鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產品及應用方法

專利名稱：鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產品及應用方法
技術領域：
本發明涉及一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產品及應用方法。
背景技術：
測定尿或腦脊液總蛋白的方法有許多，但就對各種蛋白顯色的一致性來講，雙縮脲顯色法的均一性還是最好的。如目前最常用的鄰苯三酹紅鑰法(PyrogaUol Red.fnolybdate)和氯化節甲乙氧銨(Benzethonium Chloride)尿總蛋白質測定，前者為染料結合法后者為濁度法。由于兩者都與白蛋白和球蛋白反應靈敏性存在差異，故不能準確表達蛋白含量，而雙縮脲法是利用了蛋白質的多肽鍵，所以顯色和蛋白質種類沒關系。臨床大多采用銅雙縮脲法，但是其顯色不太敏感，通常只能用于檢測血清總蛋白等含量較高的體液，而對尿、腦脊液蛋白卻需要沉淀離心濃縮步驟而不能直接檢測。而已報道的鎳-雙縮脲 試劑穩定性、檢測靈敏度也都不能同時達不到對尿、腦脊液蛋白直接檢測要求。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種不需沉淀離心濃縮即可直接測定尿液或腦脊液總蛋白的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產品及應用方法。本發明是這樣實現的一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.(Tl. 4 mol/L氫氧化鈉用O. Γθ. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05 O. 07mol/L三乙醇胺、O. 17 O. 23mol/L檸檬酸三鈉、
O.015^0. 025 mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 14^0. 2mol/L氯化鈉溶液進行溶解,然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3: (Γ5)(2^3)的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑；
3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以4:1飛I體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。步驟2中所述三乙醇胺優選為O. 06mol/L。所述步驟I、步驟2中所述氯化鈉溶液分別優選為O. 154 mol/L。—種如上所述的鎳-雙縮脲試劑的制備方法所制得的產品。一種如上所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，包括如下步驟
a)在濃度為(T8000mg/L的范圍內，用3 7個不同濃度定標液測定總蛋白，得出定標曲線.
b)測定被測樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8 2. 8ml與B組試劑0. 3 0. 7ml混合，然后加入0. 25 0. 35ml被測樣本混合后，放置30°C 40°C水浴2 4小時或避光室溫16 48小時；用分光光度儀測定吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述定標液的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；方式二 生化自動儀測試法取A組試劑
0.18 O. 28ml加入被測樣本O. 025 O. 035ml，混合后放入生化自動儀中，在30°C 40°C水浴4^7分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 03、. 07ml混合后繼續水浴1(Γ25分鐘，測定吸光值，最終測得結果與所述定標液的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量。步驟b的手工比色法中所述分光光度儀在波長為420nnT 470nm處進行吸光值測定。步驟b中所述被測樣本的總蛋白含量在50mg/L 8000mg/L范圍內呈線性。 所述步驟b的生化自動儀測試法中測定吸光值時所在的主波長為420nnT470nm，副波長為650nm 700nm。所述被測樣本在尿液樣本、腦脊液樣本中任選一種。所述步驟b的手工比色法中，所述空白鎳-雙縮脲試劑是指取所述A組試劑
1.8^2. 8ml與B組試劑O. 3^0. 7ml混合，然后用等量的生理鹽水或蒸餾水代替被測樣本加入到A組試劑與B組試劑的混合液中，所述空白鎳-雙縮脲試劑用于對被測樣本所測得的顏色進行校準。本發明發明原理及效果如下
I、本發明所述的空白鎳-雙縮試劑為淺黃色，6個內月穩定，鎳-雙縮脲試劑與被測樣本混合后最終產物為深黃。根據本發明用鎳-雙縮脲試劑盒測定尿液或腦脊液總蛋白的應用方法(簡稱鎳雙縮法)，消光系數可達到O. 459，而銅Doumas法雙縮法復合物消光系數為O. 298，比銅雙縮法高出54%，恰好達到了能夠測定尿液總蛋白的最低要求。其光譜吸收曲線用SHIMABEU-2550型分光光度儀進行掃描，吸收峰為440nm。但是若通過手工比色法，要完成整個反應在37°C需3小時，為了適合自動化分析儀的應用，對生化自動儀的測定過程進行改進，縮短了反應時間，增加了定標點，最后標準曲線呈現拋物線。定標液的蛋白最高定標濃度是2000mg/L，但經過測定，本發明在定標曲線的200(T8000mg/L的延伸范圍依然呈現良好的總蛋白測定結果。2.鎳雙縮法的核心問題是絡合劑。絡合劑的作用就是防止鎳液析出沉淀，增加鎳液穩定性并延長使用壽命。如果鎳液中沒有絡合劑存在，由于鎳的氫氧化物溶解度較小，便可析出淺綠色絮狀含水氫氧化鎳沉淀。硫酸鎳溶于水后形成六水合鎳離子，如果六水合鎳離子中有部分絡合劑存在則可以明顯提高其抗水解能力，甚至有可能在堿性環境中以鎳離子形式存在。不過，pH值增加，六水合鎳離子中的水分子會被OH根取代，促使水解加劇，要完全抑制水解反應，鎳離子必須全部螯合以得到抑制水解的最大穩定性。但是加入絡合劑使試劑中游離鎳離子濃度大幅度下降，從質量作用定律看降低反應物濃度反而提高了反應速度是不可能的，因此合適的絡合劑則要求它們具有較大的溶解度，存在一定的反應活性。經過研究和反復實驗，發現三乙醇胺絡合能力雖較差在堿性條件下較穩定，PH11-13時能隱蔽Fe、Al、Mn等，可用于乙二胺四乙酸(EDTA)對鎳滴定的隱蔽齊U。符合使游離的鎳離子既不能太多使產生沉淀，也不能太少而影響雙縮脲顯色法的速度的要求。
3.黃疸尿光譜分析其色素變化規律為
I)尿液分析呈單一膽紅素峰。2)尿液中出現兩種吸收峰，一種吸收峰為420nm的膽紅素、另一種吸收峰為492nm的尿膽素，其中膽紅素為主。3)各種原因引起紅細胞大量破壞，肝臟超負荷代謝，至使尿膽原、尿膽素顯著增高。同時大量血紅蛋白(Hb)超過結合球蛋白等結合能力，從濾膜濾出。因此除尿膽素吸收峰外，尚可見吸收峰在415nm、540nm、575nm的血紅蛋白(Hb)特異吸收峰,其中以吸收峰在415nm為主。而膽紅素的吸收峰在420nm與自動化分析儀的450nm相近,具有干擾作用。考慮到膽紅素在堿性條件下的分解情況，本發明 的生化自動儀測試法中特意把含有氫氧化鈉液的A試劑放在I號試劑位，與2號位的B試劑三乙醇胺分開存放，使三乙醇胺避開強堿性而更穩定，并把第I次測定點設在樣品加入A試劑后Γ7分鐘以用于膽紅素分解，膽紅素濃度〈0.07262mol/L時，對結果無影響。本發明產品在制備時三乙醇胺的最佳濃度在O. 05、. 07mol/L之間濃度，三乙醇胺濃度和試劑空白具有一定關系，當二乙醇胺的濃度提聞時，試劑空白也會隨之相應提聞，而O. O 6 mol/L就是在確保反應速度的前提下盡可能減少空白值是最佳點。當三乙醇胺的濃度再提高時反應速度沒提高而只是提高了試劑空白。使最低檢測靈敏度下降。經過反復實驗發現氯化鈉的存在可以加快鎳雙縮法的反應速度，而在氯化鈉達到O. 154mol/L后，則加快作用不再增加。本發明的有益效果是本發明根據雙縮脲在堿性條件下除能與銅形成絡合物外，還能與鉆、鎳、鋅等結合，且與鎳-螯合物配制雙縮脲顯色較為靈敏的特點，通過研究和各種改進建立了蛋白檢測范圍50mg/L-8000mg/L且能用于自動化分析的方法，使雙縮脲顯色法的應用領域得到了擴展。本發明的產品在用于測定尿液總蛋白時，不需沉淀離心濃縮、可以直接準確的測定尿液/腦脊液總蛋白。以生化自動儀測試法測定20例尿液蛋白并與鎢酸沉淀離心銅雙縮脲法、鄰苯三酚紅鑰法、氯化芐甲乙氧銨法同時檢測，蛋白濃度在68-3684mg/L之間，結果配對t檢驗分析顯示鎳雙縮脲法與鎢酸沉淀離心銅雙縮脲法間P>0. 05無顯著差異。而鄰苯三酚紅鑰法偏高，氯化芐甲乙氧銨法偏低，說明鎳雙縮脲法具有銅雙縮脲沉淀離心法的準確性，卻同時有著直接測定的便利性，值得推廣。
具體實施例方式本發明鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.(Tl. 4mol/L氫氧化鈉用O. Γθ. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05 O. 07mol/L三乙醇胺、O. 17 O. 23mol/L檸檬酸三鈉、O. 015^0. 025mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 14^0. 2mol/L氯化鈉溶液進行溶解,然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3: (Γ5) : (2^3)體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以4:1飛I體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。
本發明鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，包括如下步驟
a)定標曲線可通過常規手工比色法和常規生化自動儀測試法兩種方法進行定標得至IJ，定標曲線在用常規手工比色法定標時，在濃度為(TSOOOmg/L的范圍內用2 7個不同濃度定標液測定總蛋白，得出定標曲線呈直線；在用常規生化自動儀測試法定標時在濃度為(T2000mg/L的范圍內用5 7個不同濃度定標液測定總蛋白，得出定標曲線呈拋物線。所述的用定標液得出定標曲線的方法為常規的現有技術，本發明不作詳述。b)測定被測樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8 2. 8 ml (優選2. 3 2. 7ml)與B組試劑O. 3 O. 7ml混合，然后加入O. 25 O. 35ml被測樣本混合后，放置30°C 40°C水浴2 4小時或避光室溫16 48小時；用分光光度儀測定在波長為420nnT470nm處的吸光值，并用空白·鎳-雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；所述被測樣本的總蛋白含量在50mg/L 8000mg/L范圍內呈線性。所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水或蒸餾水代替被測樣本，即在取所述A組試劑I. 8 2. 8 ml與B組試劑O. 3 O. 7ml混合后，加入O. 25 O. 35ml的生理鹽水或蒸餾水混合。所述空白鎳-雙縮脲試劑用于對被測樣本所測得的顏色進行校準。方式二 生化自動儀測試法-M A組試劑O. 18 O. 28ml (優選O. 23m廣O. 27ml)加入被測樣本O. 025πιΓθ. 035ml，混合后放入生化自動儀中，在30°C 40°C水浴4 7分鐘后在主波長為42(T470nm，副波長為65(T700nm處測定吸光值，然后加入B組試劑O. 03 O. 07ml混合后繼續水浴10 25分鐘，在主波長為42(T470nm，副波長為65(T700nm處測定吸光值，最終測得結果與所述定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量。所述被測樣本在尿液樣本、腦脊液樣本中任選一種。本發明所使用的分光光度儀主要包括以下幾種中的任意一種日本島京公司生產的、型號為SHIMABEU-2550型的分光光度儀；上海上分公司生產的、型號為721-100的分光光度儀；美國哈希公司生產的、型號為DR2700-01的分光光度儀；上海尤尼柯公司生產的、型號為7200的分光光度儀。本發明所使用的生化自動儀主要包括以下幾種中的任意一種日本日立公司生產的、型號為=HITACH 17170型的全自動生化分析儀；德國羅氏公司公司生產的、型號為MODULAR P-800模塊的生化自動儀；美國雅培公司生產的、型號為Aeroset的生化自動儀；德國西門子公司生產的、型號為ADBIA0R2400的生化自動儀。以上所述分光光度儀與生化自動儀的型號具有代表性，是為了進一步說明本發明，而非對本發明的限制。下面通過具體實施例對本發明作進一步闡述。實施例一本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.2mol/L氫氧化鈉用O. 154mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05mol/L三乙醇胺、O. 2mol/L檸檬酸三鈉、O. 02mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 154mol/L氯化鈉溶液進行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:2的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。
3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑按5:1體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測定尿液總蛋白的應用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內，通過常規生化自動儀測試法，用6個不同濃度的定標液測定總蛋白，得出定標曲線。b)以加入已知血清含量的尿液樣本作為被測樣本，測定尿液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑2. 5ml與B組試劑O. 5ml混合，然后加入O. 3ml尿液樣本混合后，放置37°C水浴3小時；用分光光度儀測定在波長為440nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述的定標曲線進行對照，根據定 標曲線得出被測樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測樣本加入A組試劑和B組試劑進行混合，用于對被測樣本所測得的顏色進行校準。根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內符合準確度要求。方式二 生化自動儀測試法取A組試劑O. 25ml加入尿液樣本O. 03ml，混合后放入生化自動儀中，在37°C水浴5分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 05ml混合后繼續水浴15分鐘，在主波長為450nm，副波長為700nm處測定吸光值，最終測得結果與所述標準液定值進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內符合準確度要求。實施例二 本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.2mol/L氫氧化鈉用O. 154mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05mol/L三乙醇胺、O. 2mol/L檸檬酸三鈉、O. 02mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 154mol/L氯化鈉溶液進行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:2體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以5:1體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測定腦脊液總蛋白的應用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內，通過常規生化自動儀測試法，用6個不同濃度的定標液測定總蛋白，得出定標曲線。b)以加入已知血清含量的腦脊液作為被測樣本，測定腦脊液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法手工比色法取所述A組試劑2. 5ml與B組試劑O. 5ml混合，然后加入O. 3ml離心后腦脊液樣本混合后，放置避光室溫48小時；用分光光度儀測定在波長為440nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測樣本，用于對被測樣本所測得的顏色進行校準，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內符合準確度要求。方式二 生化自動儀測試法取A組試劑O. 25ml加入腦脊液樣本O. 03ml，混合后放入生化自動儀中，在37°C水浴5分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 05ml混合后繼續水浴15分鐘，在主波長為450nm，副波長為700nm處測定吸光值，最終測得結果與所述標準液定值進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內符合準確度要求。實施例三本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.OmoI/L氫氧化鈉用O. 18mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.065mol/L三乙醇胺、O. 21mol/L檸檬酸三鈉、O. 015mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 18mol/L氯化鈉溶液進行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:3的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以5:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。 本例用鎳-雙縮脲試劑測定尿液總蛋白的應用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內，用5個不同濃度的定標液測定總蛋白，得出定標曲線。b)以加入已知血清含量的尿液作為被測樣本，測定尿液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8ml與B組試劑O. 36ml混合，然后加入O. 28ml尿液樣本混合后，放置37°C水浴2. 2小時或避光室溫30小時；用分光光度儀測定在波長為420nm處的吸光值，并用空白鎳_雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測樣本，用于對被測樣本所測得的顏色進行校準，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量在50mg/L-7500mg/L范圍內符合準確度要求。方式二 生化自動儀測試法取A組試劑O. 18ml加入被測樣本O. 028ml，混合后放入生化自動儀中，在35°C水浴4. 3分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 036ml混合后繼續水浴18分鐘，在主波長為450nm，副波長為650nm處測定吸光值，最終測得結果與所述標準液定值進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量在50mg/L-6000mg/L范圍內符合準確度要求。實施例四本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.25mol/L氫氧化鈉用O. 154mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.06mol/L三乙醇胺、O. 18mol/L檸檬酸三鈉、O. 017mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 154mol/L氯化鈉溶液進行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:4:3的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以4:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測定尿液總蛋白的應用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內，用5個不同濃度的定標液測定總蛋白，得出定標曲線。b)以加入已知血清含量的尿液作為被測樣本，測定尿液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑2. 8ml與B組試劑O. 7ml混合，然后加入O. 35ml尿液樣本混合后，放置33°C水浴3. 5小時或避光室溫40小時；用分光光度儀測定在波長為450nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測樣本，用于對被測樣本所測得的顏色進行校準，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量為50mg/L-7500mg/L范圍內，符合準確度要求。方式二 生化自動儀測試法取A組試劑O. 28ml加入被測樣本O. 035ml，混合后放入生化自動儀中，在33°C水浴4分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 07ml混合后繼續水浴25分鐘，在主波長為470nm，副波長為700nm處測定吸光值，最終測得結果與所述標準液的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量為50mg/L-6000mg/L。實施例五本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.4mol/L氫氧化鈉用O. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.07mol/L三乙醇胺、O. 23mol/L檸檬酸三鈉、O. 025mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 2mol/L氯化鈉溶液進行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:4:2的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以6:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測定腦脊液總蛋白的應用方法，包括如下步驟
a)在(TSOOOmg/L的范圍內，通過常規手工比色法，用7個不同濃度的定標液測定總蛋白，得出定標曲線。b)以加入已知血清含量的腦脊液作為被測樣本，測定腦脊液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8ml與B組試劑O. 3ml混合，然后加入O. 25ml腦脊液樣本混合后，放置30°C水浴4小時或避光室溫16小時；用分光光度儀測定在波長為470nm處的吸光值，并用空白鎳_雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的蒸餾水代替被測樣本，用于對被測樣本所測得的顏色進行校準，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量為5(T5800 mg/L范圍內，符合準確度要求。方式二 生化自動儀測試法取A組試劑O. 18ml加入被測樣本O. 025ml，混合后放入生化自動儀中，在30°C水浴7分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 03ml混合后繼續水浴10分鐘，在主波長為420nm，副波長為620nm處測定吸光值，最終測得結果與所述標準液的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量為5(T5500 mg/L。實施例六本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.3mol/L氫氧化鈉用O. 14mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.065mol/L三乙醇胺、O. 17mol/L檸檬酸三鈉、O. 016mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 14mol/L氯化鈉溶液進行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:3的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以4:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測定腦脊液總蛋白的應用方法，包括如下步驟
a)定標曲線在用常規手工比色法定標時，在濃度為(T8000mg/L的范圍內用3個不同濃度定標液測定總蛋白，得出定標曲線，在用常規生化自動儀測試法定標時在濃度為(T2000mg/L的范圍內用5個不同濃度定標液測定總蛋白，得出定標曲線。b)以加入已知血清含量的腦脊液作為被測樣本，測定腦脊液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑2. 7ml與B組試劑O. 675ml混合，然后加入
O.32ml腦脊液樣本混合后，放置40°C水浴2小時或避光室溫20小時；用分光光度儀測定在波長為430nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是 指用等量的蒸餾水代替被測樣本，用于對被測樣本所測得的顏色進行校準，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量為5(T5600 mg/L范圍內，符合準確度要求。方式二 生化自動儀測試法取A組試劑O. 27ml加入被測樣本O. 032ml，混合后放入生化自動儀中，在40°C水浴6分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 0675ml混合后繼續水浴20分鐘，在主波長為430nm，副波長為630nm處測定吸光值，最終測得結果與所述標準液的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量為5(T5200 mg/L。表I全自動生化儀回收試驗實施例一、三、四測試結果如下(單位mg/L)
權利要求
1.一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)制備A組試劑將I.(Tl. 4 mo I/L氫氧化鈉用O. Γθ. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑； 2)制備B組試劑將O.05 O. 07mol/L三乙醇胺、O. 17 O. 23mol/L檸檬酸三鈉、O.015^0. 025 mo I/L六水合硫酸鎳分別用O. 14^0. 2mol/L氯化鈉溶液進行溶解,然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3: (Γ5)(2^3)的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑； 3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時將A組試劑與B組試劑以4:1飛I體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。
2.根據權利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于步驟2中所述三乙醇胺為O. 06mol/L。
3.根據權利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟I、步驟2中所述氯化鈉溶液分別為O. 154 mol/L。
4.一種如權利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑的制備方法所制得的產品。
5.—種如權利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，其特征在于包括如下步驟 a)在濃度為(T8000mg/L的范圍內，用3 7個不同濃度定標液測定總蛋白，得出定標曲線. b)測定被測樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8 2. 8ml與B組試劑O. 3 O. 7ml混合，然后加入O. 25 O. 35ml被測樣本混合后，放置30°C 40°C水浴2 4小時或避光室溫16 48小時；用分光光度儀測定吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測得的結果與步驟a中所述定標液的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量；方式二 生化自動儀測試法取A組試劑O.18 O. 28ml加入被測樣本O. 025 O. 035ml，混合后放入生化自動儀中，在30°C 40°C水浴4^7分鐘后測定吸光值，然后加入B組試劑O. 03、. 07ml混合后繼續水浴1(Γ25分鐘，測定吸光值，最終測得結果與所述定標液的定標曲線進行對照，根據定標曲線得出被測樣本總蛋白含量。
6.根據權利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，其特征在于步驟b的手工比色法中所述分光光度儀在波長為420nnT 470nm處進行吸光值測定。
7.根據權利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，其特征在于步驟b中所述被測樣本的總蛋白含量在50mg/L 8000mg/L范圍內呈線性。
8.根據權利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，其特征在于所述步驟b的生化自動儀測試法中測定吸光值時所在的主波長為420nnT470nm，副波長為650nm 700nm。
9.根據權利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，其特征在于所述被測樣本在尿液樣本、腦脊液樣本中任選一種。
10.根據權利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產品的應用方法，其特征在于所述步驟b的手工比色法中，所述空白鎳-雙縮脲試劑是指取所述A組試劑.1.8~2. 8ml與B組試劑O. 3~0. 7ml混合，然后用等量的生理鹽水或蒸餾水代替被測樣本加入到A組試劑與B組試劑的混合液中，所述空白鎳-雙縮脲試劑用于對被測樣本所測得的顏色進行校準。
全文摘要
本發明為一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產品及應用方法。本發明產品的制備方法包括如下步驟1)將1.0~1.4mol/L氫氧化鈉用0.14~0.2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；2)將0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L檸檬酸三鈉、0.015~0.025mol/L六水合硫酸鎳分別用0.14~0.2mol/L氯化鈉溶液進行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:(4~5):(2~3)的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)使用時將A組試劑與B組試劑以41~61的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本發明的優點是對各種蛋白顯色的一致性好且靈敏度較高，線性范圍大。
文檔編號G01N21/31GK102944525SQ20121043223
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者忻鼎廣 申請人:上海市東方醫院