一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測HLA-DQA1基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、用于熒光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測與紅斑狼瘡密切相關的HLA-DQA1、IRF5、STAT4的單核苷酸多態性位點基因型來評估個體罹患紅斑狼瘡的風險性。
【專利說明】一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒，通過同時檢測與紅斑狼瘡關聯的基因HLA-DQAl、IRF5和STAT4的單核苷酸多態性位點基因型來評估個體罹患紅斑狼瘡的風險性。
【背景技術】
[0002]紅斑狼瘡(LE)是一種臨床上有多種表現、可累及全身多個組織器官的自身免疫性疾病。根據其臨床表現特點，組織病理，免疫學指標等將其定性為一種病譜性疾病,分為三個亞型:(1)盤狀紅斑狼瘡(DLE)，(2)亞急性皮膚性紅斑狼瘡(SCLE)，(3)系統性紅斑狼瘡(SLE).部分SCLE可以發展成SLE，而DLE —般不發展為SLEfJJ。系統性紅斑狼瘡臨床表現最重，累計多個臟器，對生活質量的影響最重。
[0003]自1882年Biett最早描述系統性紅斑狼瘡至今，其病因發病機制尚未完全明確，但有大量證據表明機體的遺傳因素在該病的易感性及其表達方面有著重大的作用。如同卵雙生子患者中，共同患病達65%，明顯高于異卵雙生子的共同患病率9 %，所有患者中，4%具有家族性。在美國，黑人SLE的發病率是白人的3倍，但非洲黑人的發病率并不高。在我國，SLE的發病率也明顯高于其他東方國家與西方人，由此可見，SLE具有家族遺傳性和種族遺傳性。
[0004]目前，涉及紅斑狼瘡的一些基因，已經很好的進行研究。其作用機制、生化功能、信號通路、調控、轉錄等等方面有明確可靠的研究結果；研究手段、方法、儀器設備和試劑都已經發展到了一個相當高的程度。目前，經證實并且機理研究清楚的與紅斑狼瘡密切相關的基因有HLA-DQAl基因、IRF5基因和STAT4基因。
[0005]自1995年潘星華等首次報告中國漢人SLE易感性與HLA_DQA1*0101、HLA-DQAI*0401相關，HLA_DQA1*0501和HLA_DQA1*0601有遺傳抵抗作用以來，中國大陸已有7項獨立研究探討了 SLE與HLA-DQAl基因的關聯性。后又有研究人員通過Meta分析增大了樣本量，納入447例SLE患者和503例正常劉照，定量綜合中國大陸人群多個研究結果，得出量化的平均效果和聯系，增加了結論的把握度，解決了研究結果的不一致性。
[0006]據研究顯示，HLA-DQA1*0301是中國大陸人群SLE保護基因。HLA-1I類分子在抗原處理和遞呈中具有重要作用，人們推測不同HLA-DR基因可能因其基因型別不同，與抗原肽結合的結合槽或與CD4T細胞結合部位的氨基酸殘基不同，這種氨基酸的理化性質變化可導致其結合能力的變化，從而影響免疫反應，決定了對SLE的易感性差異。
[0007]HLA II類基因是人類基因組最具多態性的區域，同一基因位點具有多個等位基因，并且隨著研究的深入，越來越多的基因亞型被發現和鑒定。HLA*DQA1與疾病的關聯研究，也越來越深入和細致。
[0008]在HLA-1I類基因位點中，以研究DR、DQ與SLE相關性為多，也已表明SLE與HLA-D區多態性基因相關，而且不同種族和地區的SLE與HLA的關聯不同。20世紀90年代，Skarsvag 等發現北歐白人 SLE 與 HLA_DRB1*03、_DRB1*0101、DQA1*0501、DQB1*0201 關聯。Coward 等的研究表明丹麥人 SLE 與 HLA_DRBl*03/06、_DR3*01/03、DQA1*0501、DQB1*0201相關。Dong 等人發現日本人 SLE 與 HLA-DRB1*1501、-DRB5*0101、DQA1* 0102、DQB1*0602單倍型相關。Doherty等1992年應用PCR-SSO技術對源于中國南方的馬來西亞華裔SLE患者的研究揭示了與HLA-DR15 (DR2)、DQ1相關，但未見與任何DQA1、DQBl等位基因關聯，認為SLE易感基因可能在DR位點近端。
[0009]由IRF5介導誘導IFN- a、IFN- ^及一些細胞因子(IL_6、TNF等)表達，激活IFN下游靶基因。IRF5表達增高后，從而激活特異性的獲得性免疫，誘導產生自身抗體，引起病理損傷。
[0010]IRF5還參與了細胞凋亡過程。IRF5信號轉導途徑的下游蛋白質包括Bax、胱天蛋白酶_8、胱天蛋白酶-3和Fas結合 死亡域蛋白質/胱天蛋白酶-8,活化的IRF5激活胱天蛋白酶級聯反應，使線粒體釋放細胞色素C，改變線粒體膜電位，改變細胞膜的對稱結構，導致DNA斷裂和細胞凋亡。
[0011]信號傳導和轉錄激活子4 (STAT4)基因位于人類染色體2q32.2^32.3是信號轉導和轉錄活化因子家族成員之一，其表達主要分布于淋巴細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞中。3丁八14可以被白細胞介素(10-12、IL-23以及I型干擾素等一些重要細胞因子所誘導。STAT4存于胞質中，經細胞因子激活而磷酸化的STAT4轉入并積累于細胞核中，進而刺激其他特異基因的轉錄，例如作為T細胞分化為Thl細胞的重要指標物的干擾素(IFN)-Y。由此可見，IL-12介導的STAT4依賴性信號通路在Thl型T淋巴細胞生成過程中起了關鍵的作用。此外，也發現STAT4與Thl7這一新定義的⑶4*T淋巴細胞譜系成員的分化有關。促炎癥反應的Thl7細胞部分依賴于與IL-12相關的細胞因子IL-23的活性，進而在一定程度上引起慢性炎癥紊亂。與此同時，IFN-Y的生產有抑制Thl7分化通路的趨勢。總而言之，STAT4在自身免疫系統中起著至關重要的作用。
【發明內容】
[0012]基于HLA-DQAl基因、IRF5基因、STAT4基因上的3個SNPs位點多態性可用來評估個體罹患紅斑狼瘡風險性的基礎上，本發明提供一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒。
[0013]試劑盒包括:
檢測HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；
檢測IRF5基因上rs2004640號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測STAT4基因上rs7574865號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；
熒光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩沖液、去離子水
[0014]本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含這三個SNPs位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID N0:1和2、3和4、5和6所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限于這三對引物。
[0015]本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是指針對HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這三個SNPs位點基因型的Taqman探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID N0:7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探針對。特異性熒光探針對可用常規的探針合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性熒光Taqman探針對不限于這三對探針，所有可用于熒光定量PCR法檢測本發明中所述用來評估個體罹患紅斑狼瘡風險性的三個SNPs位點的探針均在本發明范圍內。
[0016]本發明試劑盒的組分和含量包括:
5W 10 X熒光定量PCR反應緩沖液，
0.5m 25mM dNTP 混合液，
3m 25mM MgCl2 溶液，
0.125m (5unitsM) Taq DNA 聚合酶，
20剛特異性引物對每條引物各0.225^1,
10剛特異性熒光探針對每條探針各0.25^1,
去尚子水26.625M-1 o
[0017]本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
`[0018]
【具體實施方式】:
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照廠商所建議的條件。
[0019]
實施例1.檢測試劑盒的使用 步驟1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人體外周血，提取血液中的基因組DNA。
[0020]步驟2:熒光定量PCR反應
使用可檢測紅斑狼瘡易感基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，包含下列引物對和熒光探針對:
有義引物 1:5，- CACGTAATATAAATG - 3，(SEQ ID NO:1)
反義引物 1:5’ - CCTAATTCCAAAGCC - 3’ (SEQ ID NO:2)
有義引物 2:5’- GCTGCGCCTGGAAAG - 3，(SEQ ID NO:3)
反義引物 2:5’- CGGGCGCACCCTGCT - 3，(SEQ ID NO:4)
有義引物 3:5’- TATGAAAAGTTGGTG - 3，(SEQ ID NO:5)
反義引物 3:5’- CCACTGAAATAAGAT - 3’ (SEQ ID NO:6)
帶 VIC 熒光基團探針 1:5，- CAAAAGaAGGGT -3，(SEQ ID NO:7)
帶 FAM 熒光基團探針 1:5’ - CAAAAGgAGGGT -3’ (SEQ ID NO:8)
帶 VIC 熒光基團探針 2:5’ - CTCGGGgGGGTG -3，(SEQ ID NO:9)
帶 FAM 熒光基團探針 2:5’ - CTCGGGtGGGTG -3’ (SEQ ID NO:10)帶 VIC 熒光基團探針 2:5’ - AAATGTgAATAG -3，(SEQ ID NO:11)
帶 FAM 熒光基團探針 2:5，- AAATGTtAATAG-3’ (SEQ ID NO:12)
有義引物1，反義引物1、帶VIC熒光基團探針1、帶FAM熒光基團探針I特異地針對檢測HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點多態性；
有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團探針2、帶FAM熒光基團探針2特異地針對檢測IRF5基因上rs2004640號SNP位點多態性；
有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團探針3、帶FAM熒光基團探針3特異地針對檢測STAT4基因上rs7574865號SNP位點多態性；
3個SNPs位點分別進行3次獨立的熒光定量PCR反應，每個反應的體系為總體積IOW，包含濃度為20ng/W的DNA模板2W、1W 10 X熒光定量PCR反應緩沖液、0.1W 25mMdNTP 混合液、0.6W 25mM MgCl2 溶液、0.025W (5unitsM) Taq DNA 聚合酶、20剛的有義引物和反義引物各0.225W、10剛的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25W，去離子水
5.325)^1 o
[0021]在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進行60個循環的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應結束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取
樣品突光量。
[0022]步驟3 =SNP基因型分析
熟悉熒光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的
基因型。
[0023]實施例2.對患者進行紅斑狼瘡易感基因檢測的服務 步驟1:DNA提取
由醫院檢驗科醫師對被檢者進行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因組DNA。
[0024]步驟2:基因分型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對被檢者基因組DNA的HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點分別進行熒光定量PCR檢測，確定這兩個SNPs位點的基因型。
[0025]步驟3:個體罹患紅斑狼瘡風險性的分析
通過對被檢測者SNPs基因型的分析， 出具罹患紅斑狼瘡風險性的分析報告單。報告中詳細說明了被檢測者罹患紅斑狼瘡風險性的高低，并由醫師向被檢測者詳細說明和解讀罹患紅斑狼瘡風險性的分析報告單。
【權利要求】
1.一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒，其特征在于:包括同時檢測HLA-DQAl基因上rs9271366 號 SNP 位點、IRF5 基因上 rs2004640 號 SNP 位點、STAT4 基因上 rs7574865 號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對HLA-DQAl 基因上 rs9271366 號 SNP 位點、IRF5 基因上 rs2004640 號 SNP 位點、STAT4 基因上rs7574865號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性熒光探針對是指針對HLA-DQAl 基因上 rs9271366 號 SNP 位點、IRF5 基因上 rs2004640 號 SNP 位點、STAT4 基因上rs7574865號SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這3個SNPs位點基因型的Taqman探針對。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO:1和2、3和4、5和6所示序列的引物對。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所含的特異性熒光探針選自具有SEQID NO:7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探針對。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒的組分和含量包括10X熒光定量 PCR 反應緩沖液、0.5Pl 25mM dNTP 混合液、3Pl 25mM MgCl2 溶液、0.125W (5unitsM)Taq DNA聚合酶、20剛特異性引物對每條引物各0.225W、10剛特異性熒光探針對每條探針各0.25沿、去離子水26.625W，`本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【文檔編號】G01N21/64GK103667434SQ201210360001
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月25日 優先權日:2012年9月25日
【發明者】任峻, 張華忠 申請人:浙江愛易生物醫學科技有限公司