專利名稱：一種Aβ-淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種Αβ -淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，特別涉及一種利用反相高效液相色譜法以及不同鍵合填料的色譜柱來檢測Αβ -淀粉樣多肽1-42純度的方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是一種發病率高、危害極大的中樞神經··系統退行性疾病，主要臨床癥狀是智力進行性減退，特征性病理學改變是老年斑，神經元纖維纏結，以海馬、皮層區域為主的神經元數目減少。淀粉樣多肽1-42 (Amyloids 1-42peptide,簡稱Αβ42)是存在于阿爾茨海默病患者腦組織中的特異病理改變之物，同時它在AD患者的腦積液及血漿中有所改變。研究表明A β -淀粉樣多肽1-42在腦內的沉積是阿爾茨海默病的主要原因，因此純品Αβ -淀粉樣多肽1-42對阿爾茨海默病的病理研究有非常重要的作用。目前對Αβ -淀粉樣多肽1-42的藥理研究也已有多種測定方法，如酶聯免疫吸附測定法(ELISA),放射免疫分析法(RIA)或免疫放射分析法(ImmunoradiometriassayIRMA) , Western 印跡法(Western Boltting)免疫沉淀法(Immunoprecipi-tation)和免疫組織化學法(Immunohistochemical, IHC),各種不同檢測方法的選擇和應用，主要取決于實驗研究的要求和目的。以上所有方法的建立是由于制備出了靈敏度高，特異性強和準確性好的A β -淀粉樣多肽1-42，而對利用HPLC反相高效液相色譜法制備出來的A β -淀粉樣多肽1-42進行純度的檢測就顯得尤為重要。對利用HPLC反相高效液相色譜法制備出來的A β -淀粉樣多肽1-42的檢測，目前多數都是利用TFA體系和以聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物樹脂填料(PLRP-S柱)居多，由于PLRP-S柱特殊的不耐壓特點，為此所得到的Αβ -淀粉樣多肽1-42不但色譜峰形不對稱而且所得到的理論純度與實際純度差異比較大。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用反相高效液相色譜法檢測Αβ -淀粉樣多肽1-42純度的方法，主要解決現有檢測方法中以聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物樹脂填料不耐壓導致理論純度與實際純度差異比較大，以及對色譜柱以及緩沖鹽的選擇局限性的技術問題。為實現上述目的，本發明的技術方案如下
一種Αβ -淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，包括如下步驟
O將Αβ-淀粉樣多肽1-42用超純水超聲溶解至完全，用濾膜過濾，取濾液待用。2)利用反相高效液相色譜法，對濾液進行檢測，其檢測條件是
色譜柱C4硅膠柱，C8硅膠柱，
流動相A相甲酸的水溶液；B相甲酸的乙腈溶液 C4柱時間(min)ABO90%10%
25.0040%60%
30.0090%10%
C8柱時間(min)AB
O85%15%
25.0035%65%
30.0085%15%
上述％是質量百分濃度，流速lml/min,波長220nm。更為優選的方案是Αβ -淀粉樣多肽1-42與超純水添加比例1-2:1 (mg:ml)，進一步優選為I: I (mg:ml)，Αβ -淀粉樣多肽1-42上樣量通常為O. 1-0. 2mg。更為優選的方案是所用C4硅膠柱尺寸為5um，4.6X250mm (LD)0更為優選的方案是所用C8硅膠柱為尺寸5um，4. 6X250mm (LD)0 更為優選的方案是所用的流動相的體系是含體積濃度為O. 05-0. 1%甲酸水溶液和體積濃度為O. 05-0. 1%甲酸乙腈溶液。更為優選的方案是所用的流動相中C4柱B相的質量百分比濃度為10-60%。更為優選的方案是所用的流動相中C8柱B相的質量百分比濃度為15-65%。更為優選的方案是步驟2)中C4柱的流動相梯度選擇O到25min A:B由90:10到40:60。步驟2)中C8柱的流動相梯度選擇O到25min A:B由85:15到35:65。色譜條件的選擇 I.流動相的選擇
目前常用的Αβ -淀粉樣多肽1-42純度檢測的流動相體系是體積濃度為O. 1%的三氟乙酸體系和PLRP-S柱的結合，其檢測出來的色譜峰很寬，不能形成很好的對稱色譜峰形。也選用其它經常檢測多肽的體系進行相關的實驗，如醋酸胺緩沖液體系，甲酸體系。這三種體系對A β -淀粉樣多肽1-42分離效果基本差不多。而本發明的甲酸色譜條件下A β -淀粉樣多肽1-42的峰形稍微比較對稱一些，并且甲酸體系也比較容易配置得到。2.色譜柱的選擇
Αβ-淀粉樣多肽1-42的性質及序列使它在色譜柱中極易造成峰形擴散，一般的以硅膠基質為的C18鍵合相填料基本無法使峰聚集而在色譜柱中出現很好的色譜峰，所以目前多數選擇使用以聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物樹脂填料(PLRP-S柱)，因為其有很好的聚合性，所以用此填料的色譜柱檢測Αβ -淀粉樣多肽1-42純度居多。但是聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物又存在一定的缺點，就是聚合物色譜柱的柱效比較低，分離效果比較差，主要是由于以聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物樹脂填料不耐壓，對裝此填料的裝柱技術要求極高不僅裝柱困難，而且所裝出來的色譜柱的理論塔板數也比較低。故此本發明選擇鍵合填料為C4貨C8的色譜柱，一方面是由于鍵合填料為C4或C8的色譜柱的孔徑不僅大于普通C18的色譜柱孔徑，而且對于疏水性的分子量稍大的蛋白在一定程度上也有比較好的聚合性；另一方面，C4或CS的鍵合填料其耐壓程度遠遠高于聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物樹脂填料，所以其裝柱出來的色譜柱柱效高，分離效果好。3.梯度的選擇
針對Αβ-淀粉樣多肽1-42峰形易擴散的特點，不管是以聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質的聚合物樹脂填料色譜柱還是以鍵合填料為C4或CS的色譜柱，我們在梯度的選擇上都是選用較寬的梯度作為A β -淀粉樣多肽1-42的檢測梯度條件。由于C4和C8其碳鏈長度的不同的，Αβ -淀粉樣多肽1-42在C4和CS色譜柱上的保留強弱有一些區別，在CS色譜柱的保留時間比在C4色譜柱上的保留時間更久一些，所以C4色譜柱的梯度選擇為B相的質量百分比濃度10-60%，C8色譜柱的梯度選擇為B相的質量百分比濃度15-65%。本發明的有益效果是解決了現有對Αβ-淀粉樣多肽1-42純度檢測方法的局限性，利用甲酸體系和鍵合填料為C4和CS的條件，不僅能解決A β -淀粉樣多肽1-42色譜峰形不對稱的缺點，而且也大大減小了理論純度與實際純度的誤差。此方法的建立為利用HPLC反相高效液相色譜法制備出來的Aβ -淀粉樣多肽1-42進行純度的檢測提供了更多更方便可靠的檢測途徑。大部分對Αβ-淀粉樣多肽1-42檢測色譜柱都使用的是PLRP-S (剛性聚合物色譜柱)，而本發明使檢測方法不僅在體系上，而且在色譜分析柱上都有了更多樣的選擇。
圖I為PLRP-S填料色譜柱在TFA體系下的檢測圖。圖2為PLRP-S填料色譜柱在甲酸體系下的檢測圖。圖3為C4鍵合相填料色譜柱甲酸體系下的檢測圖。圖4為CS鍵合相填料色譜柱甲酸體系下的檢測圖。
具體實施例方式實施例I
I.樣品處理稱取O. Img的Αβ -淀粉樣多肽1-42，用O. Iml的超純水超聲溶解至完全，用O. 45um的濾膜過濾,取濾液待用。2.色譜檢測條件日本島津液相色譜儀(型號LC_10AVP，高壓雙泵，紫外檢測器)，島津N2000工作站。流動相A相體積濃度為O. 1%三氟乙酸的水溶液，B相體積濃度為O. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度O到25分鐘A:B由90:10到50:50 ;流速lml/min ；波長220nm ;色譜柱=PLRP 柱，IOum,4. 6X250mm (I. D);進樣量0. lmg/0. lml，5ul。3.通過色譜儀的紫外檢測吸收得PLRP-S填料色譜柱在TFA體系下的檢測圖(圖1)。實施例2
I.樣品處理稱取O. Img的Αβ -淀粉樣多肽1-42，用O. Iml的超純水超聲溶解至完全，用O. 45um的濾膜過濾,取濾液待用。2.色譜檢測條件日本島津液相色譜儀(型號LC_10AVP，高壓雙泵，紫外檢測器)，島津N2000工作站。流動相A相體積濃度為O. 1%三氟乙酸的水溶液，B相體積濃度為O. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度O到25分鐘A:B由90:10到50:50 ;流速lml/min ；波長220nm ;色譜柱=PLRP 柱，IOum,4. 6X250mm (I. D);進樣量0. lmg/0. lml，5ul。3.通過色譜儀的紫外檢測吸收得PLRP-S填料色譜柱在甲酸體系下的檢測圖(圖2)。實施例3I.樣品處理稱取O. Img的Αβ -淀粉樣多肽1-42，用O. Iml的超純水超聲溶解至完全，用O. 45um的濾膜過濾,取濾液待用。2.色譜檢測條件日本島津液相色譜儀(型號LC_10AVP，高壓雙泵，紫外檢測器)，島津N2000工作站。流動相A相體積濃度為O. 05-0. 1%甲酸的水溶液，B相體積濃度為O. 05%-0· 1%甲酸的乙腈溶液，梯度O到25分鐘A:B由90:10到40:60 ;流速:1ml/min ;波長220nm ;色譜柱:C4 柱,5um, 4. 6 X 250mm (I. D);進樣量:0. lmg/0. lml, 5ul。3.通過色譜儀的紫外檢測吸收得C4填料色譜柱在甲酸體系下的檢測圖(圖3)。實施例4
I.樣品處理稱取O. Img的Αβ -淀粉樣多肽1-42，用O. Iml的超純水超聲溶解至完全，用O. 45um的濾膜過濾,取濾液待用。
2.色譜檢測條件日本島津液相色譜儀(型號LC_10AVP，高壓雙泵，紫外檢測器)，島津N2000工作站。流動相A相體積濃度為O. 05-0. 1%甲酸的水溶液，B相體積濃度為O. 05%-0· 1%甲酸的乙腈溶液，梯度O到25分鐘A:B由90:15到35:65 ;流速:1ml/min ;波長220nm ;色譜柱:C8 柱,5um, 4. 6X 250mm (I. D);進樣量:0. lmg/0. lml, 5ul。3.通過色譜儀的紫外檢測吸收得CS填料色譜柱在甲酸體系下的檢測圖(圖4)。
權利要求
1.ー種AP -淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，其特征是包括如下步驟 將AP-淀粉樣多肽1-42用超純水超聲溶解至完全，再用濾膜過濾，取濾液待用； 利用反相高效液相色譜法，對濾液進行檢測，其檢測條件是 色譜柱C4硅膠柱，C8硅膠柱， 流動相A相甲酸的水溶液，B相甲酸的こ腈溶液， C4柱時間minAB O90%10% 25.0040%60% 30.0090%10% C8柱時間minAB 085%15% 25.0035%65% 30.0085%15% 流速lml/min,波長220nm。
2.根據權利要求I所述的ー種AP-淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，其特征是所述 >C4娃膠柱尺寸為5um,4. 6X250mm。
3.根據權利要求I所述的ー種AP-淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，其特征是所述C8娃膠柱尺寸為5um, 4. 6 X 250mm。
4.根據權利要求I所述的ー種AP-淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，其特征是所述A相是含體積濃度為0. 05-0. 1%甲酸水溶液，所述B相是體積濃度為0. 05-0. 1%甲酸こ腈溶液。
5.根據權利要求I所述的ー種AP-淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，其特征是步驟2)中C4柱的流動相梯度選擇0到25min A:B由90:10到40:60。
6.根據權利要求I所述的ー種檢測AP-淀粉樣多肽1-42純度的方法，其特征是步驟2)中C8柱的流動相梯度選擇0至Ij 25min A:B由85:15到35:65。
全文摘要
本發明公開了一種Aβ-淀粉樣多肽1-42純度的檢測方法，利用反相高效液相色譜法以及不同鍵合填料的色譜柱來檢測Aβ-淀粉樣多肽1-42純度，以解決現有對Aβ-淀粉樣多肽1-42純度檢測方法的局限性，為檢測Aβ-淀粉樣多肽1-42純度提供更多的途徑。其檢測條件為色譜柱C4硅膠柱，C8硅膠柱；流動相A相甲酸水溶液，B相甲酸乙腈溶液，C4柱0到25分鐘A∶B由90∶10到40∶60；C8柱0到25分鐘A∶B由85∶15到35∶65；流速1ml/min，波長220nm，樣品濃度0.1mg-0.2mg/0.1ml，上樣量0.1-0.2mg。本發明無論在色譜柱的選擇上還是流動相的試劑上，都是很容易得到的，成本低，操作方便，更能達到檢測Aβ-淀粉樣多肽1-42純品純度的目的。
文檔編號G01N30/88GK102955014SQ20121039848
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者徐紅巖, 閆鳳 申請人:上海吉爾多肽有限公司, 吉爾生化(上海)有限公司