專利名稱：25-羥基維生素d3檢測試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測人體內(nèi)25-羥基維生素D3含量的試劑盒及其制備方法，本發(fā)明還涉及該25-羥基維生素D3測定試劑盒在檢測人體內(nèi)25-羥基維生素D3含量的使用方法，屬于25-羥基維生素D3含量的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
25-羥基維生素D3是人體內(nèi)存儲維生素D的主要形式之一，它是人體正常代謝活動(dòng)不可或缺的物質(zhì)之一?？傮w而言，全球三分之二的人缺乏維生素D，其中，在兒童、老人和孕婦中更容易出現(xiàn)維生素D缺乏的現(xiàn)象。體內(nèi)維生素D的缺乏，使兒童患佝僂病和老人患骨質(zhì)疏松癥的可能性大大增加。近年來大量研究表明，維生素D的缺乏直接影響到人體內(nèi)腫瘤的發(fā)生，特別是結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌；目前，維生素D的缺乏已被證實(shí)為判別腺癌發(fā)生的重要標(biāo)志物，在臨床診斷上將成為一項(xiàng)重要的指標(biāo)。此外，維生素D的缺乏還與自身免疫性疾病、感染性疾病和心血管疾病等的發(fā)生有著密切的關(guān)系。目前，臨床上對維生素D的定量檢測已成為常規(guī)檢測項(xiàng)目和體檢項(xiàng)目。為此，建立一種快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確可靠的檢測維生素D水平的方法尤為重要。近幾年來，25-羥基維生素D3的定量檢測主要有理化檢驗(yàn)方法和免疫學(xué)方法。理化檢驗(yàn)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)；免疫學(xué)方法主要有放射免疫法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的檢測方法雖然靈敏度高，但是存在儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣、檢測時(shí)間長等諸多弊端。放射免疫法雖然存在操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢，但是同樣存在著輻射污染以及穩(wěn)定性差等方面的缺陷。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)雖然準(zhǔn)確、靈敏度高，但是存在操作要求嚴(yán)格且費(fèi)時(shí)等缺陷，不適用于急診和臨床病人及時(shí)診斷和治療的需要。迄今為止，尚缺乏一種操作簡單快速、定量準(zhǔn)確、敏感度高或特異性強(qiáng)的用于檢測人體內(nèi)25-羥基維生素D3含量的試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種25-羥基維生素D3檢測試劑盒；本發(fā)明的目的之二是提供一種制備所述25-羥基維生素D3檢測試劑盒的方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種檢測25-羥基維生素D3含量的試劑盒，由彼此獨(dú)立的試劑I和試劑II組成；其中，試劑I的組分包括25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性齊U、促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和水；試劑II的組分包括包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合齊U、表面活性劑、助懸劑、防腐齊U、封閉齊U、穩(wěn)定劑和水。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，試劑I或試劑II中各組分的用量對于檢測的準(zhǔn)確度、靈敏度及特異性均有著非常顯著的影響；本發(fā)明通過大量的優(yōu)選試驗(yàn)最終篩選到了試劑I或試劑II中各組分的最佳用量，采用下述這些優(yōu)選的用量能夠有效提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度、靈敏度及特異性每I升試劑I中各組分的用量優(yōu)選為25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物0. 05_50mg，生物緩沖劑l-100g，螯合劑0. l-10g，表面活性劑0. l_5mL，防腐劑0. l_10g，穩(wěn)定劑l_50g，促凝劑l_50g，余量為水；進(jìn)一步優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為25_羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物0. l-30mg,生物緩沖劑5-50g，螯合劑0. 5_5g，表面活性劑0. 5_4mL，防腐劑0. 5_5g，穩(wěn)定劑10-40g，促凝劑10-40g，余量為水；更進(jìn)一步優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為25_羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物0. 5-20mg,生物緩沖劑10_20g，螯合劑0. 7_2g，表面活性劑0. 7_2mL，防腐劑0. 6-1. 5g，穩(wěn)定劑15-30g，促凝劑12-30g，余量為水；最優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物5mg，生物緩沖劑12g，螯合劑lg，表面活性劑0. 5mL，防腐劑lg，穩(wěn)定劑20g，促凝劑15g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量優(yōu)選為包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒0. l-10g，生物緩沖劑l-100g，螯合劑0. l-10g，表面活性劑0. 1-lOmL，防腐劑0. l_10g，助懸劑5-50mL，封閉劑5-50g，穩(wěn)定劑50_150g，余量為水。進(jìn)一步優(yōu)選的，每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒0. 5-5g，生物緩沖劑5-40g，螯合劑0. 5-5g，表面活性劑l_7mL，防腐劑0. 5_5g，助懸劑10-40mL，封閉劑6-30g，穩(wěn)定劑80_140g，余量為水。更進(jìn)一步優(yōu)選的，每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒0. 8-3g，生物緩沖劑8-15g，螯合劑l-3g，表面活性劑l_4mL，防腐劑0. 7_2g，助懸劑15-30mL，封閉劑8-15g，穩(wěn)定劑90_120g，余量為水。最優(yōu)選的，每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D 3抗體膠乳顆粒1. 8g，生物緩沖劑10. 5g，螯合劑2g，表面活性劑3mL，防腐劑lg，助懸劑20mL，封閉劑10g，穩(wěn)定劑100g，余量為水。為了實(shí)現(xiàn)更好的檢測效果，試劑I的pH值的范圍優(yōu)選為7. 0-8.0，試劑II的pH值的范圍優(yōu)選為6. 5-7.5。本發(fā)明試劑II中所述的“包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆?！笔窃诹姿猁}緩沖液中將25-羥基維生素D3抗體通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)等方法結(jié)合到羧化改性聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，再經(jīng)過離心、洗滌后所得；其中，所述的25-羥基維生素D3抗體可以是25-羥基維生素D3單克隆抗體或多克隆抗體?？梢酝ㄟ^物理吸附或化學(xué)交聯(lián)的方法將25-羥基維生素D3抗體結(jié)合聚苯乙烯膠乳顆粒的表面。物理吸附的抗體在長時(shí)間放置后，抗體蛋白容易解吸附，導(dǎo)致檢測靈敏度降低，重復(fù)性較差。本發(fā)明優(yōu)選采用通過化學(xué)交聯(lián)的方法將25-羥基維生素D3抗體結(jié)合到羧化改性聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，這樣能夠使結(jié)合的抗體更加穩(wěn)定。優(yōu)選的，一種制備包被25-羥基維生素D3單克隆抗體或多克隆抗體膠乳顆粒的方法，包括以下步驟①將聚苯乙烯膠乳顆粒用磷酸鹽緩沖液分散，再加入6-氨基己酸溶液和1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，攪拌均勻后，離心棄上清；再用磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳得到羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液；②將25-羥基維生素D3單克隆抗體或多克隆抗體凍干品用去離子水溶解，制成抗體溶液；③取抗體溶液，用磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入步驟①所制備的羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液，再加入EDC，在0-4°C攪拌反應(yīng)，加入甘氨酸緩沖液攪拌，終止反應(yīng)，離心棄上清，用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀，得到包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒。試劑I或試劑II中所述的生物緩沖劑主要是起到中和酸堿的作用，所以能夠起到中和酸堿作用的各種緩沖劑均能夠適用于本發(fā)明的生物緩沖劑，例如可以是三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -2-乙烷磺酸(HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1,4-二羥基丙磺酸(P0PS0)、3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)等各種常用生物緩沖液，為了達(dá)到更好的檢測效果，試劑I中所述的生物緩沖劑優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷，試劑II中所述的生物緩沖劑優(yōu)選為3- (N-嗎啉)丙磺酸。試劑I或試劑II中所述的螯合劑所起到的作用是絡(luò)合檢測樣本中的金屬離子，以減少金屬離子造成的干擾；因此，能夠絡(luò)合金屬離子的各種螯合劑均能夠作為本發(fā)明試劑盒中的螯合劑，例如乙二胺四乙酸二鈉，氨基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸及其鹽等均可作為本發(fā)明試劑盒中的螯合劑；為了達(dá)到更好的檢測效果，本發(fā)明優(yōu)選乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)作為試劑I和試劑II中的螯合劑。試劑I或試劑II中所述的防腐劑主要是為了防止細(xì)菌滋生導(dǎo)致的產(chǎn)品變質(zhì)，所以任何一種能起到防止細(xì)菌滋生作用的防腐劑均能適用于本發(fā)明；為了達(dá)到更好的檢測效果，優(yōu)選的，本發(fā)明試劑I和試劑II中所述的防腐劑為疊氮化鈉。試劑I或試劑II中所述的表面活性劑主要起到促進(jìn)試劑體系中各組分以及檢測樣本中各物質(zhì)的溶解，達(dá)到減少樣本濁度對測定結(jié)果的影響的作用；因此，現(xiàn)有的具有增溶性質(zhì)的表面活性劑都可作為試劑I或試劑II中所述的表面活性劑，例如，吐溫20、吐溫40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等均可作為本發(fā)明試劑盒中的螯合劑。為了達(dá)到更好的效果，試劑I中所述的表面活性劑優(yōu)選為曲拉通X-100。試劑II中優(yōu)選將曲拉通X-100和吐溫20組合在一起使用作為表面活性劑，其中，每I升試劑II中曲拉通x-100的用量為0. 05 2. 5mL,優(yōu)選為0. 15 2mL，再次優(yōu)選為0. 5-lmL,最優(yōu)選為0. 5mL ;每I升試劑II中吐溫20的用量為0. 5 5mL，優(yōu)選為I 4mL，再次優(yōu)選為2-3mL，最優(yōu)選為2. 5mL。試劑I或試劑II中所述的穩(wěn)定劑主要作用是保持試劑盒中各組分的穩(wěn)定性，延長產(chǎn)品的貨架壽命。常用的穩(wěn)定劑為不含蛋白的純化學(xué)物質(zhì)，如氯化鈉、氯化鉀、蔗糖等純化學(xué)物質(zhì)，本發(fā)明中的試劑I和試劑II中的穩(wěn)定劑優(yōu)選為蔗糖。試劑I中所述的促凝劑是為了促進(jìn)血液樣本中干擾物質(zhì)的快速凝集，減少對檢測結(jié)果的干擾，檢測試劑盒中常用的促凝劑常用的為聚乙二醇6000或聚乙二醇8000，本發(fā)明的檢測試劑盒中這兩種成分均可以選用。試劑II中所述的助懸劑的主要作用是維持體系中各物質(zhì)的均勻分布，減少試劑不均勻而導(dǎo)致的測定結(jié)果誤差，常用的助懸劑有乙二醇、丙三醇、乳糖和麥芽糖等，本發(fā)明試劑II中的助懸劑優(yōu)選為乙二醇。試劑II中所述的封閉劑的主要作用是為了避免非特異性反應(yīng)的發(fā)生，減少檢測過程中的假陽性干擾，本發(fā)明試劑II中的封閉劑選自牛血清白蛋白(BSA)。本發(fā)明檢測試劑盒中所用到的每種組分均能通過商業(yè)途徑從生物試劑公司或醫(yī)藥公司購買得到。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種制備所述檢測25-羥基維生素D3試劑盒的方法，包括(I)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；(2)制備試劑I1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；(3)將試劑I和試劑II單獨(dú)分裝，密封，即得。本發(fā)明的又一目的是提供所述25-羥基維生素D3檢測試劑盒檢測樣品中25-羥基維生素D3含量的檢測方法，該方法包括以下步驟向L待檢測樣本(校準(zhǔn)管以校準(zhǔn)品做樣品，空白以蒸餾水為樣品)中加入125 u L的試劑I充分混勻，于37°C恒溫5分鐘，再向混合體系中加入25 y L試劑II，混勻，37°C恒溫I分鐘后，空白管調(diào)零，波長570nm，測定各管吸光度Al，5分鐘后測定各管吸光度A2。計(jì)算AA = A1-A2。根據(jù)多點(diǎn)校準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)吸光度變化值A(chǔ)A，采用多點(diǎn)非線性校準(zhǔn)模式確定工作曲線，樣本吸光度變化在工作曲線上相對應(yīng)的濃度值即為測定濃度。本發(fā)明檢測試劑盒采用雙試劑模式有效地避免了非特異性反應(yīng)的干擾，保證了測定結(jié)果的穩(wěn)定可靠。該檢測試劑盒采用膠乳免疫比濁法作為檢測原理，具有操作簡單、快速、定量準(zhǔn)確、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可滿足門急診等檢測的需要，在臨床上有著越來越廣泛的用途。
圖1是5-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
圖2是本發(fā)明試劑盒與酶聯(lián)免疫分析法測值的相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。預(yù)備實(shí)施例1 25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物的制備①稱取2. Omg的25-羥基維生素D3-半琥珀酸酯(購于上海漢尊生物公司)、0. Smg的1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和2. Omg的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入裝有ImL無水三氯甲烷的圓底燒瓶中，后在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)2h;②反應(yīng)終止后，向圓底燒瓶中加入ImL 3mg/mL BSA溶液,于室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)過夜；③上述反應(yīng)液用0. 01mol/L pH 7. 2的PBS 4°C透析48小時(shí)，中間換液6次，每隔8小時(shí)換液I次,收集透析物，用葡聚糖凝膠HiTrap Desalting過柱脫鹽純化2次,真空冷凍干燥，即制得25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物25-羥基維生素D3-半琥珀酸酯-BSA。預(yù)備實(shí)施例2 25-羥基維生素D3多克隆抗體的制備
①用25-羥基維生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫3月齡，體重1. 5kg的雄性日本大耳白兔，首次免疫用無菌的PBS溶液溶解25-羥基維生素D3-半琥珀酸酯-BSA并與等量的弗氏完全佐劑(FCA)混合充分乳化，免疫劑用量為Img (0. 5mL) /只，于背部皮下分4_6個(gè)部位注射；②首次免疫2周后，同樣用無菌的PBS溶液溶解25-羥基維生素D3-半琥珀酸酯-BSA并與等量的不完全佐劑(FIA)混合充分乳化免疫兔子，免疫劑量為500 Ug (0. 5mL)/只，注射部位同前。③所有的兔子共免疫6次，每次間隔2周，第4次免疫后采用間接ELSIA和間接競爭ELSIA測定兔抗血清效價(jià)和特異性，第6次免疫通過腹腔注射加強(qiáng)免疫，最后一次免疫7天后，心臟采血，得到大量的兔抗血清。將兔多抗血清經(jīng)過親和層析柱分離純化即可得到25-羥基維生素D3多克隆抗體。預(yù)備實(shí)施例3包被25-羥基維生素D3多克隆抗體膠乳顆粒的制備①稱取1. Og聚苯乙烯膠乳顆粒(購自PolyMicrospheres公司)干燥物,加入IOOmL0. 12M磷酸鹽緩沖液(pH 7. 5)分散，再加入20mL的0. OlM的6-氨基己酸溶液及40mg1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，在室溫下攪拌3小時(shí)，離心棄上清，用0. 12M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，制成接有氨基己酸手臂的羧化聚苯乙烯膠乳，再用IOOmL 0. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳得到羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液；②將250 u g 25-羥基維生素D3多克隆抗體凍干品用0. 5mL去離子水溶解，得到抗體溶液；③將步驟②所制的抗體溶液用25mL 0. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入25mL步驟①所制的膠乳溶液，再加入IOmg EDC，在5°C攪拌反應(yīng)8小時(shí)，加入ImL 0. 15M甘氨酸緩沖液攪拌40分鐘，終止反應(yīng)，離心棄上清，用0. 12M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，得到包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒。實(shí)施例1 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥曱基氨基甲烷(Tris)20g
乙二胺四乙酸二納(EDTA-2Na)2g
曲拉通X-100ImL
疊氮化鈉1.5g
蔗糖2 Sg
聚乙二醇6000IOg
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物6mg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備
按所述用量取各組分
3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )15g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)I 5g
曲拉通X-100ImL
吐溫20ImL 疊氮化鈉2g
乙二醇2 SraL
牛血清白蛋白(BSA)12g
庶糖80g
包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒2. Og將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實(shí)施例2 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基氨基曱烷(Tris)12g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)Ig
曲拉通 X-1000. SmL
疊氮化鈉Ig
蔗糖2 Og
聚乙二醇6000ISg
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物Smg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )10 Sg
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)2g
曲拉通 X-1000. 5mL
吐溫 202. 5mL
疊氮化鈉Ig
乙二醇2 OmL
牛血清白蛋白(BSA)IUg
蔗糖IOOg
包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒1. 8g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實(shí)施例3 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三表;曱基氣基甲坑(Tris)18g
乙二胺四乙酸二納(EDTA-2Na)1. Sg
曲拉通 X-1000. 8mL
疊氮化鈉2g
蔗糖15g
聚乙二醇60002Og
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物7mg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。
2、試劑II的制備按所述用量取各組分3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)8g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)Ig
曲拉通 X-1001. SmL
吐溫20Imh
疊氮化鈉1. 5g
乙二醇30mL
牛血清白蛋白(BSA)2Og
蔗糖9 Og
包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒 2. 2g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實(shí)施例4 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三表甲基氣基曱燒(Tris)15g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)2g
曲拉通 X-1000, 7mL
疊氮化鈉I 8g
篇糖I Sg
聚乙二醇600019g
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物6mg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備
按所述用量取各組分3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )Ilg
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)I 8g
曲拉通X-1000.1mL
吐溫 202.1mL
疊氮化鈉1.2g
乙二醇22mL
牛血清白蛋白(BSA)18g 蔗糖7 Og 包被25-羥基維生素D3多克隆的抗體膠乳顆粒 2g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實(shí)施例5 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基氨基曱烷(Tris)30g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)Ig
曲拉通X-1UU3mL
疊氮化鈉2. 5g
蔗糖23g 聚乙二醇600021%
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物IOmg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )27g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)3g
曲拉通 X-1000. 6mL
吐溫203mL
疊氮化鈉2 Sg 乙二醇 3 OmL 牛血清白蛋白(BSA) 3Ug 蔗糖 120g
包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒 5g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實(shí)施例6 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基氨基曱烷(Tris)5 Og
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)3g
曲拉通X-1UU4mL
疊氮化納Sg
篇糖35g
聚乙二醇600040g
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物IOmg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )65g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)4g
曲拉通X-1002mL
吐溫203mL
疊氮化鈉Sg 乙二醇35mL 牛血清白蛋白(BSA) 2Og 蔗糖IOOg 包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒 3g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。 實(shí)施例7 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基氨基甲烷(Tris)IOOg
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)IOg
曲拉通X-1005mL
疊氮化鈉IOg 戾糖5 Og 聚乙二醇600050g
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物5Omg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )IOOg
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)IOg
曲拉通 X-1001. 5mL
吐溫 202. 5mL
疊氮化鈉IOg
乙二醇50mL 牛血清白蛋白(BSA) 5Og 蔗糖 HOg
包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒IOg
將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實(shí)施例8 25-羥基維生素D3檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備:按所述用量取各組分
三羥甲基氨基甲烷(Tris)Ig
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)0.1g
曲拉通 X-1000.1mL
疊氮化鈉0.1g
庶糖Ig
聚乙二醇6000Ig
25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物0. 05mg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分 3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )Ig 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2N I)0.1g 曲拉通 X-1000. 05mL 吐溫 200. 05mL 疊氮化鈉0.1g 乙二醇5mL 牛血清白蛋白(BSA) Sg 戾糖5 Og 包被25-羥基維生素D3多克隆抗體的膠乳顆粒0.1g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。試驗(yàn)例I本發(fā)明檢測試劑盒的線性范圍檢測試驗(yàn)1、供試試劑盒實(shí)施例1-8所制備的試劑盒配制5 u g/L，20 u g/L，40 u g/L，80 u g/L，100 u g/L 的 25-羥基維生素 D3 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用本發(fā)明實(shí)施例1-6所制備25-羥基維生素D3測定試劑盒，繪制其標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見圖1。本發(fā)明試劑盒檢測樣品中25-羥基維生素D3含量，包括以下步驟向L待檢測樣本(校準(zhǔn)管以校準(zhǔn)品做樣品，空白以蒸餾水為樣品)中加入125 y L的試劑I充分混勻，于37°C恒溫5分鐘，再向混合體系中加入25 y L試劑II，混勻，37°C恒溫I分鐘后，空白管調(diào)零，波長570nm，測定各管吸光度Al，5分鐘后測定各管吸光度A2。計(jì)算AA = A1_A2。以吸光度差值A(chǔ)A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，制作“濃度-吸光度差值”標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖1。試驗(yàn)例2本發(fā)明試劑盒準(zhǔn)確度及精確度檢測試驗(yàn)1、供試試劑盒實(shí)施例1-6所制備的試劑盒；2、試驗(yàn)方法及結(jié)果準(zhǔn)確度和精確度是反應(yīng)檢測試劑盒測量結(jié)果的準(zhǔn)確程度與可信程度。本試驗(yàn)以英國IDS公司的25-羥基維生素D校準(zhǔn)品作為測試對象，評價(jià)本發(fā)明檢測試劑盒的準(zhǔn)確度和精確度，試驗(yàn)結(jié)果見表I。表I本發(fā)明試劑盒準(zhǔn)確度及精確度檢測試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測25-羥基維生素D3含量的試劑盒，其特征在于由彼此獨(dú)立的試劑I和試劑II組成；其中，試劑I的組分包括25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物、生物緩沖劑、螯合劑、 表面活性劑、促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和水；試劑II的組分包括包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、助懸劑、防腐劑、封閉劑、穩(wěn)定劑和水。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為 25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物O. 05-50mg,生物緩沖劑l_100g，螯合劑O. l_10g，表面活性劑O. l_5mL，防腐劑O. l-10g，穩(wěn)定劑l_50g，促凝劑l_50g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒O. l-10g，生物緩沖劑l-100g，螯合劑O. l-10g，表面活性劑O. Ι-lOmL，防腐劑O. l_10g，助懸劑5_50mL， 封閉劑5-50g，穩(wěn)定劑50-150g，余量為水。
3.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為 25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物O. l-30mg,生物緩沖劑5_50g，螯合劑O. 5_5g，表面活性劑0.5-4mL,防腐劑 O. 5-5g，穩(wěn)定劑 10_80g，促凝劑 10_40g ；每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒O. 5-5g，生物緩沖劑5-40g，螯合劑O. 5-5g，表面活性劑O. 5-5mL,防腐劑O. 5_5g，助懸劑10_40mL，封閉劑 6-30g，穩(wěn)定劑 80-140g。
4.按照權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為 25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物O. 5-20mg,生物緩沖劑10_20g，螯合劑O. 7_2g，表面活性劑O. 7-2mL,防腐劑O. 6-1. 5g，穩(wěn)定劑15_30g，促凝劑12_30g ;優(yōu)選的，各組分的用量為 25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物5mg，生物緩沖劑12g，螯合劑lg，表面活性劑O. 5mL,防腐劑 lg，穩(wěn)定劑20g，促凝劑15g ；每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒O. 8-3g，生物緩沖劑8-15g，螯合劑l_3g，表面活性劑l-4mL，防腐劑O. 7_2g，助懸劑15_30mL，封閉劑 8_15g，穩(wěn)定劑90-120g ;優(yōu)選的，各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒1.8g，生物緩沖劑10. 5g，螯合劑2g，表面活性劑3mL，防腐劑lg，助懸劑20mL，封閉劑10g， 穩(wěn)定劑IOOgo
5.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒通過以下方法制備得到將25-羥基維生素D3抗體結(jié)合到聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，再經(jīng)過離心、洗滌，即得。
6.按照權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒通過以下方法制備得到①將聚苯乙烯膠乳顆粒用磷酸鹽緩沖液分散，再加入6-氨基己酸溶液和1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，攪拌均勻，離心棄上清；用磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳得到羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液；②將25-羥基維生素D3單克隆抗體或多克隆抗體用水溶解，制成抗體溶液；③取抗體溶液，用磷酸鹽緩沖液稀釋，加入步驟①所制備的羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液，再加入1_乙基_3_ (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，在0-4°C攪拌反應(yīng),加入甘氨酸緩沖液攪拌，終止反應(yīng)，離心棄上清，洗滌沉淀，即得。
7.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于試劑I中所述的生物緩沖劑為三羥甲基甲胺基乙磺酸，試劑II中所述的生物緩沖劑為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸或3-(N-嗎啉)丙磺酸中的一種或二者按任意比例組成的混合物。
8.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的螯合劑是乙二胺四乙酸二鈉；所述的表面活性劑選自吐溫20、吐溫40、曲拉通X-100中的一種或者兩種以上； 所述的防腐劑是疊氮化鈉；所述的穩(wěn)定劑選自氯化鈉、氯化鉀、蔗糖中的一種或兩種以上； 所述的促凝劑選自聚乙二醇6000或聚乙二醇8000 ;所述的助懸劑選自乙二醇、海藻糖、丙三醇、乳糖中的一種或兩種以上；所述的封閉劑是牛血清白蛋白。
9.按照權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于試劑I的pH值的范圍為7.0-8. O ;試劑II的pH值的范圍為6. 5-7. 5。
10.一種制備權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述試劑盒的方法,包括(1)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻；(2)制備試劑I1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻；(3)將試劑I和試劑II單獨(dú)分裝，密封，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測25-羥基維生素D3含量的試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。所述試劑盒由彼此獨(dú)立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成；其中，試劑Ⅰ的組分包括25-羥基維生素D3-BSA偶聯(lián)物、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和水；試劑Ⅱ的組分包括包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、助懸劑、防腐劑、封閉劑、穩(wěn)定劑和水。本發(fā)明試劑盒檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，定量準(zhǔn)確，線性范圍寬，尤其適用于25-羥基維生素D3含量極低樣品的檢測。此外，本發(fā)明試劑盒在檢測過程中不需對樣本進(jìn)行預(yù)稀釋，方便臨床使用，操作簡單、檢測成本低，適用于各種全自動(dòng)生化分析儀。
文檔編號G01N33/82GK102998468SQ20121035149
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者華權(quán)高, 沈鶴霄, 許可, 閆彩霞, 常向博, 舒芹, 余箭翔 申請人:武漢華美生物工程有限公司