoNT/A的測定量是過量的。在該實施方案的另一方面中，BoNT/A的測定量是限速的。在該實施方案的另一方面中，試驗樣品的測定量是限速的。本公開的一些方面還可以描述如下I.一種組合物，包含與連接于SNAP-25抗原的柔性連接體連接的載體，所述SNAP-25抗原在BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。2.1的組合物，其中所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基是谷氨酰胺或賴氨酸。3.I的組合物，其中所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO:147。4.I的組合物，其中所述柔性連接體和所述SNAP-25抗原的氨基酸序列是SEQIDNO:38或SEQIDNO:46。5.一種分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。6.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述a-SNAP-25抗體對不包含SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位具小于IXIO1M4iT1的締合速率常數；其中所述a-SNAP-25抗體對于所述表位具有小于0.450nM的平衡解離常數。7.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體具有包含選自如下序列的氨基酸序列的重鏈可變區SEQIDNO:72,SEQIDNO:74,SEQIDNO:76,SEQIDN0:80和SEQIDN0:82;并具有包含選自如下序列的氨基酸序列的輕鏈可變區SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90和SEQIDNO:92。8.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO:93的VhCDRl、SEQIDNO:94的VhCDRl、SEQIDNO:95的VhCDRl、SEQIDNO:118的VhCDRl、SEQIDNO:119的VhCDRl或SEQIDNO:120的VhCDRl。9.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO:96的VhCDR2、SEQIDNO:97的VhCDR2、SEQIDNO:98的VhCDR2、SEQIDNO:99的VhCDR2、SEQIDNO:121的VhCDR2、SEQIDNO:122的VhCDR2或SEQIDNO:123的VhCDR2。10.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO:100的VhCDR3、SEQIDNO:101的VhCDR3、SEQIDNO:102的VhCDR3或SEQID47NO:124的VhCDR3。11.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO:103的VlCDRUSEQIDNO:104的VlCDRUSEQIDNO:105的VlCDRUSEQIDNO:106的VlCDRUSEQIDNO:107的VlCDRUSEQIDNO:125的VlCDRUSEQIDNO:126的'CDRl、SEQIDNO:127的\CDRl、SEQIDNO:128的\CDRl或SEQIDNO:129的\CDRl。12.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO:108的VlCDR2、SEQIDNO:109的VlCDR2、SEQIDNO:110的VlCDR2、SEQIDNO:111的\CDR2或SEQIDNO:112的\CDR2。13.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO:113的VlCDR3、SEQIDNO:114的VlCDR3、SEQIDNO:115的VlCDR3、SEQIDNO:116的\CDR3或SEQIDNO:117的\CDR3。14.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體包含包括SEQIDNO:93,SEQIDN0:121和SEQIDNO:100的重鏈可變區；以及包括SEQIDNO:105,SEQIDNO:110和SEQIDNO:115的輕鏈可變區。15.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體可選擇性地結合于SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的SNAP-25表位。16.5的分離的a-SNAP-25抗體，其中所述分離的a-SNAP-25抗體可選擇性地結合SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:41,SEQIDNO:42,SEQIDΝ0:43或SEQIDNO:44的SNAP-25表位。17.一種檢測BoNT/A活性的方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)從所處理的細胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物；c)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；其中所述抗體_抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A的活性。18.一種檢測BoNT/A活性的方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)從所處理的細胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物；c)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；其中所述抗體_抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A的活性。19.一種檢測BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)從所處理的細胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物；c)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；d)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及e)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體_抗原復合體的存在情況；其中所述抗體_抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A的活性。20.一種檢測BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞可以攝取BoNT/A；b)從所處理的細胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物；c)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；其中所述抗體_抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A的活性。21.一種檢測BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞可以攝取BoNT/A;b)從所處理的細胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物；c)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；其中所述抗體_抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A的活性。22.一種檢測BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞可以攝取BoNT/A;b)從所處理的細胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物；c)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；d)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及e)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；其中所述抗體_抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A的活性。23.一種測定哺乳動物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測試a-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動物中獲得的試驗樣品中；b)用所述試驗樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A中毒是敏感的；c)從所述處理的細胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；f)以陰性對照樣品代替試驗樣品重復步驟b-e，所述陰性對照樣品包含BoNT/A和已知不含a-BoNT/A中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測到的抗體_抗原復合體的量與步驟f中檢測到的抗體_抗原復合體的量對比，其中與步驟f中檢測到的抗體-抗原復合體的量相比，步驟e中檢測到較低量的抗體-抗原復合體的檢測結果指示a-BoNT/A中和抗體的存在。24.一種測定哺乳動物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測試a-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動物中獲得的試驗樣品中；b)用所述試驗樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A中毒是敏感的；c)從所述處理的細胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體_抗原復合體的存在情況；f)以陰性對照樣品代替試驗樣品重復步驟b-e，所述陰性樣品對照包含BoNT/A和已知不含a-BoNT/A中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測到的抗體-抗原復合體的量與步驟f中檢測到的抗體-抗原復合體的量對比，其中與步驟f中檢測到的抗體_抗原復合體的量相比，步驟e中檢測到較低量的抗體_抗原復合體的檢測結果指示a-BoNT/A中和抗體的存在。25.一種檢測哺乳動物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測試a-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動物中獲得的試驗樣品中；b)用所述試驗樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對BoNT/A中毒是敏感的；c)從所述處理的細胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；e)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；f)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；g)以陰性對照樣品代替試驗樣品重復步驟b-f，所述陰性對照樣品包含BoNT/A和已知不含a-BoNT/A中和抗體的血清；以及h)將步驟f中檢測到的抗體_抗原復合體的量與步驟g中檢測到的抗體_抗原復合體的量對比，其中與步驟g中檢測到的抗體_抗原復合體的量相比，步驟f中檢測到較低量的抗體_抗原復合體的檢測結果指示a-BoNT/A中和抗體的存在。26.一種測定哺乳動物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測試a-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動物中獲得的試驗樣品中；b)用所述試驗樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞可以攝取BoNT/A;c)從所述處理的細胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；f)以陰性對照樣品代替試驗樣品重復步驟b-e，所述陰性對照樣品包含BoNT/A和已知不含a-BoNT/A中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測到的抗體_抗原復合體的量與步驟f中檢測到的抗體_抗原復合體的量對比，其中與步驟f中檢測到的抗體_抗原復合體的量相比，步驟e中檢測到較低量的抗體_抗原復合體的檢測50結果指示a-BoNT/A中和抗體的存在。27.一種檢測哺乳動物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測試a-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動物中獲得的試驗樣品中；b)用所述試驗樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞可以攝取BoNT/A；c)從所述處理的細胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；f)以陰性對照樣品代替試驗樣品重復步驟b-e，所述陰性對照樣品包含BoNT/A和已知不含a-BoNT/A中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測到的抗體-抗原復合體的量與步驟f中檢測到的抗體_抗原復合體的量對比，其中與步驟f中檢測到的抗體-抗原復合體的量相比，步驟e中檢測到較低量的抗體_抗原復合體的檢測結果指示a-BoNT/A中和抗體的存在。28.一種檢測哺乳動物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測試a-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動物中獲得的試驗樣品中；b)用所述試驗樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞可以攝取BoNT/A;c)從所述處理的細胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；e)將所述SNAP-25組分與a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體可以結合在SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；f)檢測包含所述a-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產物的抗體-抗原復合體的存在情況；g)以陰性對照樣品代替試驗樣品重復步驟b-f，所述陰性對照樣品包含BoNT/A和已知不含a-BoNT/A中和抗體的血清；以及h)將步驟f中檢測到的抗體_抗原復合體的量與步驟g中檢測到的抗體_抗原復合體的量對比，其中與步驟g中檢測到的抗體_抗原復合體的量相比，步驟f中檢測到較低量的抗體_抗原復合體的檢測結果指示a-BoNT/A中和抗體的存在。29.17-22和23_25的方法，其中所述細胞對于由約500ρΜ或更少、約400ρΜ或更少、約300ρΜ或更少、約200ρΜ或更少、約IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。30.20-22和26_28的方法，其中所述細胞可以攝取約500ρΜ或更少、約400ρΜ或更少、約300ρΜ或更少、約200ρΜ或更少、約IOOpM或更少的BoNT/A。31.17-22的方法，其中所述樣品包含約IOOng或更少、約IOng或更少、約Ing或更少、IOOfg或更少、IOfg或更少或者Ifg或更少的BoNT/A。32.17-22的方法，其中所述樣品包含約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約IOOpM或更少、約IOpM或更少、約IpM或更少、約IOOfM或更少、約IOfM或更少或者約IfM或更少的BoNT/A。33.17-28的方法，其中所述a-SNAP-25抗體是5_16的分離的a-SNAP-25抗體。34.17-28的方法，其中抗體-抗原復合體的存在情況通過免疫印跡分析、免疫沉淀分析、ELISA或夾心ELISA檢測。35.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少3:I、至少5:I、至少10:1、至少20:I、至少50:1或至少100:1的信噪比下限。36.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少10:1、至少20:1、至少50:1、至少100:I、至少200:I、至少300:I、至少400:I、至少500:1或至少600:1的信噪比上限。37.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以檢測例如至少lOOng、至少50ng、至少10ng、至少5ng、至少lOOpg、至少50pg、至少10pg、至少5pg、至少100fg、至少50fg、至少IOfg或至少5fg的EC5tl活性。38.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以檢測例如至少10nM、至少5nM、至少100pM、至少50pM、至少10pM、至少5pM、至少100fM、至少50fM、至少10fM、至少5fM或至少IfM的EC50活性。39.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOD。40.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的LOD。41.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOQ。42.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0Q。43.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以將完全活性BoNT/A與具有部分活性BoNT/A區分開所述部分活性為完全活性BoNT/A的活性的70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少。實施例實施例I候選細胞系的篩查下述實施例描述了如何鑒定對本說明書中公開的檢測BoNT/A活性的方法所必需的對BoNT/A中毒敏感的或者具有BoNT/A攝取能力的已建立細胞系。I.候選細胞系的原種培養物的生長為了培養所述細胞系，將合適密度的來自要測試細胞系的細胞鋪板于含有30mL合適的生長培養基(見表I)的162cm2組織培養瓶中，并且在37°C的培養箱中于5%或10%二氧化碳下孵育，直至細胞達到所需的密度。表I.細胞系篩查中使用的培養基。權利要求1.一種藥物組合物，包含血清型A肉毒桿菌毒素(BoNT/A)，其中其效能在制造所述藥物過程中通過以下步驟確定a.將來自表達SNAP-25多肽的已建立細胞系的細胞與所述藥物相接觸，所述SNAP-25多肽基本上由包含SEQIDN0:5的人SNAP-25的至少一部分組成，所述至少一部分可被BoNT/A剪切，其中所述已建立細胞系對由每升培養基中約500pmoI或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的，這一點由如下事件指示BoNT/A將所述SNAP-25多肽酶解剪切以產生所述SNAP-25多肽的片段，所述片段包含SEQIDNO:38的C端氨基酸序列；b.從所述細胞分離多肽；c.將所述多肽與特異性結合SEQIDNO:38的肽的單克隆抗體相接觸，其中所述抗體以小于O.450nM的平衡解離常數特異性結合所述SNAP-25多肽的所述片段的表位，所述片段包含SEQIDNO:38的C端氨基酸序列，其中所述抗體對含SEQIDNO:5的完整SNAP-25多肽的表位具有小于IXIO1M-1S-1的締合速率常數，以及d.檢測包含所述抗體和所述SNAP-25多肽的所述片段的任何抗體-抗原復合體的存在情況，所述片段包含SEQIDN0:38的C端氨基酸序列，其中所檢測到的更高含量的所述抗體-抗原復合體與所述藥物中較高含量的BoNT/A相關。2.一種藥物組合物，包含血清型A肉毒桿菌毒素(BoNT/A)，其中其效能在制造所述藥物過程中通過以下步驟確定a.以包含BoNT/A的所述藥物組合物的樣品處理來自已建立細胞系的細胞，其中所述來自已建立細胞系的細胞對由約500pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b.從所處理的細胞分離包含SNAP-25剪切產物的SNAP-25組分，所述SNAP-25剪切產物具有所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺；c.將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的a-SNAP-25抗體相接觸，其中所述a-SNAP-25抗體結合含有SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位，所述a-SNAP-25抗體對不含SNAP-25剪切產物的BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25的表位具有小于IXIO1M4iT1的締合速率常數，并且所述a-SNAP-25抗體對所述表位具有小于O.450nM的平衡解離常數；d.檢測抗體-抗原復合體的存在情況，所述抗體-抗原復合體包含所述a-SNAP-25抗體和具有所述BoNT/A剪切位點易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切產物，其中通過所述抗體-抗原復合體的檢測結果指示BoNT/A活性。3.權利要求2的藥物組合物，其中所述SNAP-25剪切產物是SNAP_25197。4.權利要求2的藥物組合物，使用夾心ELISA檢測抗體-抗原復合體的存在情況。5.權利要求2的藥物組合物，其中所述方法具有至少3:1的信噪比下限，和至少10:1的信噪比上限。6.權利要求2的藥物組合物，其中所述樣品包含至多IOOpM的BoNT/A。7.權利要求2的藥物組合物，其中所述來自已建立細胞系的細胞對由約IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。8.權利要求2的藥物組合物，其中所述方法以單路方式或多路方式進行。9.權利要求2的藥物組合物，其中所述SNAP-25多肽基本上由包含SEQIDNO:5的人SNAP-25的至少一部分組成。10.權利要求2-9任一項的藥物組合物，其中所述SNAP-25剪切產物包含SEQIDNO:38的C端氨基酸序列。11.權利要求10的藥物組合物，其中所述抗體可特異性地結合于SEQIDNO:38的肽。全文摘要本發明為基于免疫的血清型A肉毒桿菌毒素活性測定，涉及一種藥物組合物，包含血清型A肉毒桿菌毒素(BoNT/A)，其中其效能在制造所述藥物過程中被特異性地確定。文檔編號G01N33/68GK102937653SQ201210442740公開日2013年2月20日申請日期2009年3月13日優先權日2008年3月14日發明者E·費爾南德斯-薩拉斯,J·王,P·E·加里,L·S·黃,D·D·霍奇斯,K·R·奧基申請人:阿勒根公司