檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條及方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條及方法。試紙條包括微孔條、微孔試劑、試紙和微孔塞，所述的微孔試劑為凍干的膠體金標記的大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素特異性抗體，所述試紙由樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜、底板，依次連接組成，所述反應膜上包括四條檢測線和一條質控線，四條檢測線分別包被有大觀霉素-載體蛋白偶聯物、鏈霉素-載體蛋白偶聯物、慶大霉素-載體蛋白偶聯物和新霉素-載體蛋白偶聯物，質控線包被有抗抗體。用本發明試紙條檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的方法，簡便、快速、直觀、準確、便于攜帶、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
【專利說明】檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條及方法。
【背景技術】
[0002]大觀霉素又稱壯觀霉素、奇放線菌素、壯觀菌素等，為大觀鏈霉菌所產生的一種氨基環醇類抗生素，對革蘭氏陰性菌(如布魯氏菌、克雷伯菌屬、變形桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等)有較強作用，對革蘭氏陽性菌(鏈球菌、葡萄球菌等)作用較弱，對支原體亦有一定作用，是一新型特效專治淋病的抗生素，對淋病奈瑟菌有較強的抗菌作用。能促進動物生長，是良好的動物飼料添加劑，作為獸藥廣泛應用于畜牧業中。一些不法商販受經濟利益的驅使濫用抗生素，使大量抗生素殘留在畜產品中，如果長期食用含有抗生素殘留的動物源性食品，也就相當于長期低劑量吸收抗生素，使人體內菌株產生抗生素抗性，給患病時使用抗生素治療帶來不良影響，會破壞機體內環境平衡，造成菌群失調，抗生素過敏體質的人會出現過敏反應，引起免疫性溶血，同時造成食品和環境中藥物殘留污染的一系列問題。
[0003]鏈霉素是氨基糖苷類抗生素，在奶牛及奶羊養殖中應用普遍，但由于使用管理不規范，常造成鮮奶及奶粉中鏈霉素殘留。由于鏈霉素、對人體具有較大的毒副作用，嚴重時可造成過敏性休克和耳聾，特別是對小孩的危害較大，可透過胎盤進入羊水和胎兒循環，危害胎兒健康。各國對乳制品中的鏈霉素、雙氫鏈霉素均制定了嚴格的殘留限量，如日本規定奶中鏈霉素與雙氫鏈霉素的總限量為0.2 mg/kg，美國規定乳及牛奶中雙氫鏈霉素的限量為0.125 mg/kg,中國規定奶中鏈霉素與雙氫鏈霉素的限量均為0.2 mg/kg,所以對奶粉中的鏈霉素、雙氫鏈霉素殘留量進行檢測對于控制奶粉質量，維護人類的飲食健康有重要意義。
[0004]慶大霉素是由小單胞菌產生的一種氨基糖苷類抗生素，對多種革蘭陽性和陰性菌都具有顯著的抗菌效果，作為飼料添加劑和治療疾病的抗生素廣泛應用于畜牧業。然而，慶大霉素對人類具有明顯的毒害作用，對腦神經、聽覺以及腎臟的損害嚴重。許多國家和國際組織均明確規定了食品中該藥物殘留的最大殘留限量。歐盟規定，牛奶中的最大殘留量為100 Ii g/kg,肌肉、脂肪中的最大殘留量為50 V- g/kg。
[0005]新霉素屬氨基糖苷類抗生素，抗菌譜廣，在獸醫臨床上應用廣泛，是重要的抗感染藥物，還被普遍用于治療乳腺炎、角膜炎、結膜炎、耳炎、皮炎、外傷感染、足腐爛等疾病。我國和其它一些國家還將新霉素作為飼料抗生素添加劑使用，用于預防畜禽感染引起的早期損失和腸炎，提高飼料利用率，促進生長。雖然新霉素在獸醫和畜牧上使用取得了巨大的成功，但其對人和動物存在潛在的耳毒性和腎毒性，為此，我國和歐盟等國家均制定了動物源性食品中新霉素最高殘留限量。
[0006]目前免疫分析領域缺乏能夠同時檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素這四種藥物的技術及其應用。因此，在實踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、檢測藥物種類多、適合大規模推廣的檢測方法。
【發明內容】
[0007]本發明的一個目的是提供一種檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條。
[0008]本發明所提供的試紙條包括微孔條、微孔試劑、微孔塞和試紙，試紙包括底板、樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜，其依次連接；所述微孔試劑為凍干的大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物；大觀霉素特異性抗體為大觀霉素單克隆抗體，鏈霉素特異性抗體為鏈霉素單克隆抗體，慶大霉素特異性抗體為慶大霉素單克隆抗體，新霉素特異性抗體為新霉素單克隆抗體；反應膜上包被有四條檢測線和一條質控線；微孔試劑中包含大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物,鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物,慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物，新霉素單克隆抗體-膠體金標記物，大觀霉素檢測線包被大觀霉素-載體蛋白偶聯物，鏈霉素檢測線包被鏈霉素-載體蛋白偶聯物，慶大霉素檢測線包被慶大霉素-載體蛋白偶聯物，新霉素檢測線包被新霉素-載體蛋白偶聯物，質控線包被羊抗鼠抗抗體。
[0009]所述保護膜粘貼在樣品吸收墊上的檢測端，上面有MAX標記線。
[0010]所述的大觀霉素檢測線靠近樣品吸收墊一端，質控線靠近吸水墊一端，鏈霉素檢測線、慶大霉素檢測線、新霉素檢測線在大觀霉素檢測線和質控線之間。其中大觀霉素檢測線用檢測線(Tl)表示，鏈霉素檢測線用檢測線(T2)表示，慶大霉素檢測線用檢測線(T3)表示，新霉素檢測線用檢測線(T4)表示，質控線用質控線(C)表示。以試紙的樣品吸收墊一端為始端，以試紙的吸水墊一端為末端，質控線(C)距離反應膜與吸水墊始端相連的一端為5-8mm,檢測線(T4)距離質控線(C) 4_6mm，檢測線(T3)距離檢測線(T4) 4_6mm，檢測線(T2)距離檢測線(T3) 4-6mm,檢測線(Tl)距離檢測線(T2) 4_6mm。
[0011]所述大觀霉素-載體蛋白偶聯物是由大觀霉素與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0012]所述鏈霉素-載體蛋白偶聯物是由鏈霉素與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0013]所述慶大霉素-載體蛋白偶聯物是由慶大霉素與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0014]所述新霉素-載體蛋白偶聯物是由新霉素與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0015]所述大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物中的大觀霉素特異性抗體是以大觀霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得。
[0016]所述鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物中的鏈霉素特異性抗體是以鏈霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得。
[0017]所述慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物中的慶大霉素特異性抗體是以慶大霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得。
[0018]所述新霉素特異性抗體-膠體金標記物中的新霉素特異性抗體是以新霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得。
[0019]所述底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；吸水墊為吸水紙；反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；吸水墊為吸水紙；保護膜為PE材質保護膜。
[0020]本發明的另一個目的是提供了一種制備上述試紙條的方法，其步驟包括:
[0021]I)在微孔條上制備凍干的大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑，并用微孔塞蓋在微孔條上；
[0022]2)制備四條分別具有包被，大觀霉素-載體蛋白偶聯物，鏈霉素-載體蛋白偶聯物，慶大霉素-載體蛋白偶聯物和新霉素-載體蛋白偶聯物的檢測線和一條包被抗抗體的質控線的反應膜；
[0023]3)將2)制備好的反應膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板組裝成試紙；
[0024]4)將I)和3)制備好的凍干有大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑、試紙、微孔條以及微孔塞組裝成試紙條。
[0025]具體的說，步驟包括:
[0026]1、大觀霉素抗原的合成及其抗體的制備
[0027]I)將大觀霉素與載體蛋白偶聯，形成大觀霉素-載體蛋白偶聯物；
[0028]2)用大觀霉素-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到分泌大觀霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0029]2、鏈霉素抗原的合成及其抗體的制備
[0030]I)將鏈霉素與載體蛋白偶聯，形成鏈霉素-載體蛋白偶聯物；
[0031]2)用鏈霉素-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到分泌鏈霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0032]3、慶大霉素抗原的合成及其抗體的制備
[0033]I)將慶大霉素與載體蛋白偶聯，形成慶大霉素-載體蛋白偶聯物；
[0034]2)用慶大霉素-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到分泌慶大霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0035]4、新霉素抗原的合成及其抗體的制備
[0036]I)將新霉素與載體蛋白偶聯，形成新霉素-載體蛋白偶聯物；
[0037]2)用新霉素-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到分泌新霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0038]5、提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗體。
[0039]6、用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金。
[0040]7、將制備的大觀霉素特異性抗體、鏈霉素特異性抗體、慶大霉素特異性抗體和新霉素特異性抗體分別加入到制備的膠體金中，得到大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑。
[0041 ] 8、將大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑凍干在微孔條中后，將微孔條上蓋上微孔塞。[0042]9、將樣品吸收墊用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0.5%(體積百分含量))、pH7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，在37°C下烘干2h。
[0043]10、在底板上按順序貼上樣品吸收墊、反應膜、吸水墊和保護膜。
[0044]11、將制備好的微孔試劑、試紙、微孔條和微孔塞組裝成試紙條，2_8°C條件下保存12個月。
[0045]本發明的另一個目的提供了一種牛奶樣本中大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素殘留的檢測方法。
[0046]用本發明上述任一所述試紙條進行檢測。
[0047]本發明試紙條的檢測原理:將待檢牛奶樣本滴加于包含有微孔試劑的微孔條中，混勻后，孵育5min，將標有MAX標記線端向下，插入包含有孵育后的微孔試劑微孔條中，待檢樣品液與微孔中的金標抗體結合后一起向反應I吳擴散；若待檢樣品液中大觀霉素或鏈霉素或慶大霉素或新霉素的含量高，則擴散過程中待測樣品液中的大觀霉素或鏈霉素或慶大霉素或新霉素可與金標抗體相結合，進而完全封閉金標抗體上大觀霉素或鏈霉素或慶大霉素或新霉素的抗原結合點，阻止金標抗體與反應膜上大觀霉素-載體蛋白偶聯物結合或鏈霉素-載體蛋白偶聯物結合或慶大霉素-載體蛋白偶聯物結合或新霉素-載體蛋白偶聯物的結合，相對應的大觀霉素檢測線或鏈霉素檢測線或慶大霉素檢測線或新霉素檢測線不能顯色，而抗抗體則可與大觀霉素金標抗體或鏈霉素金標抗體或慶大霉素金標抗體或新霉素金標抗體結合，質控線顯色；若待檢樣品液中大觀霉素或鏈霉素或慶大霉素或新霉素的含量低或者無，則對應的大觀霉素金標抗體或鏈霉素金標抗體或慶大霉素金標抗體或新霉素金標抗體上的抗原結合位點不能被封閉，進而大觀霉素金標抗體會與反應膜上大觀霉素-載體蛋白偶聯抗原結合或鏈霉素金標抗體會與反應膜上鏈霉素-載體蛋白偶聯抗原結合或慶大霉素金標抗體會與反應膜上慶大霉素-載體蛋白偶聯抗原結合或新霉素金標抗體會與反應膜上新霉素-載體蛋白偶聯抗原結合，對應的大觀霉素檢測線顯色或鏈霉素檢測線顯色或慶大霉素檢測線顯色或新霉素檢測線顯色，同時抗抗體也可與大觀霉素金標抗體或鏈霉素金標抗體或慶大霉素金標抗體或新霉素金標抗體結合，質控線顯色；如果質控線不顯色，則試紙條失效。
[0048]陰性(_):C線顯色，四條T線均顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣本中大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素濃度均低于檢測限，如圖8.a所示。
[0049]陽性(+ ):C線顯色，Tl線不顯色，表示牛奶樣本中大觀霉素濃度等于或高于檢測限；(:線顯色，T2線不顯色，表示牛奶樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測限；C線顯色，T3線不顯色，表示牛奶樣本中慶大霉素濃度等于或高于檢測限；C線顯色，T4線不顯色，表示牛奶樣本中新霉素濃度等于或高于檢測限，如圖8.a-8.f所示。
[0050]無效:未出現C線，表明不正確的操作過程或試紙條已失效，如圖8.g-8.k所示。
[0051]本發明試紙條可檢測藥物包括:大觀霉素、鏈霉素、雙氣鏈霉素、慶大霉素、新霉素。
[0052]本發明的試紙條具有如下有益效果:
[0053]1、靈敏度高:傳統的試紙卡均具有固定試紙的卡殼固定裝置，卡殼固定裝置緊緊地將試紙固定其中，在對樣品檢測時，由于卡殼與試紙結合的比較緊密，致使檢測樣品溶液不能夠充分滲透到樣品吸收墊一段，并在試紙上進行層析的速度十分緩慢，導致檢測樣品中的藥物不能夠與檢測線上包被的包被原充分接觸，致使試紙卡的靈敏度下降。本發明試紙條比傳統試紙卡的檢測靈敏度高，由于本發明試紙條的試紙為裸條狀，無需殼體緊固裝置，檢測樣品可以直接接觸試紙的樣品吸收墊一端，并且樣品在試紙上的層析速度比較快，使樣品中的待檢藥物能夠充分的與檢測線上包被的包被原結合，從而提高了試紙條的檢測靈敏度。大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素檢測試紙條以股體金標記聞未和力的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。其中的大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干在微孔試劑條中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，增加整個體系的反應靈敏度。因此，本發明試紙條具有較高的特異性和靈敏度。本試紙條對各種藥物檢測靈敏度分別為:大觀霉素20 u g/L、鏈霉素80 u g/L、雙氫鏈霉素80 u g/L、慶大霉素20 u g/L、新霉素500 u g/L。
[0054]2.操作簡便快速:對于以往的試紙卡檢測原料奶必須要將原料奶加入稀釋液進行稀釋才能夠點樣檢測，原因是由于固定試紙的塑料殼體緊緊地把試紙固定在殼體內，而原料奶比較粘稠，所以直接將原料奶在試紙卡的加樣孔進行點樣檢測的話，由于殼體與試紙結合緊密以及奶液粘稠所致，原料奶樣品無法完全滲透到樣品吸收墊和結合物釋放墊中，并且在試紙上的層析速度比較緩慢，以至于無法檢測，故要將原料奶加入稀釋液進行稀釋后方可檢測。使用本發明試紙條檢測時無需任何其它試劑，檢測原料奶時，也不需要對原料奶進行稀釋，原因由于本發明試紙條中的試紙為裸條狀，即無需用殼體對其進行固定，只要將待檢樣品溶液直接滴加于凍干有大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔中，混勻后，孵育5min，再將試紙標有MAX線標記端向下，插入孵育后的微孔試劑中，試紙可以與樣品溶液充分接觸，5min后觀察結果。對于牛奶樣品的檢測，本發明試紙條比傳統試紙卡檢測時間短，由于本發明試紙條無需對樣品進行稀釋，可直接對樣品進行檢測。
[0055]本發明試紙條敏感度高、檢測藥物種類多、成本低、操作簡單、便于攜帶、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點。其中，采用高特異性的大觀霉素單克隆抗體、鏈霉素單克隆抗體、慶大霉素單克隆抗體和新霉素單克隆抗體，保證了檢測結果的可靠性；將金標抗體凍干在微孔條中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，增加整個體系的反應靈敏度。本發明試紙條能夠同時檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素四種藥物，實現了一個試紙條對多種藥物的檢測，滿足了市場上對大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素同時檢測的需求。用本發明試紙條檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的方法，簡便、快速、直觀、準確，適用范圍廣，成本低，易推廣使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0056]圖1凍干有金標抗體的微孔條圖。
[0057]圖2微孔塞俯視圖。[0058]圖3微孔塞剖面結構示意圖。
[0059]圖4試紙剖面結構示意圖。
[0060]圖5試紙的俯視圖。
[0061]圖6四環素類藥物半抗原合成路線圖。
[0062]圖7試紙條檢測方法示意圖。
[0063]圖8試紙條檢測結果判定圖。
【具體實施方式】
[0064]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0065]實施例1、檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條的構成
[0066]一、凍干有金標抗體的微孔條
[0067]所述微孔條中裝有微孔試劑，其中I為微孔條，2為凍干的大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑；
[0068]所述包含有微孔試劑的微孔條上具有微孔塞3 (圖2和圖3);
[0069]所述微孔條中凍干的大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑,大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物的凍干量為0.20-0.25^g/ml ;鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物的凍干量為0.30-0.40^g/ml ;慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物的凍干量為0.20-0.25Mg/ml ;新霉素特異性抗體-膠體金標記物的凍干量為
0.20-0.25M-g/ml。
[0070]二、試紙(圖4和圖5)
[0071]所述試紙是由底板、樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜組成；
[0072]所述樣品吸收墊4、反應膜5、吸水墊6和保護膜7依次按順序黏貼在所述底板8上，樣品吸收墊的末端與反應膜相連，反應膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；
[0073]保護膜7覆蓋在樣品吸收墊上的檢測端，在檢測端保護膜上應有MAX字樣。
[0074]所述反應膜上有四條檢測線分別為檢測線(Tl) 9-1、檢測線(T2) 9-2、檢測線(T3)9-3和檢測線(T4) 9-4以及一條質控線(C) 10，四條檢測線和一條質控線均為與所述試紙的長相垂直的條帶狀，四條檢測線位于近于有MAX標記線的保護膜的一側，質控線(C)位于遠離有MAX標記的保護膜的一側。質控線(C)距離反應膜的末端與吸水墊相連的一端為5-8mm,檢測線(T4)距離質控線(C) 4_6mm，檢測線(T3)距離檢測線(T4) 4_6mm，檢測線(T2)距離檢測線(T3 ) 4-6mm,檢測線(TI)距離檢測線(T2 ) 4_6mm。檢測線(TI)包被有大觀霉素-載體蛋白偶聯物(大觀霉素-卵清白蛋白)，檢測線(T2)包被有鏈霉素-載體蛋白偶聯物(鏈霉素-卵清白蛋白)，檢測線(T3 )包被有慶大霉素-載體蛋白偶聯物(慶大霉素-卵清白蛋白)，檢測線(T4)包被有新霉素-載體蛋白偶聯物(新霉素-卵清白蛋白)，質控線(C)包被有羊抗鼠抗抗體。
[0075]底板為PVC底板；樣品吸收墊為吸濾紙；吸水墊為吸水紙；反應膜為硝酸纖維素膜；所述保護膜為PE材質保護膜。[0076]將上述試紙與微孔試劑、微孔條以及微孔塞組裝成試紙條，在2~8°C的環境中儲存，有效期12個月。
[0077]實施例2、實施例1中所述試紙條的制備方法
[0078]一、試紙條的制備
[0079]該試紙條的制備方法主要包括如下步驟:
[0080]I)在微孔條中制備凍干的大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑，并用微孔塞蓋在微孔條上。
[0081]2)制備具有包被大觀霉素-載體蛋白偶聯物的檢測線(Tl)、包被鏈霉素-載體蛋白偶聯物的檢測線(T2)、包被慶大霉素-載體蛋白偶聯物的檢測線(T3)、包被新霉素-載體蛋白偶聯物的檢測線(T4)和包被羊抗鼠抗抗體的質控線(C)的反應膜；
[0082]3)將2)制備好的反應膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板組裝成試紙；
[0083]4)將I)和3)制備好的凍干有大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物、鏈霉素單克隆抗體-膠體金標記物、慶大霉素單克隆抗體-膠體金標記物和新霉素單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑、試紙、微孔條以及微孔塞組裝成試紙條。
[0084]下面分步詳細敘述:
[0085](一)各部件的制備
[0086]1、抗原的制備
[0087]I)、大觀霉素-載體蛋白偶聯物的合成與鑒定
[0088]a.大觀霉素半抗原合成:取大觀霉素0.66 g、羧甲基輕胺0.27 g和吡唳I ml于20 ml DMSO中的混合液，在室溫下攪拌反應20小時，蒸除溶劑，柱層析純化后在乙醇-水體系中重結晶得到大觀霉素與羧甲基羥胺的縮合物，分子結構如下:
[0089]
【權利要求】
1.一種檢測大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素的試紙條，其特征在于包括試紙條、微孔條、微孔試劑和微孔塞，所述試紙包括反應膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護膜、底板，所述反應膜上有四條檢測線和一條質控線，四條檢測線分別包被有大觀霉素-載體蛋白偶聯物、鏈霉素-載體蛋白偶聯物、慶大霉素-載體蛋白偶聯物和新霉素-載體蛋白偶聯物，質控線包被有抗抗體，所述微孔試劑為凍干的大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物。
2.根據權利要求1所``述的試紙條，其特征在于所述試紙由樣品吸收墊、反應膜、吸水墊、保護膜依次黏貼在底板上組成，權利要求1所述微孔條上具有微孔塞。
3.根據權利要求2所述的試紙條，其特征在于:所述保護膜粘貼在試紙的樣品吸收墊上，為檢測端，上面有MAX標記線。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于所述的大觀霉素檢測線靠近樣品吸收墊一端，質控線靠近吸水墊一端，鏈霉素、慶大霉素、新霉素檢測線在大觀霉素檢測線和質控線之間。
5.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:大觀霉素-載體蛋白偶聯物是通過取大觀霉素0.66 g、羧甲基羥胺0.27 g和吡啶I ml于20 ml DMSO中的混合液，在室溫下攪拌反應20小時，蒸除溶劑，柱層析純化后在乙醇-水體系中重結晶得到大觀霉素與羧甲基羥胺的縮合物，再與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
6.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:鏈霉素-載體蛋白偶聯物是通過取1.0g鏈霉素、0.30 g鄰苯二甲酸酐和I ml吡啶在20 ml DMSO中的混合液，在80°C下攪拌反應24小時，蒸除溶劑，乙醇-水體系中多次重結晶得到鄰苯二甲酸單鏈霉素酯，再與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:慶大霉素-載體蛋白偶聯物是通過取0.39 g溴乙酸叔丁酯在5 ml DMSO中的溶液，40°C下緩慢滴加入0.90 g慶大霉素和I ml吡啶在10 ml DMSO中的混合物中。滴加完畢后，繼續反應6小時后，蒸除溶劑。簡單柱層析分離后，除去溶劑，加入20 ml DMSO和5 ml甲酸，室溫反應20小時，蒸除溶劑，乙醇-水體系中重結晶得到羧甲基慶大霉素，再與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
8.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:新霉素-載體蛋白偶聯物是通過取0.61 g新霉素和IOml DMSO的混合液，室溫下緩慢滴加入到0.14 g對苯二甲醛的10 mlDMSO溶液中，滴加完畢后室溫至60°C反應2-4小時，除去溶劑，乙醇-水體系中重結晶得到新霉素對苯二甲醛單縮合物，再與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
9.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物中的大觀霉素特異性抗體是以大觀霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得，所述大觀霉素特異性抗體為大觀霉素單克隆抗體；鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物中的鏈霉素特異性抗體是以鏈霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得，所述鏈霉素特異性抗體為鏈霉素單克隆抗體；慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物中的慶大霉素特異性抗體是以慶大霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得，所述慶大霉素特異性抗體為慶大霉素單克隆抗體；新霉素特異性抗體-膠體金標記物中的新霉素特異性抗體是以新霉素-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得，所述新霉素特異性抗體為新霉素單克隆抗體。
10.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述微孔條底部含有凍干的大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑。
11.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述微孔塞能夠緊密地塞在微孔條中。
12.—種制備權利要求1-9任一項所述的試紙條的方法，其步驟包括: 1)分別制備凍干有大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔試劑； 2)分別制備具有包被大觀霉素-載體蛋白偶聯物、鏈霉素-載體蛋白偶聯物、慶大霉素-載體蛋白偶聯物和新霉素-載體蛋白偶聯物的四條檢測線和包被抗抗體的質控線的反應膜； 3)將2)制備好的反應膜與樣品吸收墊、保護膜、吸水墊、底板組裝成試紙； 4)將I)和3)制備好的凍干有大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物、鏈霉素特異性抗體-膠體金標記物、慶大霉素特異性抗體-膠體金標記物和新霉素特異性抗體-膠體金標記物的微孔 試劑、微孔條、微孔塞和試紙組裝成試紙條。
13.—種同時檢測牛奶樣品中大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素和新霉素殘留的檢測方法，其特征在于直接將試紙插入包含有檢測樣品溶液和微孔試劑的混合溶液的微孔中進行檢測，其包括步驟: 1)用權利要求1-9任一項所述的試紙條進行檢測； 2)分析檢測結果。
【文檔編號】G01N33/577GK103713131SQ201210372008
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年9月29日 優先權日:2012年9月29日
【發明者】何方洋, 馮才偉, 張禹, 付軍權, 吳鵬, 楊秀賢, 李勇, 邵曉雪 申請人:北京勤邦生物技術有限公司