專利名稱：微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫學免疫體外診斷領域，具體涉及一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
正常情況下，血漿中白蛋白通過腎小球毛細血管網時，很少進入原尿，即使少量通過，99%可被曲腎小管重新吸收，因此終尿中白蛋白不存在。但是由于腎功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并發癥等因素可以導致白蛋白病理性升高。一般情況下，尿蛋白明顯升高，常見于嚴重腎小球病變，輕度增加表示腎小管損害。人尿液中的白蛋白達到在30-300mg/天或20-200mg/L濃度稱為微量白蛋白(又名微量尿白蛋白，Micoralbuminuria, MAU)。微量白蛋白通常被認為是腎功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并發癥等重要臨床標志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的檢測對上述疾病的早期診斷、早期治療和減小風險由重要的參考價 值和臨床意義。目前，測定微量白蛋白的方法有芯片電泳法、毛細管電泳法、酶聯免疫分析法、高效液相色譜法等。在這些檢測方法較為繁瑣、歷時較長、費用較高，不利于臨床醫生的及時診斷和療效觀察。中國專利申請號200810305085. 9公開了一種半定量檢測尿微量白蛋白膠體硒試紙，該試紙條能夠檢測含量不低于20 μ g/ml尿液中白蛋白。此法雖然簡單，但是準確度不高、且不能定量檢測。中國專利申請號01126895. 6提供了一種快速檢測腎臟損害的尿白蛋白芯片，但其未對芯片的制備工藝、檢測靈敏度、最低檢出量等重要特性給予闡述，限制了其應用的可靠性。中國專利申請號201110458518. 6公開了微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒及其制備工藝，具體描述了該試劑盒的制備，還說明了試劑盒檢測靈敏度15 μ g/ml。但是膠體金免疫層析存在以下缺陷
⑴膠體金標記過程是靜電吸附過程，是一種物理過程，故在液相中穩定性較差，往往造成已標記上的蛋白分子又再次脫落；
⑵只有當金顆粒集聚到一定量時，人肉眼才能觀察到紫紅色的條帶，且該顏色與背景對比度不大，從而限制了檢測靈敏度。
發明內容
本發明的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一種靈敏度高、操作簡便和能進行定量檢測微量白蛋白的熒光免疫定量測定試紙條及其制備方法。本發明解決上述技術問題所采取的技術方案為一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，在底襯上依次搭接地粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的結合墊上包被有熒光膠乳微球標記的人白蛋白抗體，所述的硝酸纖維素膜上包被有白蛋白重組抗原的檢測線和兔抗鼠IgG抗體的質控線。所述膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm,優選153nm。
所述熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標記的鏈霉親和素制備得到。所述熒光膠乳微球的熒光為直接熒光物質，優選異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5、熒光素Cy7中的一種。所述結合墊材質為玻璃纖維素膜或聚酯膜。一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟
1)包被熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體結合墊的制備
將熒光標記的鏈霉親和素和膠乳微球吸附結合，制備得到熒光膠乳微球； 將生物素與人白蛋白單克隆抗體結合，制備得到生物素化白蛋白抗體；
將所得熒光膠乳微球和生物素化白蛋白抗體混合，即得熒光膠乳微球標記人白蛋白抗
體；
將所得熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體噴涂在結合墊上；
2)硝酸纖維素膜的制備
用包被緩沖液分別稀釋白蛋白重組抗原和兔抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的白蛋白重組抗原和兔抗鼠IgG抗體分別平行地噴于硝酸纖維素膜上形成白蛋白檢測線和兔抗鼠IgG抗體質控線；
3)在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙得到試紙板，按照要求切割成適當寬度的試紙條。本發明能夠準確定量檢測人尿液中微量白蛋白含量，具有操作簡便、準確度高、靈敏度高、成本低等特點。
圖I為本發明微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒結構示意圖。圖2為本發明實施例I所制備的試劑盒的標準曲線。圖3為本發明實施例I所制備的試劑盒的線性范圍相關性。圖4為本發明實施例I所制備的試劑盒與與奧林巴斯AU5400全自動生化儀及配套英國朗道生產的微量白蛋白試劑盒檢測結果相關性比較。其中，圖I :1、底襯；2、樣品墊；3、結合墊；4、硝酸纖維素膜；5、吸水紙；6、檢測線；7、質控線。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，在底襯I上依次搭接地樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙5，所述結合墊3上噴涂有熒光膠乳微球標記的人白蛋白抗體，所述硝酸纖維素膜4上有包被白蛋白重組抗原的檢測線6和兔抗鼠IgG抗體的質控線7。進一步所述的膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm,優選153nm。所述的熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標記的鏈霉親和素制備得到。所述熒光為直接熒光物質，優選異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、突光素Cy5、突光素Cy7中的一種。實施例I微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒制備方法如下I)突光膠乳微球的制備
熒光膠乳微球的制備用吸附緩沖液(50mM、pH5. 8的檸檬酸鹽緩沖液)稀釋粒徑為153nm膠乳微球至終濃度20mg/ml,體積為5ml,制得膠乳微球懸浮液；添加適量的突光素Cy5標記鏈霉親和素(購自上海研晶生物科技有限公司)在吸附緩沖液里，終體積為5ml ；將上述膠乳微球懸浮液加入到上述含有熒光素標記鏈霉親和素的吸附緩沖液中，制得混合液；將所得混合液在室溫下溫浴1-2小時，并不斷攪拌，然后離心，收集沉淀，沉淀用儲存緩沖液(含有O. 05%酪蛋白的吸附緩沖液)溶解，放置4°C保存，備用。2)生物素化白蛋白抗體的制備
將人白蛋白單克隆抗體用O. lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液稀釋至lmg/ml,交互用
O.lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液對人白蛋白單克隆抗體充分透析；用Iml DMSO溶解Img的NHSB，得到NHSB溶液；向上述Iml白蛋白單克隆抗體溶液加入20 μ I NHSB溶液，室溫攪 拌2-4小時，繼續室溫攪拌10分鐘，然后用20mM、pH7. 2 PBS緩沖液透析，即得生物素化白蛋白單克隆抗體。3)熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體的制備
將步驟I)制得的熒光膠乳微球和步驟2)制得的生物素化白蛋白單克隆抗體混合在一起，反應30分鐘后離心，沉淀物用儲存緩沖液溶解，恢復至原體積。4)包被熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體結合墊3的制備
將步驟3)制得的熒光膠乳微球標記人白蛋白單克隆抗體，按3. O μ Ι/cm3的用量噴在玻璃纖維素膜3上。5)硝酸纖維素膜4的制備
a)包被緩沖液的制備將O. 025M、pH7. 4的PBS，用O. 22 μ膜過濾，置于4°C備用，有效期7天。b)封閉液的制備將含1%BSA, 1%鹿糖，O. 025M、ρΗ7· 5的PBS,用O. 22 μ膜過濾，
置于4°C備用，有效期3天。c)白蛋白重組抗原檢測線6的制備將白蛋白重組抗原按2. Omg/ml的濃度，蠕動泵授液量O. 4ml/min,劃線速度50m/20min,在干燥箱內2(TC鼓風干燥12小時。d)質控線7的制備將兔抗鼠IgG抗體按8mg/ml的濃度，蠕動泵授液量O. 4ml/min,劃線速度50m/20min，在硝酸纖維素膜5上劃線，該線與檢測線6平行，放入干燥箱內20°C鼓風干燥12小時。e)用上述封閉液將含有檢測線6和質控線7的硝酸纖維素膜4于37°C封閉60分鐘，取出后置37°C下烘干處理兩個小時，封袋備用。6)試紙條組裝
在底襯I上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、玻璃纖維素膜3、硝酸纖維素膜4和吸水紙5得到試紙板，按照要求切割成適當寬度的試紙條。實施例2另一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒制備方法如下
O突光膠乳微球的制備
熒光膠乳微球的制備用吸附緩沖液(50mM、pH5. 8的檸檬酸鹽緩沖液)稀釋粒徑為500nm膠乳微球至終濃度30mg/ml,體積為6ml,制得膠乳微球懸浮液；添加適量的紅色突光素羅丹明標記鏈霉親和素(購自上海酶聯生物科技有限公司)在吸附緩沖液里，終體積為6ml ;將上述膠乳微球懸浮液加入到上述含有紅色熒光素羅丹明標記鏈霉親和素的吸附緩沖液中，制得混合液；將所得混合液在室溫下溫浴1-2小時，并不斷攪拌，然后離心，收集沉淀，沉淀用儲存緩沖液(含有O. 06%酪蛋白的吸附緩沖液)溶解，放置4°C保存，備用。2)生物素化白蛋白抗體的制備(同實施例I中的生物素化白蛋白抗體的制備)
3)熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體的制備(同實施例I中的熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體的制備)
4)涂覆熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體結合墊3的制備
將步驟3)制得的熒光膠乳微球標記人白蛋白單克隆抗體，按2. O μ Ι/cm3的用量噴在聚酯膜3上。5)硝酸纖維素膜4的制備(同實施例I中的硝酸纖維素膜4的制備)
6)試紙條組裝(同實施例I中試紙條組裝)
實施例3微量白蛋白熒光免疫定量測定試紙條定量檢測 O繪制標準曲線
在按實施例I制備好的微量白蛋白熒光免疫定量測定試紙條樣品墊上加入不同濃度白蛋白抗原標準品(取六個不同濃度，分別為10、20、40、80、160、200mg/L，每個濃度設3個重復)，通過南京基蛋生物科技有限公司的熒光免疫定量分析儀GeteinllOO讀取檢測線7和質控線8信號，實驗結果及分析見表I。表I白蛋白標準品檢測結果
權利要求
1.一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，在底襯(I)上依次搭接地粘貼樣品墊(2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水紙(5)，其特征在于所述的結合墊(3)上包被有熒光膠乳微球標記的人白蛋白抗體，所述的硝酸纖維素膜(4)上包被有白蛋白重組抗原的檢測線(6)和兔抗鼠IgG抗體的質控線(7)。
2.根據權利要求I所述微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于所述膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。
3.根據權利要求2所述微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于所述膠乳微球粒徑為153nm。
4.根據權利要求I所述微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于所述熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標記的鏈霉親和素制備得到。
5.根據權利要求I所述的微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于所述熒光膠乳微球的熒光為直接熒光物質。
6.根據權利要求5所述微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于所述直接熒光物質為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5、熒光素Cy7中的一種。
7.根據權利要求I所述的微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于所述結合墊(3)材質為玻璃纖維素膜或聚酯膜。
8.—種如權利要求I所述一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟 1)包被熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體結合墊的制備 將熒光標記的鏈霉親和素和膠乳微球吸附結合，制備得到熒光膠乳微球； 將生物素與人白蛋白單克隆抗體結合，制備得到生物素化白蛋白抗體； 將所得熒光膠乳微球和生物素化白蛋白抗體混合，即得熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體； 將所得熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體噴涂在結合墊上； 2)硝酸纖維素膜的制備 用包被緩沖液分別稀釋白蛋白重組抗原和兔抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的白蛋白重組抗原和兔抗鼠IgG抗體分別平行地噴于硝酸纖維素膜上形成白蛋白檢測線和兔抗鼠IgG抗體質控線； 3)在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙得到試紙板，按照要求切割成適當寬度的試紙條。
全文摘要
本發明涉及一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法，定量檢測試劑盒的底襯上依次搭接地粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的結合墊上包被有熒光膠乳微球標記的人白蛋白抗體，所述的硝酸纖維素膜上包被有白蛋白重組抗原的檢測線和兔抗鼠IgG抗體的質控線。本發明能夠準確定量檢測人尿液中微量白蛋白含量，具有操作簡便、準確度高、靈敏度高、成本低等特點。
文檔編號G01N33/533GK102879586SQ20121038364
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者蘇恩本, 王勇, 陳偉, 黃力 申請人:南京基蛋生物科技有限公司