專利名稱：片段長度在500bp之內DNA的定量方法
技術領域：
本發明涉及DNA定量應用研究領域中通過毛細管電泳檢測實現不同片段DNA定量的研究領域，尤其涉及片段長度在500bp之內DNA的定量方法。
背景技術：
DNA定量的常用方法有紫外光譜法(UV)、聚合酶鏈反應(Real time PCR)、熒光光譜法等。紫外分光光度法操作簡單省時，但靈敏度低，且易受DNA樣品中RNA和蛋白質的影響。Real time PCR定量靈敏度較高，但對序列依賴性強，且數據處理繁瑣費時。熒光定量操作簡單，靈敏度較高對DNA的選擇性也較好。DNA定性方法最常用的就是平板凝膠電泳和毛細管電泳。平板凝膠電泳存在靈敏度低、易產生假陽性、高成本和分析時間冗長、毒性大等缺點，不適合用于大量臨床樣品分析。目前，一些熒光測定DNA的方法所用的儀器均存在樣品消耗量較大、儀器價格昂貴、分析時間長、不易自動化的缺陷。但當毛細管電泳結合激 光誘導熒光(CE-LIF)來檢測DNA，就可以克服上述這些定量中的問題，采用毛細管電泳結合激光誘導熒光(CE-LIF)來定量DNA是有據可依的。毛細管電泳結合激光誘導熒光(CE-LIF)檢測具有靈敏度高、樣品消耗量小、分析時間短、毒性小、易自動化等優點。近年來，毛細管電泳結合激光誘導熒光(CE-LIF)在檢測DNA方面顯示了很強的優越性。在1985 2012年中國專利數據庫中記載了申請號為200610038026. O的中國專利《人血漿DNA定量分析方法》、申請號為201010283094. X的中國專利《基于核酸內切酶消化的甲基化DNA定量檢測方法》、申請號為201110115570. I的中國專利《一種通過DNA定量測定藍藻胞內藻毒含量的方法》、申請號為20111068228. O的中國專利《一種快速測定細胞核內DNA含量的方法》、申請號為201110099204. I的中國專利《探針法檢測CHO細胞DNA含量的方法》，上述專利僅公開采用兩重熒光定量基因擴增，提取已知外源性陽性質粒回收效率，用計算公式計算得知血漿DNA的量。采用熒光分光光度計測定熒光強度，并計算甲基化DNA含量，采用檢測藻細胞中的DNA含量，根據DNA含量與胞內藻毒素產量之間的相關性關系進行計算，來定量藻毒素的定量，采用計算機圖像分析系統進行掃描分析，計算出標準細胞DNA含量，再根據細胞DNA含量計算出玻片上細胞的DNA含量，采用實時熒光定量PCR，根據所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。上述方法仍然無法快速定量DNA。而通過毛細管電泳結合激光誘導突光用于定量不同片段大小DNA的方法卻未見文獻報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種速度快、靈敏度高的片段長度在500bp之內DNA的定量方法。為解決上述問題，本發明所述的片段長度在500bp之內DNA的定量方法，包括以下步驟
⑴毛細管柱內壁修飾將毛細管內壁用O. 2mol/L NaOH清洗后，分別依次將γ-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)/甲醇溶液和質量濃度為3. 4%的丙烯酰胺單體溶液充填入毛細管柱內進行共價涂層修飾；
⑵配制含TBE的篩分介質將篩分介質聚環氧乙烷加入IXTBE緩沖液中，使最終溶液質量濃度為3. 0%、pH值為8. 2后，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用O. 45um水系微孔濾膜過濾后，即得含TBE的篩分介質；
⑶熒光染料的加入量確定在廣15PL、濃度為1/1000的熒光染料SYBR Green I中加入濃度為O. 5ug/ml的標準品pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker 15μ 混勻，再加入去離子水使總體積為30μ ，最終使其熒光染料的濃度為l/3000(Tl/2000 ;在分離電壓為15kv、溫度為15°C的條件下采用負極-10KV電動進樣IOs的方式進行電泳分離，根據所述pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker電泳圖中26 501bp片段大部分的峰面積為最大值時所對應的加入量確定為熒光染料加入量；
⑷標準品的線性范圍考察將標準品pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker用去離子水稀釋成為O. 03^2. 5Pg/mL系列濃度稀釋標準品，分別取15μ 的所述稀釋標準品，加入所述步驟⑶所得的熒光染料加入量，混勻后再加入去離子水至體系為30μ ，然后，使用毛細管電泳儀壓力系統向所述步驟⑴所得的毛細管內自動填充所述步驟⑵所得的含TBE的篩分介質，在分離電壓為15kv、溫度為15°C的條件下采用負極-IOkv電動進樣IOs的方式采用毛細管電泳結合激光誘導熒光檢測器進行檢測；然后，根據檢測結果對濃度與峰面積或峰高建立線性關系及線性范圍；
(5)檢測限根據所述步驟⑷的檢測結果，計算相應信噪比S/N=3時的濃度；
(6)重現性對3根的不同批次所述步驟⑴所得的毛細管按所述步驟⑷檢測方法進行分離效果考察，計算峰面積與熒光強度的相對標準偏差(RSD%)；
(7)樣品分析從病變組織及正常組織的基因組DNA中選定26飛Olbp片段中一個基因目的片段進行擴增，然后根據所述步驟⑷進樣方法進行檢測即可。所述步驟⑴中Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)/甲醇溶液是指將Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)與甲醇按I :1的體積比混合所得的溶液。所述步驟⑴中丙烯酰胺單體溶液是指將3. 4g丙烯酰胺溶于IOOmL三蒸水所得的溶液。所述步驟⑵中IXTBE緩沖液是指在800毫升去離子水中分別加入三羥甲基氨基甲烷10. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二鈉鹽O. 74克，經攪拌溶解后，加去離子水將溶液定容至IL所得的緩沖液。所述步驟(7)中的病變組織及正常組織為病理科切除并經病理診斷證明的組織。所述步驟(7)中的擴增條件是指94°C變性30 S，55°C退火30 S，72°C延伸30 S，共進行30個循環。本發明與現有技術相比具有以下優點
I、本發明選取PUC19DNA/MSP I (Hpa II )作為DNA定量方法的研究對象，采用毛細管電泳結合激光誘導熒光檢測技術，通過檢測不同濃度pUC19DNA/Msp I (HpaII)中DNA各個片段的線性關系來實驗DNA定量的目的，從而打破傳統DNA定量方法，做到多個DNA片段同時定量，有效提高了工作效率。2、本發明以含有IXTBE緩沖液的聚環氧乙烷(PEO)作為篩分介質，因此，具有良好的分離效能。3、本發明采用毛細管電泳結合激光誘導熒光檢測器進行檢測，可完成多個不同長度片段的同時定量(參見圖I)。4、本發明選用濃度為1/30000 1/2000的SYBR Green I熒光染料，有效提高了檢
測的靈敏度。
5、本發明可定量基因擴增片段的DNA含量，通過病變組織與正常組織的擴增片段DNA含量的配對t檢驗(P < O. 05)，發現病變組織的擴增片段DNA含量高于正常組織(參見表I)。表I
樣本號I性別I年齡I病理特征I正，組纟=度I病^組織=度
(μ.2-mL)(^iganL)
I男42中分化腺瘤0,167IDO
I男SI中分化腺瘤OSm1.95
3男51高分化腺瘤L226.02
4男78中分化腺瘤0.63.30.860
5男40中分化腺瘤0,0628L69
6男65中分化腺瘤i.662.12
7女41中分化腺瘤0J353.88
8女54低分化腺瘤CU 260,212
9女46中分化腺瘤0.08480.107
10男56 黏液腺瘤1.146.06 均值239
6、本發明操作簡單省時。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細的說明。圖I為本發明的實施例I毛細管電泳圖。圖2為本發明熒光染料的加入量對相應峰面積的影響。
具體實施例方式實施例I 片段長度在500bp之內DNA的定量方法，用于pUC19DNA Marker的分離，包括以下步驟⑴毛細管柱內壁修飾將毛細管內壁用O. 2mol/L NaOH清洗后，分別依次將γ-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS) /甲醇溶液和質量濃度為3. 4%的丙烯酰胺單體溶液充填入毛細管柱內進行共價涂層修飾。其中
Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)/甲醇溶液是指將Y -甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)與甲醇按I :1的體積比(mL/mL)混合所得的溶液。丙烯酰胺單體溶液是指將3. 4g丙烯酰胺溶于IOOmL三蒸水所得的溶液。⑵配制含TBE的篩分介質將篩分介質聚環氧乙烷加入IXTBE緩沖液中，使最終溶液質量濃度為3. 0%、pH值為8. 2后，并用河南鞏義市予華儀器有限責任公司生產的DF-101S型磁力攪拌器以400轉/分鐘的速率攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用O. 45um 水系微孔濾膜過濾后，即得含TBE的篩分介質。其中=IXTBE緩沖液是指在800毫升去離子水中分別加入三羥甲基氨基甲烷(Tris)IO. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)O. 74克，經攪拌溶解后，加去離子水將溶液定容至IL所得的緩沖液。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)均為上海生物工程公司生產。⑶將熒光染料的加入量確定在15μ 、濃度為1/1000的熒光染料SYBR GreenI (廈門百信威公司提供沖加入濃度為O. 5ug/ml的pUC19DNA MarkerCBBI公司提供)15μ 混勻，再加入去離子水使總體積為30μ ，最終使其熒光染料的濃度為l/3000(Tl/2000 ;使用毛細管電泳儀(P/ACE 5000，美國Beckman公司)使用壓力為10 psi (磅/平方英寸)的壓力系統向步驟⑴所得的毛細管內自動填充步驟⑵所得的含TBE的篩分介質，在分離電壓為15kv、溫度為15°C的條件下采用負極-10KV電動進樣IOs的方式進行電泳分離。其分離電泳圖參見圖I,共得到11個色譜峰。圖中I為26bp ;2為34bp ;3為67bp ；
4為 IlOUllbp ；5 為 147bp ；6 為 190bp ；7 為 242bp ；8 為 331bp ；9 為 404bp ；10 為 489bp ；11為501bp,共11個色譜峰。從圖I中可以看出，本發明對不同長度DNA片段進行了良好的分離。實施例2 片段長度在500bp之內DNA的定量方法，包括以下步驟
⑴毛細管柱內壁修飾同實施例I。⑵配制含TBE的篩分介質同實施例I。⑶熒光染料的加入量確定在15μ 、濃度為1/1000的熒光染料SYBR Green I中加入濃度為O. 5ug/ml的標準品pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker 15μ 混勻，再加入去離子水使總體積為30μ ，最終使其熒光染料的濃度為l/3000(Tl/2000 ;在分離電壓為15kv、溫度為15°C的條件下采用負極-10KV電動進樣IOs的方式進行電泳分離，根據pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker電泳圖中26 501bp片段大部分的峰面積為最大值時所對應的加入量確定為熒光染料加入量。其熒光染料的加入量對相應峰面積的影響見圖2。從圖2中可以看出，熒光染料加入量為5PL時，除片段34bp外，別的片段的峰面積都是最大值，總體考慮選5PL為加入量。⑷標準品的線性范圍考察將標準品pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker用去離子水稀釋成為O. 03^2. 5Pg/mL系列濃度稀釋標準品，分別取15μ 的稀釋標準品，加入步驟⑶所得的熒光染料加入量，混勻后再加入去離子水至體系為30μ ，然后，使用毛細管電泳儀壓力系統向步驟⑴所得的毛細管內自動填充步驟⑵所得的含TBE的篩分介質，在分離電壓為15kv、溫度為15°C的條件下采用負極-IOkv電動進樣IOs的方式采用毛細管電泳結合激光誘導熒光(CE-LIF)檢測器進行檢測；然后，根據檢測結果對濃度與峰面積或峰高建立線性關系及線性范圍(參見表2)。表2為11個不同片段DNA的濃度與峰面積的線性關系及線性范圍
權利要求
1.片段長度在500bp之內DNA的定量方法，包括以下步驟 ⑴毛細管柱內壁修飾將毛細管內壁用O. 2mol/L NaOH清洗后，分別依次將γ-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷/甲醇溶液和質量濃度為3. 4%的丙烯酰胺單體溶液充填入毛細管柱內進行共價涂層修飾； ⑵配制含TBE的篩分介質將篩分介質聚環氧乙烷加入IXTBE緩沖液中，使最終溶液質量濃度為3. 0%、pH值為8. 2后，攪拌至溶液澄清為止，該澄清溶液用O. 45um水系微孔濾膜過濾后，即得含TBE的篩分介質； ⑶熒光染料的加入量確定在廣15PL、濃度為1/1000的熒光染料SYBR Green I中加入濃度為O. 5ug/ml的標準品pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker 15μ 混勻，再加入去離子水使總體積為30μ ，最終使其熒光染料的濃度為l/3000(Tl/2000 ;在分離電壓為15kv、溫度為15°C的條件下采用負極-10KV電動進樣IOs的方式進行電泳分離，根據所述pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker電泳圖中26 501bp片段大部分的峰面積為最大值時所對應的加入量確定為熒光染料加入量； ⑷標準品的線性范圍考察將標準品pUC19DNA/Msp I (HpaII) Marker用去離子水稀釋成為O. 03^2. 5Pg/mL系列濃度稀釋標準品，分別取15μ 的所述稀釋標準品，加入所述步驟⑶所得的熒光染料加入量，混勻后再加入去離子水至體系為30μ ，然后，使用毛細管電泳儀壓力系統向所述步驟⑴所得的毛細管內自動填充所述步驟⑵所得的含TBE的篩分介質，在分離電壓為15kv、溫度為15°C的條件下采用負極-IOkv電動進樣IOs的方式采用毛細管電泳結合激光誘導熒光檢測器進行檢測；然后，根據檢測結果對濃度與峰面積或峰高建立線性關系及線性范圍； (5)檢測限根據所述步驟⑷的檢測結果，計算相應信噪比S/N=3時的濃度； (6)重現性對3根的不同批次所述步驟⑴所得的毛細管按所述步驟⑷檢測方法進行分離效果考察，計算峰面積與熒光強度的相對標準偏差； (7)樣品分析從病變組織及正常組織的基因組DNA中選定26飛Olbp片段中一個基因目的片段進行擴增，然后根據所述步驟⑷進樣方法進行檢測即可。
2.如權利要求I所述的片段長度在500bp之內DNA的定量方法，其特征在于所述步驟⑴中Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷/甲醇溶液是指將Y-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷與甲醇按I :1的體積比混合所得的溶液。
3.如權利要求I所述的片段長度在500bp之內DNA的定量方法，其特征在于所述步驟⑴中丙烯酰胺單體溶液是指將3. 4g丙烯酰胺溶于IOOmL三蒸水所得的溶液。
4.如權利要求I所述的片段長度在500bp之內DNA的定量方法，其特征在于所述步驟⑵中IXTBE緩沖液是指在800毫升去離子水中分別加入三羥甲基氨基甲烷10. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二鈉鹽O. 74克，經攪拌溶解后，加去離子水將溶液定容至IL所得的緩沖液。
5.如權利要求I所述的片段長度在500bp之內DNA的定量方法，其特征在于所述步驟⑴中的病變組織及正常組織為病理科切除并經病理診斷證明的組織。
6.如權利要求I所述的片段長度在500bp之內DNA的定量方法，其特征在于所述步驟(7)中的擴增條件是指94°C變性30 s，55°C退火30 S，72°C延伸30 S，共進行30個循環。
全文摘要
本發明涉及一種片段長度在500bp之內DNA的定量方法，該方法包括以下步驟⑴毛細管柱內壁修飾；⑵配制含TBE的篩分介質；⑶熒光染料的加入量確定；⑷標準品的線性范圍考察；⑸檢測限:根據所述步驟⑷的檢測結果，計算相應信噪比S/N=3時的濃度；⑹重現性對3根的不同批次所述步驟⑴所得的毛細管按所述步驟⑷檢測方法進行分離效果考察，計算峰面積與熒光強度的相對標準偏差(RSD%)；⑺樣品分析從病變組織及正常組織的基因組DNA中選定26~501bp片段中一個基因目的片段進行擴增，然后根據所述步驟⑷進樣方法進行檢測即可。本發明操作簡單省時且靈敏度高，可在定量的同時檢測片段長度。
文檔編號G01N21/64GK102914586SQ201210412809
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者王榮, 賈正平, 謝華, 石冬琴, 李文斌 申請人:王榮