專利名稱：向日葵白銹病菌實時熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術，具體的說涉及向日葵白銹病菌檢測用試劑盒。
背景技術：
向日葵白鎊病(Albugo tragopogi (Persoon)Schruter var helianthiNovotlenova)是危害向日葵的病害之一，此病近些年來在國外少數國家和地區嚴重發生、經濟影響大、傳入風險高，成為國際上關注的檢疫性有害生物。向日葵白銹病主要發生在美國、阿根廷、澳大利亞、玻利維亞、法國、肯尼亞、加拿大、津巴布韋、南非、前南斯拉夫、前蘇聯、烏拉圭等國，1992 1994年在南非大面積發病，形成莖桿倒伏，發病嚴重的田塊倒伏達80%以上，造成重大經濟損失。2002年，此病隨進口向日葵種子傳入我國新疆伊犁地區，成為當地向日葵上的主要病害之一。目前該病害已在新疆北疆各地州均有發生。發生面積達96800hm2。經濟損失10 30%。國外M. Thines等人報道了德國向日葵白銹病的危害、病原特征及傳播特性等；
H.Voglmayr等人報道了向日葵白銹病菌等12種白銹菌的分子特征及其親緣性關系；
A.Riethmuller等人報道了采用PCR法分析霜霉屬和白銹菌屬真菌的系統發育特征。國內陳衛民、李征杰等人分別對向日葵白銹病的病原鑒定、發生規律、防治技術等進行了研究。目前國內外未見有關該病菌的檢測試劑盒研究的報道。因此，有必要建立一種準確率和靈敏度均高的快速檢測試劑盒來檢測向日葵白銹病菌。由于該病是我國的檢疫性病害，因此在我國檢疫是主要的控制此病害的手段，嚴格限制或禁止從發生此病害的國家和地區進口向日葵種苗，從其它國家進口的向日葵種苗也必須在口岸檢驗檢疫局進行檢驗。由于向日葵白銹病菌是專性寄生菌，無法在培養基上進行分離培養，目前國內外檢測向日葵白銹病菌所采取的手段主要是種植觀察將進境的向日葵種苗按照檢驗檢疫機構的要求進行隔離種植，在種植期間定期觀察有無表現向日葵白銹病菌的典型癥狀。此法只能作為初步判斷，且費工、費時、結果判斷的準確率低。隨著我國對外開放不斷發展，農產品進出口日益頻繁，傳帶農業植物有害生物的機率進一步加大，有害生物的危害性進一步增強。向日葵自上世紀以來迅速發展，國內外調種批次多，數量大，來源復雜，檢疫問題非常突出。自2000年以來，我國每年從美國、德國等地引進大量向日葵種子，進口的數/重量均位居進境植物繁殖材料的前列，口岸檢驗檢疫局每年從進口的向日葵種子檢出多種有害生物。但目前我國各口岸檢驗檢疫機構缺乏對向日葵白銹病菌的有效檢測試劑盒。病害防治、預測預報及植物檢疫需要有準確快速的檢測試劑盒，尤其是需要我國擁有自主知識產權的檢測試劑盒，從而可以將之投入到商業生產和應用中，目前國內外在這一領域還沒有向日葵白銹病菌實時熒光PCR檢測試劑盒的報道。此項發明滿足了這些需求。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有技術中向日葵白銹病菌的種植觀察所需周期長、鑒定困難、準確率低等問題，提供向日葵白銹病菌的快速檢測試劑盒。本發明通過分析本實驗室測序的結果和已報道的向日葵白銹病菌核糖體基因序列，設計引物和熒光探針。引物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表ATHfMTHr所示；探針的核苷酸序列如序列表ATHp所示,該探針一端標記有報告突光染料，另一端標記有淬滅突光染料。可用的報告突光染料有FAM/hex/tet/joe/vic/fitc/cy3/cy5,可用的萍滅突光染料有 TAMRA/rox/dabcyl/bhql/bhq2。根據TaqMan技術，在常規PCR的基礎上添加了一條標記了兩個熒光染料基團的核苷酸探針，例如將報告突光染料標記在探針的5'端,淬滅突光染料標記在探針的3'端，兩者構成能量轉移結構，即報告熒光染料所發射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現對向日葵白銹病菌的檢測。本發明應用上述引物和探針進行實時熒光PCR檢測，其以樣品總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應，每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。具體的說本發明以樣品總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應。即在25 μ L反應體系中加入 Real-time PCR MixlO μ L, 5 μ M 弓丨物(ATHf/ATHr)各 2 μ L, 2 μ Μ/L 的 ΑΤΗρδ μ L,樣品DNA模板2ng。實時熒光PCR反應程序采用三步法第一步50°C，2min,第二步95°C，IOmin,然后進入第三步循環，95°C，10s,60°C，lmin,共40個循環。本發明具有非常好的特異性和穩定性，檢測方法快速簡單，準確性和靈敏性高，為可能攜帶向日葵白銹病菌植物材料的進出口安全提供了保證。
圖1.本發明檢測向日葵白銹病菌結果圖1.向日葵白銹病葉片；2向日葵白銹病莖桿；3.向日葵白銹病種子；4-10.健康向日葵葉片和向日葵其他病害植株圖2.本發明檢測向日葵白銹病菌靈敏度結果圖1、22· 3ng，2、2. 23ng，3、223pg，4、22· 3pg，5、2. 23pg，6、223fg，7、0fg。
具體實施例方式下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1引物及探針設計根據本實驗室測序的結果和已報道的向日葵白銹病菌核糖體基因序列，采用引物探針設計軟件DNAMAN設計引物及探針，引物序列為ATHf :5，-CTGACTTTGACTCCTCCGTGGC-3，ATHr :5，-GAGACCGATAGCGAACAAG-3，探針序列為ATHp:5’ -TTTCAGCAGTTTCAGGTACTCTTTAAC-3’，該探針的 5，端標記為報告熒光染料FAM，3’端標記為淬滅熒光染料TAMRA。
實施例2向日葵樣品檢測1.向日葵材料DNA的提取米用試劑盒法(TaKaRaUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver3. 0)提取向日葵材料核酸。向日葵種子核酸的提取將向日葵種子浸泡后，挑取種皮，然后采用試劑盒方法(DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver. 2. 2)提取基因組 DNA。2.實時熒光PCR反應體系以向日葵材料總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應。在25 μ L 反應體系中加入 Real-time PCR MixlO μ L，5 μ M 引物(ATHf/ATHr)各
2μ L，2 μ Μ/L 的 ΑΤΗρδ μ L，樣品 DNA 模板 2ng。3.實時熒光PCR反應條件 將樣品管放入Applied Biosystems7300熒光PCR儀后，設置反應程序第一步500C，2min,第二步95°C，IOmin,然后進入第三步循環，95°C，10s,60°C，lmin,共40個循環。每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。實施例3向日葵白銹病菌實時熒光PCR檢測試劑盒的特異性實驗以表現癥狀的向日葵白銹病菌葉片總DNA為模板，以健康向日葵葉片和向日葵其他病害植株為對照，通過實時熒光PCR檢測熒光強度變化。實驗結果以表現癥狀的向日葵白銹病菌葉片總DNA為模板，通過實時熒光PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化，而健康對照和向日葵其他病害植株的熒光強度沒有變化，結果見圖1。實施例4向日葵白銹病菌實時熒光PCR檢測試劑盒的靈敏度實驗用三蒸水倍比稀釋總DNA，進行相對靈敏度檢測。在25 μ L反應體系中，總DNA分別為 22. 3ng，2. 23ng，223pg，22. 3pg，2. 23pg，223fg，Ofg，檢測結果如圖 2 所示，最低檢測限是 2. 23pg。
權利要求
1.一種向日葵白銹病菌檢測用引物，其核苷酸序列為ATHf :5’ -CTGACTTTGACTCCTCCGTGGC-3’ATHr :5， -GAGACCGATAGCGAACAAG-3，。
2.—種與權利要求1所述引物配合使用的探針，其核苷酸序列為=ATHp :5’ -TTTCAGCAGTTTCAGGTACTCTTTAAC-3’，該探針的一端標記為報告熒光染料，另一端標記為淬滅熒光染料。
3.—種檢測向日葵白銹病菌的方法，其特征在于實時突光PCR反應過程中的退火溫度為 60。。。
4.含有權利要求1所述引物的試劑盒。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其還包括權利要求2所述的探針。
全文摘要
本發明提供了一種向日葵白銹病菌實時熒光PCR檢測試劑盒。試劑盒所采用的引物核苷酸序列如序列表ATHf&ATHr所示，探針核苷酸序列如序列表ATHp所示。該試劑盒以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針進行實時熒光PCR擴增，每個循環結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。本發明具有非常好的特異性和穩定性，檢測方法快速簡單，準確性和靈敏性高，為可能攜帶向日葵白銹病菌植物材料的進出口安全提供了保證。
文檔編號G01N21/64GK103060437SQ201210436718
公開日2013年4月24日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者張祥林, 王翀, 劉彬, 陳燕 申請人:新疆出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心