專利名稱：同時檢測磺胺類和喹諾酮類藥物的elisa方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種同時檢測磺胺類和喹諾酮類藥物的ELISA方法及其試劑盒。
背景技術：
磺胺類藥,英文名稱為Sulfonamides,是通過人工合成的氨苯磺胺衍生物,主要用于預防和治療細菌感染性疾病。代表藥物有磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、 磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉等。磺胺類藥物一般為白色或淡黃色結晶性粉末，遇光易變質，顏色逐漸變深，大多數本類藥物不易在水中溶解，但易溶于稀堿。形成鈉鹽后易溶于水， 其水溶液呈強堿性。磺胺類藥物能抑制革蘭氏陽性菌及一些陰性菌，可以治療多種細菌感染，在獸醫臨床上廣泛應用于治療由敏感細菌感染的各種畜禽疾病。主要是通過干擾細菌的葉酸代謝而抑制細菌的生長繁殖。有些細菌生長時需要的一種“生長物質” 一對氨苯甲酸(PABA)，而磺胺類藥的化學結構與氨基苯甲酸很像，它可以與氨苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，妨礙二氫葉酸的形成從而最終影響細菌核蛋白的合成，從而抑制細菌的生長繁殖。
由于磺胺類藥物在體內的作用和代謝時間較長，通過任何途徑攝入的磺胺都有可能在人體內蓄積。蓄積濃度超過一定值時，就會對人體造成損害。短時間大劑量或長時間小劑量的刺激可分別引起急性或慢性中毒，影響機體的泌尿、免疫系統，破壞肌肉、腎臟和甲狀腺等組織，如誘發人的甲狀腺癌等。另外，人體內長期存在磺胺會導致許多細菌對磺胺類藥物產生抗藥性。因此，國際食品法典委員會(CAC)和許多國家規定，動物性食品中磺胺類總量的最大殘留限量(MRL)為O. lmg/kg。
喹諾酮類(Quinolones, QNs),是一類人工合成的含4_喹諾酮基本結構，對細菌 DNA螺旋酶具有選擇性抑制的抗生素。1962年最早的喹諾酮類藥物萘啶酸首先用于臨床， 由于其抗菌譜窄、口服吸收差、副作用高等原因現在已很少使用。當前應用的喹諾酮大多為含有氟原子的氟喹諾酮類。這類藥物抗菌譜廣，對革蘭氏染色呈陰性桿菌活性較高，對其他抗生素耐藥的細菌也具有良好的抗菌作用，無交叉耐藥性；在體內分布廣，體內和組織中藥物濃度高；口服吸收好，半衰期長，使用方便；與頭孢菌素類藥物相比，抗菌作用相似，但價格便宜。目前在獸醫臨床上常用的藥物主要有諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星、氟甲喹等十幾種，隨著應用的增加，其各種毒副作用也逐漸顯現出來，主要體現在頭暈、低血糖、惡心、胃腸道癥狀、中樞神經系統和過敏反應。特別是近幾年，嚴重的不良反應發生率約為I. 6%-1. 8%，引起了全世界的關注。為了保障動物源性食品的安全，歐盟、美國及我國等很多國家都對喹諾酮類藥物在動物源性食品中殘留制定了最大殘留限量(MRL)。 我國農業部文件(農質發20093號文件)中規定了 2009年我國畜禽產品監測項目，禽肉中4種喹諾酮類藥物殘留是重要的監測項目之一。
現有的磺胺和喹諾酮藥物的檢測方法多為色譜法，這些方法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響較大，再者這些方法需要復雜的儀器，過程繁瑣，不適應現場大量樣本的篩查，且目前現有的快速檢測產品存在一定的局限性，無法同時檢測磺胺和喹諾酮類物質的殘留。本檢測方法簡便、靈敏，可同時檢測數十個甚至上百個樣品，不需要昂貴的儀CN 102928597 A書明說2/17 頁器設備和專業的分析人員，特別適合企業進行現場監測，易于推廣。發明內容
本發明的一個目的是提供一種同時檢測磺胺藥物和喹諾酮藥物的酶聯免疫試劑盒，包括包被原、檢測抗體和酶標抗體；
所述包被原為磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物和喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物的混合物、
所述檢測抗體為磺胺藥物的特異性抗體和喹諾酮藥物的特異性抗體的混合物；
所述酶標抗體為如下I)或2)的酶標記的抗抗體組合物
I)辣根過氧化物酶標記的抗所述磺胺藥物的特異性抗體的抗抗體和堿性磷酸酶標記的抗所述喹諾酮藥物的特異性抗體的抗抗體；
2)辣根過氧化物酶標記的抗所述喹諾酮藥物的特異性抗體的抗抗體和堿性磷酸酶標記的抗所述磺胺藥物的特異性抗體的抗抗體。
在上述試劑盒中，所述磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物和喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物包被于同一酶標板上，也可以分別獨立包裝，在使用時包被于同一酶標板上。
在上述試劑盒中，所述磺胺藥物的特異性抗體和所述喹諾酮藥物的特異性抗體混合包裝于同一溶液中，也可以 分別獨立包裝，在使用時混合加入。
在上述試劑盒中，所述酶標記的抗抗體組合物混合包裝于同一溶液中，也可以分別獨立包裝，在使用時混合加入。
在上述試劑盒中，所述磺胺藥物的特異性抗體為所述磺胺藥物的單克隆抗體；和 /或，所述喹諾酮藥物的特異性抗體為所述喹諾酮藥物的單克隆抗體。
在上述試劑盒中，所述磺胺藥物的單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No. 3393的磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs分泌產生，對磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶有交叉反應；
和/或，所述喹諾酮藥物的單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No. 3779的諾氟沙星單克隆抗體雜交瘤細胞株QNs分泌產生，對諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星有交叉反應。
在上述試劑盒中，所述磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物為磺胺二甲基嘧啶半抗原與卵清蛋白的偶聯物，所述喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物為諾氟沙星半抗原與卵清蛋白的偶聯物。
在上述試劑盒中，還含有6種標準品溶液，所述6種標準品溶液的溶劑為PBS緩沖液，溶質為磺胺二甲基嘧啶和諾氟沙星；所述溶質在所述6種標準品溶液中的濃度分別為 O μ g/L 和 O μ g/L，O. 5 μ g/L 和 O. 3 μ g/L，I. 5 μ g/L 和 0· 9 μ g/L，4. 5 μ g/L 和 2· 7 μ g/L， 13. 5 μ g/L和8. I μ g/L, 40. 5 μ g/L和24. 3 μ g/L ;所述PBS緩沖液的溶劑為水，溶質為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀和氯化鈉，所述溶質在所述PBS緩沖液中的濃度分別為O. 27g/ L、I. 13g/L、0. 2g/L 和 8. 8g/L，pH 值為 7· 4。
在上述試劑盒中，還可含有樣品稀釋液和/或樣品提取液和/或濃縮洗滌液和/4或底物顯色液和/或終止液；
所述樣品稀釋液為PBS緩沖液；
所述樣品提取液的溶劑為所述PBS緩沖液，溶質為吐溫20，所述溶質在所述樣品提取液中的濃度為2mL/L ；
所述濃縮洗滌液的溶劑為所述PBS緩沖液，溶質為吐溫20和疊氮化鈉，所述溶質在所述濃縮洗滌液中的濃度分別為10mL/L和5g/L ；
所述底物顯色液為獨立包裝的底物顯色液A和獨立包裝的底物顯色液B和/或獨立包裝的底物顯色液C ;所述底物顯色液A為2g/mL過氧化脲水溶液；所述底物顯色液B為 lg/mL四甲基聯苯胺水溶液；所述底物顯色液C為O. 05mol/L對硝基磷酸苯酯水溶液；
所述終止液為獨立包裝的終止液A和/或獨立包裝的終止液B ;所述終止液A為 O. 2mol/L的磷酸氫二鈉水溶液；所述終止液B為I. OmoI/L的硫酸水溶液。
本發明的另一個目的是提供一種同時檢測樣品中磺胺藥物和喹諾酮藥物的方法， 包括如下步驟
I)對樣品進行前處理獲得所述樣品的溶液；
2 )用上述任一所述試劑盒進行檢測；
3)分析檢測結果。
在上述方法中，所述用試劑盒進行檢測包括如下步驟向包被有所述磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物和喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物的酶標板中加入標準品溶液或所述樣品的溶液；再加入含磺胺藥物的特異性抗體和喹諾酮藥物的特異性抗體的溶液；溫育后洗滌拍干，加入所述酶標記抗抗體組合物，先用堿性磷酸酶的底物顯色、終止并用酶標儀測定吸光值；再用辣根過氧化物酶的底物顯色、終止并用酶標儀測定吸光值。
在上述方法中，所述對樣品進行前處理根據樣品的不同，前處理方法不同，具體如下
I)當所述樣品為肉樣或雞蛋時，所述前處理包括將所述樣品均質后與樣品提取液混合離心后，取上清獲得所述樣品的溶液；所述混合的比例具體可為每克所述樣品與20毫升所述樣品提取液混合；
2)當所述樣品為牛奶時，所述前處理包括將所述樣品離心后的中間層液體與樣品稀釋液混合，獲得所述樣品的溶液；所述混合的比例具體可為每毫升所述中間層液體與4 毫升所述樣品稀釋液混合。
在上述方法中，所述樣品提取液的溶劑為所述PBS緩沖液，溶質為吐溫20，所述溶質在所述樣品提取液中的濃度為2mL/L ；
所述樣品稀釋液為PBS緩沖液，溶劑為水，溶質為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀和氯化鈉，所述溶質在所述PBS緩沖液中的濃度分別為O. 27g/L、l. 13g/L、0. 2g/L和 8. 8g/L，pH 值為 7.4。
本發明試劑盒檢測的原理一種可同時檢測磺胺類和喹諾酮類藥物的雙色聯合的間接競爭ELISA法，此法以磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物與喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物混合并包被酶標板，以磺胺藥物單克隆抗體及喹諾酮藥物單克隆抗體的混合液作為第一抗體，以標記有辣根過氧化物酶(HRP)的抗磺胺藥物單克隆抗體的抗抗體及標記有堿性磷酸酶(AP)的抗喹諾酮藥物單克隆抗體的抗抗體的混合液作為第二抗體，進行顯色反應時首先加入AP的底物對硝基磷酸苯酯，用O. 2mol/L的Na2HPO4終止反應，并測 405nm處吸光度值，以檢測喹諾酮類藥物，而后用緩沖溶液洗酶標板I次,再加入HRP的底物四甲基聯苯胺，以I. Omol/L H2SOJ*止反應，測450nm處吸光度值，以檢測磺胺藥物；也可以根據顯色的深淺來判斷樣品中磺胺藥物和喹諾酮藥物的含量，如果樣品中的游離磺胺藥物和喹諾酮藥物的量少，顯色深，反之，則顯色淺。以此種方法進行的磺胺藥物和喹諾酮藥物的檢測，其結果互不干擾。
實驗證明，本發明試劑盒可檢出待測樣品中的磺胺藥物有磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲嘧唳、磺胺間二甲氧嘧唳、磺胺間甲氧嘧唳、磺胺喹惡啉、磺胺嘧唳、磺胺甲氧噠嗪或磺胺對甲氧嘧啶，喹諾酮藥物有諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、達氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依諾沙星；可檢測的樣品包括豬肉、雞肉、牛肉、魚肉、蝦肉、雞蛋和牛奶，檢測豬肉、雞肉、牛肉、魚肉和蝦肉中磺胺藥物的最低檢測限為lng/g，雞蛋為5ng/g，牛奶為5ng/mL ;檢測豬肉、雞肉、牛肉、魚肉和蝦肉中喹諾酮藥物的最低檢測限為lng/g,雞蛋為2. 5ng/g,牛奶為5ng/mL,變異系數均小于20%,穩定性很好。本發明的試劑盒及方法可用于食品生產企業的自我質量控制，食品安全監督和檢測機構的常規篩查，還可用于科研中動物藥理和毒理學研究的輔助手段。
圖I為實施例I試劑盒檢測磺胺二甲基嘧啶含量的標準曲線。其中，橫坐標為各標準品溶液中磺胺二甲基嘧啶濃度(μ g/L)，縱坐標為百分吸光度值(％)。
圖2為實施例I試劑盒檢測諾氟沙星含量的標準曲線。其中，橫坐標為各標準品溶液中諾氟沙星濃度(μ g/U,縱坐標為百分吸光度值(％)。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下述實施例中所用的藥物購自Sigma-Aldrich。
下述實施例中如無特別說明，所用的PBS緩沖液組成如下溶劑為水，溶質為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀和氯化鈉，所述溶質在所述PBS緩沖液中的濃度分別為O. 27g/ L、I. 13g/L、0. 2g/L 和 8. 8g/L，pH 值為 7· 4。
實施例I、制備同時檢測磺胺和喹諾酮藥物的酶聯免疫試劑盒
該試劑盒組成如下酶標板(同時包被磺胺藥物與載體蛋白的偶聯物和喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物)、抗體工作液(含磺胺藥物單克隆抗體和喹諾酮藥物單克隆抗體)、酶標抗抗體工作液(含辣根過氧化物酶標記的抗磺胺藥物單克隆抗體的抗抗體和堿性磷酸酶標記的抗喹諾酮藥物單克隆抗體的抗抗體)、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、樣品提取液、含不同梯度濃度磺胺二甲基嘧啶和諾氟沙星的標準品溶液1-6、底物顯色液Α、底物顯色液B、底物顯色液C、終止液A和終止液B。
制備方法如下
一、酶標板的制備
I、磺胺二甲基嘧啶(SM2)包被原的制備NH—OVA(式I)
2、諾氟沙星(NOR)包被原的制備
I)諾氟沙星(NOR)的哌嗪環仲氨基與4-溴丁酸乙酯結合來制備NOR半抗原將 320mg NOR與143yL 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亞砜中，再加入700mg碳酸鉀和 30mg碘化鈉，70°C回流3天，再靜置I天；然后加水400mL，用IOOmL 2X乙酸乙酯萃取，萃取相經水洗滌、無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸干，得淺黃色粘稠狀液體。
酯的堿性水解在上述黃色粘稠狀液體中加入IM氫氧化鈉2mL，再加入500 μ L乙醇助溶，70°C反應8h (溶液由渾濁變為淺黃色澄清液體，說明水解成功)，用鹽酸調節pH為 7左右。用氮氣吹干上述溶液，冷凍干燥過夜，得到諾氟沙星半抗原，其結構式如式II所示。
以磺胺二甲基嘧啶(SM2)作為磺胺二甲基嘧啶半抗原。
I)取104mg磺胺二甲基嘧啶(SM2),加入8mL O. 25mol/L的硫酸水溶液中，置于4°C 冰箱，形成溶液I (含SM2);
2)取200mg的卵清蛋白(OVA)溶于8mL的Na2CO3溶液中(pH=10)，置于4°C冰箱， 形成溶液II (含0VA);
3 )取 38mg NaNO2 加入 2mL 水，得到溶液III (含 NaNO2)；
4)將溶液III(含NaNO2)緩慢加入到溶液I (含SMj*，在此過程中，溶液I (含SM2) 置于碎冰中，大概15min，得到溶液IV (含SM2-NaNO2混合物)；
5)將溶液IV (含SM2-NaNO2混合物)緩慢加入到溶液II (含0VA)的燒杯中，并搖動燒杯，此時有紅色物生成；6min后，將燒杯置于磁力攪拌器上，室溫慢速攪拌，繼續加溶液 IV (含SM2-NaNO2混合物)；在攪拌過程中，檢測pH值，使之保持在9_10之間，最終溶液變成暗紅色液體；室溫繼續攪拌4h ;裝入透析袋，生理鹽水透析。得到磺胺二甲基嘧啶與卵清蛋白的偶聯物，即為磺胺二甲基嘧啶(SM2)包被原，其結構式如式I所示。
權利要求
1.一種同時檢測磺胺藥物和喹諾酮藥物的酶聯免疫試劑盒，包括包被原、檢測抗體和酶標抗體； 所述包被原為磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物和喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物的混合物； 所述檢測抗體為磺胺藥物的特異性抗體和喹諾酮藥物的特異性抗體的混合物； 所述酶標抗體為如下I)或2)的酶標記的抗抗體組合物 1)辣根過氧化物酶標記的抗所述磺胺藥物的特異性抗體的抗抗體和堿性磷酸酶標記的抗所述喹諾酮藥物的特異性抗體的抗抗體； 2)辣根過氧化物酶標記的抗所述喹諾酮藥物的特異性抗體的抗抗體和堿性磷酸酶標記的抗所述磺胺藥物的特異性抗體的抗抗體。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有6種標準品溶液，所述6種標準品溶液的溶劑為PBS緩沖液，溶質為磺胺二甲基嘧啶和諾氟沙星；所述溶質在所述6種標準品溶液中的濃度分別為O μ g/L和O μ g/L, O. 5 μ g/L和O. 3 μ g/L, I. 5 μ g/L和0· 9 μ g/L, 4. 5 μ g/L 和 2· 7 μ g/L, 13. 5 μ g/L 和 8· I μ g/L, 40. 5 μ g/L 和 24. 3 μ g/L ;所述PBS緩沖液的溶劑為水，溶質為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀和氯化鈉，所述溶質在所述PBS緩沖液中的濃度分別為O. 27g/L、I. 13g/L、0. 2g/L和8. 8g/L，pH值為7. 4。
3.根據權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有樣品稀釋液和/或樣品提取液和/或濃縮洗滌液和/或底物顯色液和/或終止液； 所述樣品稀釋液為所述PBS緩沖液； 所述樣品提取液的溶劑為所述PBS緩沖液，溶質為吐溫20，所述溶質在所述樣品提取液中的濃度為2mL/L ； 所述濃縮洗滌液的溶劑為所述PBS緩沖液，溶質為吐溫20和疊氮化鈉，所述溶質在所述濃縮洗滌液中的濃度分別為10mL/L和5g/L ； 所述底物顯色液為獨立包裝的底物顯色液A和獨立包裝的底物顯色液B和/或獨立包裝的底物顯色液C ;所述底物顯色液A為2g/mL過氧化脲水溶液；所述底物顯色液B為Ig/mL四甲基聯苯胺水溶液；所述底物顯色液C為O. 05mol/L對硝基磷酸苯酯水溶液； 所述終止液為獨立包裝的終止液A和/或獨立包裝的終止液B ;所述終止液A為O.2mol/L的磷酸氫二鈉水溶液；所述終止液B為I. OmoI/L的硫酸水溶液。
4.一種同時檢測樣品中殘留磺胺藥物和喹諾酮藥物的方法，包括如下步驟 1)對樣品進行前處理； 2)用權利要求1-3中任一所述試劑盒進行檢測； 3)分析檢測結果。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述用試劑盒進行檢測包括如下步驟向包被有所述磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物和喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物的酶標板中加入標準品溶液或所述樣品的溶液；再加入磺胺藥物的特異性抗體和喹諾酮藥物的特異性抗體；溫育后洗滌拍干，加入所述酶標記抗抗體組合物，先用堿性磷酸酶的底物顯色、終止并用酶標儀測定吸光值；再用辣根過氧化物酶的底物顯色、終止并用酶標儀測定吸光值。
全文摘要
本發明公開了一種同時檢測磺胺類和喹諾酮類藥物的ELISA方法及其試劑盒。本發明所提供的試劑盒是以磺胺藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物和喹諾酮藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物為包被原，以磺胺藥物的特異性抗體和喹諾酮藥物的特異性抗體的混合物為檢測抗體，以辣根過氧化物酶酶標記的抗磺胺藥物的特異性抗體的抗抗體和堿性磷酸酶標記的抗喹諾酮藥物的特異性抗體的抗抗體為酶標二抗。本發明的方法是使用所述試劑盒并在顯色時先用堿性磷酸酶的底物顯色再用辣根過氧化物酶的底物顯色，可一次同時檢出磺胺和喹諾酮藥物。本發明可用于食品生產企業的自我質量控制，食品安全監督和檢測機構的常規篩查，還可用于科研中動物藥理和毒理學研究的輔助手段。
文檔編號G01N33/535GK102928597SQ20121042184
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月30日 優先權日2012年10月30日
發明者吳小平, 王世恩, 楊錚, 何丹婷, 蘇麗芳, 李淑芳 申請人:北京維德維康生物技術有限公司