專利名稱：茚三酮檢測法對固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進的制作方法
技術領域：
本發明涉及氨基殘余物的定量檢測，尤其適應新固相多肽合成中，經茚三酮試劑處置，測得吸光值，制得標準曲線，用于判定未知樹脂肽中的殘余氨基含量的方法。
背景技術：
在固相法合成多肽的過程中，游離的氨基數量是合成完成度的一種直接體現，但是現在沒有一個準確的方法可以得到殘余氨基的具體數量，以驗證其結果的可信度與準確性；因此制作標準樣品與標準曲線用于對未知樹脂肽中游離的氨基進行定量分析，有著重要的實踐價值。
常規茚三酮檢測法用于固相多肽合成中的-NH2殘基定量的檢測，一般均采用將反應后樹脂的吸光值代入公式，通過計算來確定合成率，此結果易受反應時間、加熱溫度、加熱時間等因素影響，而且由于存在試劑配制的批次差異，從而使結果會有較大的浮動，而且由于合成的不斷進行，氨基酸的增加，也會使得樹脂肽重量發生變化，使得結果判定上的準確度大打折扣，為了避免上述情況的出現，該項目對茚三酮反應試劑進行了改進，可以在短時間內得出一個穩定的結果，并使用脫去保護基后的合成用樹脂作為標準品，建立一條標準曲線，使所有的反應均在同一條件下進行，從而保證了結果的可信度，可以更可靠的對游離氨基進行定量。文獻檢索披露常規茚三酮檢測法多是通過顏色的變化來對縮合完成度進行判定；該方法使用2種試劑，試劑A :取O. 66mg/ml氰化鉀水溶液2ml加入到98ml吡啶溶液中，再加入4g/ml苯酹乙醇溶液IOml,混勻；試劑B :稱取500mg卻三酮溶于IOml無水乙醇中；進行合成完成度檢測時，取縮合反應完成后的樹脂肽3mg，使用無水乙醇清洗3次，真空干燥后，加入試劑A O. 15ml，試劑B O. 05ml, 100°C加熱10分鐘，看顏色變化來判定縮合完成度，顏色如果為藍色或綠色就判定為縮合不完全，顯黃色判定為縮合完全。本發明構思是改進的固相多肽合成中的殘余氨基定量分析方法，用合成的樹脂作為標準品，制作標準曲線，對合成率進行一個判斷，其解決的主要問題，一是合成樹脂標準的建立；二是對游離氨基定量檢測范圍的確定；三是吸光值的穩定性的確定；四是反應液改進后不加氰化鉀，減少反應液配制的危險性，該定量方法有重要的應用推廣價值。
發明內容
本發明的目的在于改進的固相多肽合成中的殘余氨基定量分析方法，依據標準品樹脂的吸光值制作標準曲線，可以得到未知樹脂肽樣品中的殘余氨基含量，實現了準確定量。本發明的目的是這樣實現的茚三酮檢測法對固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進，用與合成反應相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標準樣品，制作標準曲線，對未知的樣品進行殘余氨基定量檢測，其步驟如下其I樣品處理
稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g,計算樹脂摩爾數A ;用帶Fmoc保護基的氨基酸，每種氨基酸取2A摩爾；將IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反應2小時，得到樹脂肽；再經25%哌啶溶液26ml，處理30分鐘，得到去除保護基后的樹脂肽，備用；其中25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻得；其中樹脂摩爾數的計算公式
A=M/SD式中A為Rink_Amide_MBHA樹脂的摩爾數；m 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂的克數；SD 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值；其2檢測步驟I)將取去除保護基后的樹脂肽15mg，使用無水甲醇溶液20ml對其清洗3次，經真空干燥機處置，其溫度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa ;干燥結束，稱取I. Omg, I. 5mg, 2. Omg,
2.5mg，3. Omg ;分別加入 300ul Buffer A :和 75ul Buffer B，混和均勻，用 100°C水浴加熱15min,并置于15-20°C水中冷卻至室溫；取25ul的反應后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在0D570下進行吸光值讀取，并制作標準曲線；2)稱取待測樣 2. 0-3. Omg，加入 Buffer A 300ul ；Buffer B :75ul，混勻，100°C7jC浴加熱15min，并用冷水冷卻，取25ul的反應后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在0D570下測定吸光值；其中Buffer A的配制:5ml卩比唳+1. 185g苯酌· +5ml乙醇混勻；其中Buffer B的配制500mg卻三酮+IOml乙醇；3)由于使用未合成的Rink Amide_MBHA樹脂作為標準品，所以在計算時需要將由于縮合所增加的分子量減去，以保證計算結果的準確性；去除樹脂肽增量的影響公式
V _m^ — 1+SD ^
IOOO式中X :去除增加的氨基酸分子量后的原始肽重量；W :樹脂妝理論分子量；m :樹脂肽實際稱量重量；SD Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值；其中4mer樹脂肽的理論分子量為541. 73 ；Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值為0. 38mmol/g。本發明的作用機理是氨基酸與茚三酮水合物在弱酸條件下共同加熱時，氨基酸被氧化脫氨、脫羧，而茚三酮水合物被還原，其還原物可與氨基酸加熱分解產生的氨基結合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍紫色化合物，根據溶液中游離氨基的多寡，其顏色也會有深淺變化，可以通過分光光度計測量吸光值，根據吸光值的不同，可以對反應中的氨基含量進行判定。本方法采用與合成反應相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標準樣品，制作標準曲線，對于固相合成過程中的氨基殘余含量判定更為準確，可以更加直觀的對合成的預期結果進行判定，彰顯技術進步。
具體實施例方式本發明結合實施例作進一步闡明。本方法的實施步驟(一)反應試劑的制備Buffer A :5ml 卩比唳 +1. 185g 苯酌· +5ml 乙醇混勻；Buffer B 500mg 卻三酮 +IOml 乙醇； 25%哌啶溶液25ml哌啶溶液+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻；(二)樣品處理I)固相合成過程稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g，并根據樹脂摩爾數的計算公式算出所需的樹脂摩爾數A，選用帶Fmoc保護基的氨基酸，每種氨基酸取2A摩爾，使用IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護基的氨基酸，在含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反應2小時，得到樹脂肽，再經25%哌啶溶液處理30分鐘，其中每摩爾樹脂肽加入25%的哌啶溶液26ml，得去除脫保護基后的樹脂肽，備用；樹脂摩爾數的計算公式
illA —式中A為Rink_Amide_MBHA樹脂的摩爾數；m 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂的克數；SD 為 Rink_Amide_MBHA 樹脂取代量值；2)標準品制備用與合成反應相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標準樣品，經25%哌啶溶液(每摩爾樹脂加26ml)處理30分鐘，使用無水甲醇溶液(每100毫克樹脂使用5ml無水甲醇溶液)清洗3次，之后使用真空干燥機進行干燥(溫度45°C，真空度95KPa)。3)樣品制備取脫去保護基后的樹脂肽8mg，使用無水甲醇溶液15ml對其清洗3次，之后使用真空干燥機進行干燥(溫度45°C，真空度93. 3KPa)。4)加入 Buffer A 300ul ；Buffer B 75ul,混勻，100°C水浴加熱 15min,并用冷水冷卻15min，之后取反應液25ul+l. Oml 60%的乙醇溶液混勻;其中Buffer A :5ml吡啶+1. 185g苯酌· +5ml乙醇混勻；Buffer B 500mg卻三麗+IOml乙醇；5)在0D570下進行吸光值讀取。(二)檢測流程I)對處理后的標準品進行取樣,精確稱取I. Omg、I. 5mg、2. 0mg、2. 5mg、3. Omg的樹脂；2)對處理后的樣品進行取樣，精確稱取3. Omg,并記錄重量；3)每管標準品和樣品均加入Buffer A 300ul ；Buffer B :75ul，混勻，100°C水浴加熱15min，并用冷水冷卻15min，取25ul的反應后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均勻后，在0D570下進行吸光值讀取，并制作標準曲線，其驗證結果見表I。表I
權利要求
1.茚三酮檢測法對固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進，其特征在于用與合成反應相同的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標準樣品，制作標準曲線,對未知的樣品進行殘余氨基定量檢測，其步驟如下 其I樣品處理 稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g,計算樹脂摩爾數A ;用帶Fmoc保護基的氨基酸,每種氨基酸取2A摩爾；將IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反應2小時，得到樹脂肽；再經25%哌啶溶液26ml，處理30分鐘，得到去除保護基后的樹脂肽，備用； 其中25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻得； 其中樹脂摩爾數的計算公式
2.按照權利要求I所述的檢驗方法，其特征在于選用的合成用樹脂為RinkAmide_MBHA Resin，購自天津南開和成科技有限公司，貨號HCRAm04-l_l ;哌啶購自Sigma，貨號110-89-4 ;氮甲基吡咯烷酮購自張家港合泰化工有限公司，貨號872504 ;茚三酮購自Sigma，貨號N4876;吡啶購自天津市風船化學試劑科技有限公司，貨號xkl3-201_00115 ；帶Fmoc保護基的氨基酸，購自吉爾生化的上海有限公司。·
全文摘要
本發明提供的茚三酮檢測法對固相多肽合成中的游離氨基定量方法改進，使用合成的Rink_Amide_MBHA樹脂作為標準樣品，進行連續的重量遞增稱量，可以得到一組標準樣品，經過茚三酮試劑反應，在OD570下讀取吸光值，制得一條標準曲線，根據此標準曲線，可以對未知的肽樹脂進行游離的氨基定量檢測分析。
文檔編號G01N1/28GK102928362SQ20121039911
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年7月18日
發明者趙毅, 鄭先強, 謝仁軍, 肖璐恒, 李延濤, 黃炯, 唐磊 申請人:新疆天康畜牧生物技術股份有限公司