一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法

一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法，該方法主要包括以下步驟：采用BaCl2-乙醇法對酪蛋白磷酸肽原料進行純化；采用高效液相色譜法對純化后的酪蛋白磷酸肽原料進行標準曲線的繪制；采用固相萃取對乳制品樣品進行純化后，用高效液相色譜法對其進行檢測，得到檢測結果。本發明的檢測方法簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，尤其可以對低酪蛋白磷酸肽含量的乳制品進行更有效、更精準的檢測。
【專利說明】一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種乳制品中功能性成分的檢測方法，尤其涉及一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法，屬于檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,簡稱CPP)是以牛奶酪蛋白為原料經蛋白酶水解，再經分離純化而得到的含有磷酸絲氨酸族的天然生理活性肽，具有結合鈣和促進鈣吸收的功能，所以又被稱為促鈣吸收因子。
[0003]目前國內外對CPP原料中CPP含量的檢測方法一般采用BaCl2-乙醇法，且乳制品中CPP的含量完全靠誠信添加。國內報道的對乳制品中CPP的檢測方法主要包括毛細管區帶電泳法、液相色譜-質譜聯用法和高效液相色譜法(HPLC)。毛細管區帶電泳法的干擾因索較多，不適于低含量CPP的檢測；液相色譜-質譜聯用法檢測成本高，不適于生產車間對產品的檢測；已報道的高效液相色譜法的文獻中沒有提到乳制品的純化方法，且在市面上無法買到CPP標準品，故該檢測方法在實際應用中很難重復。
[0004]目前檢測CPP成品中的CPP含量時，要先用BaCl2-乙醇法檢測CPP原料中CPP的含量，再以該CPP原料的添加量來推算成品中的CPP含量，過程操作步驟繁瑣，耗時較長，一般需要2-3天才可以得到檢測結果，且檢測結果誤差較大，不適于現代化生產的要求。

【發明內容】

[0005]為解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法。該檢測方法首先對CPP原料進行純化，將其作為標準品，再對經純化的CPP成品進行檢測，得到檢測結果。該檢測方法簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，可以準確、有效的檢測出乳制品中酪蛋白磷酸肽的含量。
[0006]為達上述目的，本發明提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽的檢測方法，其包括以下步驟:
[0007]A、酪蛋白磷酸肽原料的純化
[0008]將酪蛋白磷酸肽原料溶解后，調整pH值為4.6，定容為0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原料溶液，靜置30min ；
[0009]將上述溶液在4°C、5000rpm離心15min，取上清液，加入BaCl2使其濃度為0.05M，混勻后，得到一含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液；
[0010]以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液:無水乙醇=I: 2的體積比，在上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液中加入無水乙醇，混勻后，在4°C靜置12-16小時；
[0011]將上述靜置后的溶液在4°C、5000rpm離心15min，棄去上清液，以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液:H2SO4 = I: 0.4的體積比，在沉淀中加入濃度為0.125M的H2SO4,然后用濾紙過濾；
[0012]取濾液在60_70°C烘干60min，之后在105°C烘干至恒重，得到純化的酪蛋白磷酸肽原料；
[0013]B、標準曲線的繪制
[0014]將上述純化的酪蛋白磷酸肽原料用超純水制備濃度為0.lmg/100mL、
0.5mg/100mL> lmg/100mL、5mg/100mL、IOmg/ 100mL>20mg/10OmT,的系列標準工作液，米用高效液相色譜儀對該系列標準工作液進行檢測分析，繪制標準曲線；
[0015]C、酪蛋白磷酸肽成品的檢測
[0016]Cl、樣品純化
[0017]Cl.1、提取
[0018]當樣品為液態乳制品時:稱取20g樣品，用濃度為I %的三氯乙酸(質量濃度1%的三氯乙酸水溶液)定容至50mL，超聲lOmin，靜置過濾得待凈化液，其中，本領域一般技術人員可以根據實際情況對所述靜置步驟的時間進行調控，優選地，所述靜置的時間為10分鐘；所述過濾步驟所使用的濾紙可以為常規的定性濾紙；
[0019]當樣品為固態乳制品時:稱取5g樣品，用濃度為I %的三氯乙酸溶解后定容至50mL,超聲lOmin，靜置過濾得待凈化液，其中，本領域一般技術人員可以根據實際情況對所述靜置步驟的時間進行調控，優選地，所述靜置的時間為10分鐘；所述過濾步驟所使用的濾紙可以為常規的定性濾紙；
[0020]Cl.2、凈化
[0021]將固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，取適當體積的待凈化液轉移至固相萃取柱中，依次用3mL水和3mL甲醇洗漆,棄去淋洗液后用6mL氨化甲醇洗脫至IOmL具塞試管中，整個固相萃取過程流速不超過lmL/min，將洗脫液于50°C下用氮氣吹干，得到殘留物；
[0022]C2、檢測及計算
[0023]將吹干后得到的殘留物用適當體積流動相A定容，過微孔濾膜后，將得到的上清液采用高效液相色譜儀進行檢測，根據標準曲線及樣品的峰面積計算出樣品中的酪蛋白磷
酸肽含量。
[0024]由于CPP原料純度低的問題，很少有使用CPP原料作為標準品對成品進行檢測的，但是，鑒于目前國內外市面上無法獲得CPP標準品，因此，本發明采用BaCl2-乙醇法對CPP原料進行了純化，將其作為檢測CPP成品的標準品。在上述檢測方法的酪蛋白磷酸肽原料的純化步驟中，可以采用鹽酸調整CPP原料水溶液的pH值至4.6，使酪蛋白沉淀，其中，鹽酸的濃度及添加量可以在順利進行反應的前提下由本領域一般技術人員進行常規的選擇及調控；此外，定容為0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原料溶液只是為了方便后續的計算，但是也可以不將酪蛋白磷酸肽原料溶液的濃度定容為0.2g/mL，只要該濃度下得到的純化的CPP原料能順利制備后續的系列標準工作液即可；在上述CPP原料的純化步驟中，采用兩次離心可以更好地除去雜質，使得到的CPP標準品的純度更高。
[0025]在上述檢測方法中，所采用的高效液相色譜儀及其流動相與色譜條件均可以為檢測酪蛋白磷酸肽含量時常規采用的。優選地，所述高效液相色譜儀為色譜柱為C18250X4.6πιπι，5μπι的高效液相色譜儀。所采用的流動相A可以為色譜純乙腈。
[0026]在上述檢測方法中，所采用的固相萃取柱及固相萃取裝置均為常規的；優選地，所采用的固相萃取柱為強陽離子交換柱(SCX)。根據本發明的【具體實施方式】，在沒有經過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖上在標志峰附近也有峰出現，而經過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖上則少了很多干擾峰。而且，采用固相萃取法將乳制品樣品進行純化，將較純的CPP提取出來后再進行檢測，可以對低CPP含量的乳制品進行更有效、更精準的檢測。因此，本發明采用固相萃取技術對含CPP的乳制品樣品進行純化，可以有效的將CPP與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，操作簡單、省時、省力，達到了減少樣品中的其他物質對檢測造成干擾，進而提高檢測的準確度的效果。
[0027]在上述檢測方法中，優選地，所述過微孔濾膜的孔徑為0.2μπι。
[0028]在上述檢測方法中，優選地，在所述酪蛋白磷酸肽成品的檢測步驟中，轉移至固相萃取小柱中的待凈化液的體積與用于定容殘留物的流動相A的體積相同。
[0029]在上述檢測方法中，優選地，所述轉移至固相萃取小柱中的待凈化的體積與用于定容殘留物的流動相A的體積均為6mL。
[0030]在本發明中，本領域技術人員可以通過上述檢測方法確定樣品中酪蛋白磷酸肽含量的計算方法，該計算方法具體包括以下步驟:先將樣品的峰面積帶入標準曲線，計算出CPP上機濃度，再根據公式1:樣品中CPP含量(mg/100g) = [CPP上機濃度(mg/100mL) X50mL]-樣品質量(g)，計算得到樣品中酪蛋白磷酸肽含量。在此需特別說明的是，在上述CPP成品的檢測過程中，可以包括取6mL的待凈化液轉移至固相萃取小柱中，以及用6mL的流動相A定容殘留物的步驟，因此，最后測得的CPP的濃度與定容后的樣品中CPP的濃度一致，所以，在上述計算公式中，省去中間計算步驟。當上述待凈化液的體積與定容用的流動相A的體積不同時，本領域技術人員能夠對上述計算公式進行轉化，以計算出樣品中CPP含量。
[0031]本發明采用BaCl2-乙醇法對CPP原料進行純化，得到CPP標準品，這樣一來，在每次對乳制品成品進行檢測時，只需采用高效液相色譜法對CPP標準品進行檢測并繪制標準曲線，然后對樣品進行固相萃取純化后采用高效液相色譜法進行檢測，并利用標準曲線得到成品中CPP含量。本發明的檢測方法簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，每次檢測只需I小時就可以得出結果，并且檢測準確度較高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為實施例1的檢測方法中的酪蛋白磷酸肽標準曲線I。
[0033]圖2為實施例2的檢測方法中的酪蛋白磷酸肽標準曲線2。
[0034]圖3為實施例3的檢測方法中的酪蛋白磷酸肽標準曲線3。
[0035]圖4為對比例I的檢測方法中的酪蛋白磷酸肽標準曲線4。
[0036]圖5為實施例1的檢測方法中的樣品中酪蛋白磷酸肽含量檢測的色譜圖。
[0037]圖6為實施例2的檢測方法中的樣品中酪蛋白磷酸肽含量檢測的色譜圖。
[0038]圖7為實施例3的檢測方法中的樣品中酪蛋白磷酸肽含量檢測的色譜圖。
[0039]圖8為對比例I的檢測方法中的樣品中酪蛋白磷酸肽含量檢測的色譜圖。
【具體實施方式】
[0040]在下述實施例及對比例中，所采用的高效液相色譜儀為AgilentllOO液相色譜儀，其色譜條件為:色譜柱為Diamonsil C182 50 X 4.6mm，5ym ;柱溫為25V ;流動相A為色譜純乙腈，流動相B為質量濃度0.1 %的乙酸水溶液；梯度洗脫的條件為:0-25min流動相A由100%;流速為1.00mL/min ;進樣量為20 μ L，紫外檢測器波長為280nm。所采用的固相萃取裝置型號:24-port_visiprep,其生產廠家為supelco公司；所采用的固相萃取柱的型號為5982-3236，其生產廠家為安捷倫公司。
[0041]實施例1
[0042]本實施例提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽的檢測方法，其包括以下步驟:
[0043]A、CPP原料的純化
[0044]稱取IOg CPP原料于50mL燒杯中，用純水溶解，然后用鹽酸將該溶液的pH值調至
4.6，將調整pH值后的溶液轉移并定容至50mL離心管中，靜置30min ；
[0045]將上述溶液在4°C、5000rpm離心15min，取上清液，加入BaCl2使其濃度為0.05M，混勻后，得到約25mL含有BaCl2的CPP原料溶液；
[0046]在上述含有BaCl2的CPP原料溶液中加入約50mL無水乙醇，混勻后，在4°C靜置過夜；
[0047]將上述靜置后的溶液在4°C、5000rpm離心15min，棄去上清液，在沉淀中加入約IOmL濃度為0.125M的H2SO4，然后用濾紙過濾；
[0048]取濾液在60_70°C烘干60min，之后在105°C烘干至恒重，得到純化的CPP原料；
[0049]B、標準曲線的繪制
[0050]將上述純化的CPP原料用超純水稀釋至每100毫升相當于0.1,0.5、l、5、10、20mg的系列標準工作液，采用高效液相色譜儀對該系列標準工作液進行檢測，檢測所得的圖譜進行積分后的峰面積分別為47、210、450、2000、4100、7340，根據上述CPP系列標準工作液的濃度及對應的峰面積之間的關系得出標準曲線1，如圖1所示，所得標準曲線I的線性相關系數為0.996，線性范圍為0.l-20mg/100mL ；
[0051]C、酪蛋白磷酸肽成品的檢測
[0052]Cl、樣品純化
[0053]Cl.1、提取:稱取20.9600g液奶樣品，用I %的三氯乙酸定容至50mL，超聲lOmin，靜置IOmin后過濾得待凈化液。
[0054]Cl.2、凈化:將固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，取6mL的待凈化液轉移至固相萃取柱中，依次用3mL水和3mL甲醇洗漆,棄去淋洗液后用6mL氨化甲醇洗脫至IOmL具塞試管中，整個固相萃取過程流速不超過lmL/min，將洗脫液于50°C下用氮氣吹干，得到殘留物；
[0055]C2、結果計算
[0056]將上述得到的殘留物用6mL流動相A定容，過微孔濾膜后，將得到的上清液采用高效液相色譜儀進行檢測，所得到的色譜圖如圖5所示，該CPP樣品的峰面積為850，套入標準曲線I及公式I計算出該液奶中CPP的含量為4.83mg/100g。
[0057]實施例2
[0058]本實施例提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽的檢測方法，其采用實施例1制得的純化的CPP原料作為標準品進行檢測，所得到的標準曲線2(如圖2所示)的線性相關系數為0.998，線性范圍為0.l-20mg/100mL ;本實施例的酪蛋白磷酸肽成品的檢測步驟基本與實施例1相同，不同之處在于稱取20.5370g液奶樣品進行檢測，所得到的色譜圖如圖6所示，該CPP樣品的峰面積為98，套入標準曲線2及公式I計算出該液奶中CPP的含量為0.12mg/100g。
[0059]實施例3
[0060]本實施例提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽的檢測方法，其采用實施例1制得的純化的CPP原料作為標準品進行檢測，所得到的標準曲線3(如圖3所示)的線性相關系數為0.999，線性范圍為0.l-20mg/100mL ;本實施例的酪蛋白磷酸肽成品的檢測步驟基本與實施例1相同，不同之處在于稱取5.3450g奶粉樣品進行檢測，所得到的色譜圖如圖7所示，該CPP樣品的峰面積為1300，套入標準曲線3及公式I計算出該奶粉中CPP的含量為148.0mg/100g。
[0061]對比例I
[0062]本對比例提供一種乳制品中酪蛋白磷酸肽的檢測方法，其采用實施例1制得的純化的CPP原料作為標準品進行檢測，所得到的標準曲線4(如圖4所示)的線性相關系數為0.997，線性范圍為0.l-20mg/100mL ;本對比例的酪蛋白磷酸肽成品的檢測包括以下步驟:稱取5.0650g奶粉樣品進行檢測，用I %的三氯乙酸定容至50mL，超聲lOmin，靜置IOmin后過濾得到上清液；將所述上清液采用高效液相色譜儀進行檢測。所得到的色譜圖如圖8所示，該CPP樣品的峰面積為1050，套入標準曲線4計算出該奶粉中CPP的含量為123.5mg/100g。
[0063]觀察圖5至圖8可以發現:在沒有經過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖上在標志峰附近也有峰出現(如圖8所示)，而經過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖上則少了很多干擾峰(如圖5、圖6及圖7所示)，尤其在標志峰不明顯的情況下，干擾峰對測試結果存在極為嚴重的影響，因此，采用固相萃取對待測樣品進行純化可以有效減少樣品中的其他物質對檢測造成的干擾，進而提高檢測的準確度。
[0064]檢測方法的準確度驗證
[0065]為確定本發明的檢測方法檢測乳制品中CPP含量的準確度，制備了不同目標濃度的CPP成品，按實施例2的方法檢測成品中CPP的含量，檢測結果如表I所示。
[0066]其中，所述不同目標濃度的CPP成品的制備方法包括以下步驟:
[0067]先計算不同目標濃度的CPP成品所需的CPP原料的量；
[0068]將2-3kg牛奶(不含有CPP)加熱到65-70°C后加入CPP原料，攪拌20min ；
[0069]用牛奶定容至配料量；
[0070]超高溫滅菌后進行灌裝，制備得到不同目標濃度的CPP成品。
[0071]在上述不同目標濃度的CPP成品的制備方法中，需要說明的是，CPP原料中CPP的含量是廠家給出的(BaCl2-乙醇法)，在本驗證實驗中，所采用的CPP原料的CPP含量是17% (重量百分比)，本發明通過此含量計算出不同目標濃度的CPP成品所需的CPP原料的量。
[0072]表I
[0073]
【權利要求】
1.一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測方法，其包括以下步驟: A、酪蛋白磷酸肽原料的純化 將酪蛋白磷酸肽原料溶解后，調整PH值為4.6，定容為0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原料溶液，靜置30min ； 將上述溶液在4°C、5000rpm離心15min，取上清液，加入BaCl2使其濃度為0.05M,混勻后，得到一含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液； 以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液:無水乙醇=I: 2的體積比，在上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液中加入無水乙醇，混勻后，在4°C靜置12-16小時； 將上述靜置后的溶液在4°C、5000rpm離心15min，棄去上清液，以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液:H2S04=1: 0.4的體積比，在沉淀中加入濃度為0.12511的H2SO4,然后用濾紙過濾； 取濾液在60-70°C烘干60min，之后在105°C烘干至恒重，得到純化的酪蛋白磷酸肽原料； B、標準曲線的繪制 將上述純化的酪蛋白磷酸肽原料用超純水制備濃度為0.lmg/100mL、0.5mg/100mL>lmg/ 100mL>5mg/1OOmL> IOmg/ 100mL>20mg/IOOmL的系列標準工作液,采用高效液相色譜儀對該系列標準工作液進行檢測分析，繪制標準曲線； C、酪蛋白磷酸肽成品的檢測 a、樣品純化 al、提取 當樣品為液態乳制品時:稱取20g樣品，用濃度為I %的三氯乙酸定容至50mL，超聲IOmin,靜置過濾得待凈化液； 當樣品為固態乳制品時:稱取5g樣品,用濃度為1%的三氯乙酸溶解后定容至50mL,超聲IOmin,靜置過濾得待凈化液；a2、凈化 將固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，取適當體積的待凈化液轉移至固相萃取小柱中，依次用3mL水和3mL甲醇洗漆,棄去淋洗液后用6mL氨化甲醇洗脫至IOmL具塞試管中，整個固相萃取過程流速不超過lmL/min，將洗脫液于50°C下用氮氣吹干，得到殘留物； b、檢測及計算 將吹干后得到的殘留物用適當體積流動相A定容，過微孔濾膜后，將得到的上清液采用高效液相色譜儀進行檢測，根據標準曲線及樣品的峰面積計算出成品中的酪蛋白磷酸肽含量。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其中，所述固相萃取柱為強陽離子交換柱。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其中，所述微孔濾膜的孔徑為0.2μπι。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其中，在所述酪蛋白磷酸肽成品的檢測步驟中，轉移至固相萃取小柱中的待凈化液的體積與用于定容殘留物的流動相A的體積相同。
5.如權利要求4所述的檢測方法，其中，所述轉移至固相萃取小柱中的待凈化的體積與用于定容殘留物的流動相A的體積均為6mL。
【文檔編號】G01N30/06GK103792298SQ201210433127
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月2日 優先權日:2012年11月2日
【發明者】梁艷, 王艷萍, 任新志, 邵振國 申請人:內蒙古伊利實業集團股份有限公司