專利名稱：一種檢測總抗氧化能力的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，特別涉及一種檢測總抗氧化能力的試劑盒。
背景技術：
自由基，化學上也稱為“游離基”，是含有一個不成對電子的原子團。隨著自由基學說和生物醫學的發展，自由基與疾病的關系受到了廣泛的重視。研究表明自由基誘導氧化應激，參與許多疾病的病理過程。當體內過量的自由基會損傷蛋白質、細胞膜，促使細胞組織DNA突變，從而誘發或加速人體多種疾患的產生與惡化。在輻射損傷、炎癥和應急反應、腫瘤病變、再灌注損傷、衰老等多種情況下，多伴隨自由基異常劇增。大量研究證明，機體內的抗氧化防御系統一旦失衡，就會產生氧化損傷。抗氧化物質是防病治病的關鍵，是減少機 體氧化損傷最有效的方法。因此檢測體內抗氧化能力就顯得異常重要。總抗氧化能力的測定有利于掌握機體的防御能力，以調節機體的總抗氧化能力，提高機體對自由基的清除，可有效地控制各種疾病的不斷惡化，為臨床醫生實施抗氧化輔助治療提供依據。目前研究機體抗氧化能力(包括內源性與外源性氧自由基清除劑的抗氧化能力)是分析機體某種特定抗氧化成分和(或)自由基代謝產物的變化，如脂質過氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸、維生素E、p胡蘿卜素等。常用的抗氧化能力檢測方法有體內實驗法和體外活性實驗法。雖然體內試驗法接近生物體比較靈敏，但周期長，成本大，實驗繁瑣。結合國情，抗氧化活性應用體外活性試驗法(化學分析法)比較適合。體外實驗法中常檢測的是單一的抗氧化成分，難以準確反映生物體實際抗氧化應激能力，因為單一成分的變化尚不能完全說明氧化損傷已經發生及其發生程度。由于機體抑制不同氧化物的效率不同，因此評價機體真正的抗氧化能力是很困難的。總的抗氧化能力能夠反應機體所有抗氧化能力，比單個的抗氧化測定能更好地反應抗氧化劑狀態。
發明內容
本發明的目的為提供可以檢測羥自由基0H-、氧自由基O-、酯自由基ROO-以及所有壞境污染人體所產生的自由基的清除能力，供分光光度計、酶標儀以及全自動生化分析儀使用的一種檢測總抗氧化能力的試劑盒。為了實現上述目的，本發明的技術方案為
該檢測總抗氧化能力的試劑盒，其包括Rl試劑和R2試劑，Rl試劑和R2試劑的體積比為 11:1
a、所述的Rl試劑包括A液和B液，A液和B液的體積比為10:1 ;
所述的A液各組分及其在A液中的濃度范圍為
醋酸鹽I. 5 X Kr2 2. 5 X l(T2g/mL
其余為雙蒸水；
調節A液的pH值至3.6 ;所述的B液各組分及在B液中的濃度范圍為
絡合物 TPTZ2. OX 10^5. O X 1(T3 g/mL
30 60mmol/L 酸3. O X 10^5. O X 1(T3 mL/mL
其余為雙蒸水；
b、R2試劑包括氧化劑FeCl3，氧化劑FeCl3在R2試劑中的濃度范圍為5 X 10_3 6 X 10_3g/mL,其余為雙蒸水。
所述的醋酸鹽為醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。所述的酸為鹽酸、氫碘酸、氫溴酸或醋酸中的一種或兩種以上混合物。本發明的制備方法為
a、按照技術方案所述購買AR級別的試劑并經檢驗合格。b、確定需制備的各試劑總體積，按技術方案計算并稱量或量取各組分。C、將Rl試劑A液配成醋酸鹽緩沖液，余量用雙蒸水補足，攪拌至溶解；R1試劑B液將絡合物TPTZ溶于用雙蒸水稀釋后的酸類溶液中充分攪拌至全溶；R2試劑配成氧化劑FeCl3溶液，余量用雙蒸水補足。以上所有步驟均在超凈臺完成。FRAP法測定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)產生藍色的 Fe2+-TPTZ,隨后測定藍色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。由于反應在酸性條件下進行，可以抑制內源性的一些干擾因素。并且由于血漿等樣品中的鐵離子或亞鐵離子的總濃度通常低于10 μ M，因此血漿等樣品中的鐵離子或亞鐵離子不會顯著干擾FRAP法的檢測反應。由于反應體系中的鐵離子或亞鐵離子是和TPTZ螯合的，樣品本身含有的少量金屬離子螯合劑通常也不會顯著影響檢測反應。本發明采用FRAP法，可以對血漿、血清、唾液、尿液等各種體液的各種抗氧化物溶液的總抗氧化能力進行檢測的試劑盒。檢測的是總的抗氧化能力，能夠反應機體所有抗氧化能力，比單個的抗氧化測定能更好地反應抗氧化劑狀態。被檢測樣品為血清時可為新鮮樣品或-80°C凍存一個月內的樣品，其余樣品儲存在_20°C，溶解后置于4 8°C冰箱中可放置五天。利用分光光度計、酶標儀或全自動生化分析儀分析，自動化程度高，有助于日常檢驗工作的推廣。分析生物樣品時，在比較大的樣品終濃度范圍內，總抗氧化能力測定值與樣品稀釋度呈線性關系。且測定值與體內試驗數據相關性程度高。本發明的耗材僅消費90元/IOOmL,與進口總抗氧化能力試劑售價約為6000元/IOOmL相比，大大降低成本。本發明采用以上技術方案采用FRAP方法，檢測被檢樣品的總抗氧化能力，能夠反應機體所有抗氧化能力，比單個的抗氧化測定能更好地反應抗氧化劑狀態。可利用分光光度計、酶標儀或全自動生化分析儀分析，自動化程度高，有助于日常檢驗工作的推廣。測定值與體內試驗數據相關性程度高。且制作成本低。
具體實施例方式檢測總抗氧化能力的試劑盒，其包括Rl試劑和R2試劑，Rl試劑和R2試劑的體積比為11:1:a、所述的Rl試劑包括A液和B液，A液和B液的體積比為10:1;
所述的A液各組分及其在A液中的濃度范圍為
醋酸鹽I. 5 X Kr2 2. 5 X l(T2g/mL
其余為雙蒸水；
調節A液的pH值至3.6 ;
所述的B液各組分及在B液中的濃度范圍為
絡合物 TPTZ2. OX 10^5. O X 1(T3 g/mL
30 60mmol/L 酸3. O X 10^5. O X 1(T3 mL/mL
其余為雙蒸水；
b、R2試劑包括氧化劑FeCl3，氧化劑FeCl3在R2試劑中的濃度范圍為5X 10_3 6 X 10_3g/mL,其余為雙蒸水。所述的醋酸鹽為醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。所述的酸為鹽酸、氫碘酸、氫溴酸或醋酸中的一種或兩種以上混合物。本發明的制備方法為
a、按照技術方案所述購買AR級別的試劑并經檢驗合格。b、確定需制備的各試劑總體積，按技術方案計算并稱量或量取各組分。 C、將Rl試劑A液配成醋酸鹽緩沖液，余量用雙蒸水補足，攪拌至溶解，調節A液的pH至3. 6 ；R1試劑B液將絡合物TPTZ溶于用雙蒸水稀釋后的酸類溶液中充分攪拌至全溶；R2試劑配成氧化劑FeCl3溶液，余量用雙蒸水補足。以上所有步驟均在超凈臺完成。實施例I
本發明所述的總抗氧化能力檢測試劑盒，其包括Rl試劑和R2試劑，Rl試劑和R2試劑的體積比為11:1 :
按下表成分稱量和量取，
Rl試劑A液
醋酸鈉3. 75g
溶于雙蒸水中，用醋酸調節PH至3. 6，配成250mLA液。Rl試劑B液
TPTZO.05g 30 60mmol/L 鹽酸O. 075mL
雙蒸水25mL
攪拌溶解即可 R2試劑
FeCl3O.125g
雙蒸水25mL
攪拌溶解即可
Rl與R2即用即混型試劑
實施例2
本發明所述的總抗氧化能力檢測試劑盒的配制方法為按下表成分稱量和量取，Rl試劑A液
醋酸鉀5. Og
溶于雙蒸水中，用醋酸調節PH至3. 6，配成250mLA液。Rl試劑B液
TPTZO.078g
30 60mmol/L 氧鵬酸O. 1mT,
雙蒸水25mL
攪拌溶解即可 R2試劑
FeCl3O.135g
雙蒸水25mL
攪拌溶解即可 Rl與R2即用即混 實施例3
本發明所述的總抗氧化能力檢測試劑盒的配制方法為按下表成分稱量和量取， Rl試劑A液
醋酸銨6. 25g
溶于雙蒸水中，用醋酸調節PH至3. 6，配成250mLA液。Rl試劑B液
TPTZO.125mg
30 60mmol/L 醋酸O. 125mL·雙蒸水25mL
攪拌溶解即可 R2試劑
FeCl3O.15g
雙蒸水25mL
攪拌溶解即可 Rl與R2即用即混 實施例4
本發明所述的總抗氧化能力檢測試劑盒的配制方法為按下表成分稱量和量取， Rl試劑A液
醋酸銨6. 25g
溶于雙蒸水中，用醋酸調節PH至3. 6，配成250mLA液。Rl試劑B液
TPTZO.125mg
30 60mmol/L醋酸和氫溴酸混合液O. 125mL
雙蒸水25mL
攪拌溶解即可
R2試劑FeCl3O.15g
雙蒸水25mL
攪拌溶解即可 Rl與R2即用即混
采用以上實施例I的試劑盒對血清的總抗氧化能力檢測如下
采用酶標儀測定總抗氧化能力的具體操作步驟
(I)在96孔酶標板的每個檢測孔中加入180 μ L FRAP工作液(Rl與R2的混合溶液)。(2)在空白對照孔中加入5 μ L蒸餾水或PBS溶液；·
在標準曲線檢測孔內加入5 μ L不同濃度的FeSO4標準溶液；
在部分樣品檢測孔內加入5μ L血清，輕輕混勻；另一部分樣品檢測孔內加入
O.15^1. 5mmol/L的Trolox (水溶性維生素E)作為陽性對照。(3) 37°C孵育3 5min后在波長593nm處測各孔吸光值，如果測定593nm有困難，也可在585飛05nm波長范圍內進行測定。(4)根據標準曲線檢測孔測定的吸光值做出標準曲線。(5)根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。
權利要求
1.一種檢測總抗氧化能力的試劑盒，其特征在于其包括Rl試劑和R2試劑，Rl試劑和R2試劑的體積比為11:1 : a、所述的Rl試劑包括A液和B液，A液和B液的體積比為10:1; 所述的A液各組分及其在A液中的濃度范圍為 醋酸鹽I. 5 X Kr2 2. 5 X l(T2g/mL 其余為雙蒸水； 調節A液的pH值至3.6 ; 所述的B液各組分及在B液中的濃度范圍為 絡合物 TPTZ2. OX 10^5. O X 1(T3 g/mL 30 60mmol/L 酸3. O X 10^5. O X 1(T3 mL/mL 其余為雙蒸水； b、R2試劑包括氧化劑FeCl3，氧化劑FeCl3在R2試劑中的濃度范圍為5X 10_3 6 X 10_3g/mL,其余為雙蒸水。
2.根據權利要求I所述的一種檢測總抗氧化能力的試劑盒，其特征在于所述的醋酸鹽為醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。
3.根據權利要求I所述的一種檢測總抗氧化能力的試劑盒，其特征在于所述的酸為鹽酸、氫碘酸、氫溴酸或醋酸中的一種或兩種以上混合液。
全文摘要
本發明涉及一種檢測總抗氧化能力的試劑盒，其包括R1試劑和R2試劑，R1試劑和R2試劑的體積比為11:1所述的R1試劑包括A液和B液，A液和B液的體積比為10:1；所述的A液包括醋酸鹽，其余為雙蒸水；所述的B液包括絡合物TPTZ，酸，其余為雙蒸水；R2試劑包括氧化劑FeCl3，其余為雙蒸水。本發明采用FRAP方法，檢測被檢樣品的總抗氧化能力，能夠反應機體所有抗氧化能力，比單個的抗氧化測定能更好地反應抗氧化劑狀態。可利用分光光度計、酶標儀或全自動生化分析儀分析，自動化程度高，有助于日常檢驗工作的推廣。測定值與體內試驗數據相關性程度高。且制作成本低。
文檔編號G01N33/543GK102890066SQ20121042609
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者林惠, 羅水華 申請人:福建新大陸生物技術股份有限公司