專利名稱：一種基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接口的制作方法
技術領域：
本發明涉及毛細管電泳技術領域，特別涉及一種基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接口。
背景技術：
毛細管電泳是20世紀80年代發展起來的一種新興分離技術，其具有高效、快速、消耗量低等優點，已成為近年來分析化學最活躍的研究方向之一。從技術水平來說，毛細管電泳已經發展為不同的分離模式，從而滿足不同性質樣品在管內的最佳分離。常用的毛細管分離模式有毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳、膠束電動毛細管色譜、毛細管電色譜。毛 細管的進樣量在納升級，非常適用于微量生物樣品的分析，但同時也對檢測的靈敏度提出了更高的要求。雖然激光誘導熒光，質譜等檢測技術滿足了毛細管電泳檢測的要求，但是昂貴的儀器價格和復雜的檢測程序限制了它們的應用范圍。將具有獨特高催化效率的酶應用到毛細管電泳中放大檢測信號提高靈敏度，已得到越來越多的關注。酶催化反應在毛細管電泳中的應用可分為三種模式柱前、在柱、柱后酶反應。柱前酶反應模式中，游離酶和固定化酶放入樣品小管中，酶催化反應在樣品進入毛細管前發生，毛細管只用作分離通道。這種方法酶消耗量較大，尤其是采用游離酶，酶一次性使用不能回收，造成了試劑的浪費。在柱酶反應模式中，酶填充到毛細管中，酶反應和分離過程同時在毛細管中進行。自從 1992 年，Bao 等(Bao J. ；Regnier F. E. J. Chromatogr. 1992，608，217)首次將游離酶應用到毛細管電泳在柱酶反應體系中，在過去20年里涌現了大量關于各種在柱游離酶反應在毛細管電泳中應用的報道。此外，酶也可以固定在毛細管柱中。例如，Tang 等(Tang Z. M. ；Kang, J. ff. Anal. Chem. 2006,78,2514)米用離子鍵合技術固定血管緊張素轉換酶在毛細管入口端篩選治療高血壓和糖尿病的藥物。Wojcik等(ffojcik, R. ； Vannatta, M. ；Dovichi, N. J. Anal. Chem. 2010,82,1564)將喊性憐酸酶固定在第一根毛細管末端設計的二維毛細管電泳，簡化了樣品在兩維間的處理。但是由于毛細管內壁十分狹小，需要使用復雜的固定技術，并且這種在柱酶反應技術往往不能同時滿足酶反應和毛細管電泳分離的最佳條件，電泳時毛細管內產生的焦耳熱嚴重影響了酶的活性和穩定性。不穩定的酶反應產物(如化學發光檢測中使用的活性氧，電化學檢測中使用的自由基)，由于其反應后易分解喪失檢測活性不能采用以上兩種模式進行分析。同時，這兩種模式中酶反應有關的共反應劑和反應產物增加了毛細管電泳分離的負擔。柱后酶反應模式中，酶載入柱后反應池中，在毛細管出口端與底物反應立即產生檢測信號，避免了因不穩定產物和電泳過程產生的弊端。但這種模式多使用游離酶，由于分離和檢測步驟帶入雜質，酶溶液不能回收，大量游離酶的使用造成了不可避免的試劑浪費。為了進一步擴展酶催化檢測在毛細管電泳中的應用，設計了基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接口
發明內容
本發明的目的在于提供一種毛細管電泳柱后固定化酶檢測接口，解決了現有技術中顯著使用游離酶造成酶試劑浪費，酶穩定性差、活性低的問題。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的
基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接口，所述檢測接口包括檢測接口蓋、透明窗片和位于檢測接口蓋和透明窗片之間的密封墊片，所述密封墊片上設有鏤空的反應通道，所述檢測接口蓋與密封墊片之間設有蓋在所述反應通道上的固定化酶的膜，且檢測接口蓋設有分別與反應通道兩端相通的反應液入口和廢液出口，所述檢測接口上還設有與所述反應通道相通并用于插入毛細管的毛細管接口，所述毛細管接口位于反應通道的反應液入口端。 該檢測接口適用于柱后檢測，提高了酶的穩定性，同時降低酶在流動檢測體系的消耗。該檢測接口可用于各種毛細管電泳分離模式，包括毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳、膠束電動毛細管色譜、毛細管電色譜，同時也可與各種酶反應相關的檢測器聯用，如激光誘導熒光檢測器、紫外可見吸收光譜檢測器、電化學檢測器。優選的,所述反應通道容納的體積為2. 5 μ L 10 μ L。為了提高檢測的靈敏度，所述反應通道為條形，且兩端呈圓弧形，能有效減少液體積存。優選的，所述反應通道為高為O. 01 O. 05 Cm，長為I. 5 cnT3. O cm，寬為O. 10cm O. 15 cm。優選的，所述反應液入口與廢液出口之間的距離與反應通道長度一致，反應液入口與廢液出口的直徑為O. 05 cnTO. 10 Cm。優選的，所述檢測接口蓋的材料為聚四氟乙烯。優選的，所述密封墊片(2)為彈性材料。更優選的，所述彈性材料為硅膠或橡膠。優選的，所述透明窗片為透明無色有機玻璃。本發明中，固定化酶膜可以使用常規的酶固定化技術，如交聯法和結合法等，將水溶性酶或不溶于水的酶通過化學鍵連接到天然的或合成的高分子載體上，經化學方法處理后，固定于反應通道上方。優選為，固定化酶膜的制作過程如下將酶溶液滴加到醛基活化的UltraBind膜(長寬與檢測通道一致)上，酶上的氨基與UltraBind膜上的醛基形成可逆的Schiff堿，然后再滴加還原試劑使酶與UltraBind膜之間形成牢固的共價鍵，然后晾干后即可使用。本發明的有益效果(I)本發明的基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接口最大程度地降低了酶在流動檢測系統中的消耗，顯著增強酶的穩定性和活性，從而有效提高檢測靈敏度。(2)本發明設計的柱后固定化酶反應通道體積小，最低加入體積為2. 5 yL，無稀釋效應及死體積存在。酶反應一經發生就立即被檢測到，適用于不穩定酶反應產物的檢測。同時，柱后酶反應模式避免了柱前、在柱酶反應中焦耳熱及分離組分復雜對整個體系的影響。(3)本發明的毛細管電泳柱后固定化酶檢測接口裝置可用于毛細管電泳各種分離模式，包括毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳、膠束電動毛細管色譜、毛細管電色譜，同時也可與各種酶反應相關的檢測器聯用，如激光誘導熒光檢測器、紫外可見吸收光譜檢測器、電化學檢測器。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖I為本發明的毛細管電泳柱后固定化酶檢測接口的結構示意圖(I :檢測接口蓋，2 密封墊片，3 :透明窗片，4 :固定化酶的膜，5 :毛細管)。圖2為含本發明檢測接口的毛細管電色譜化學 發光裝置圖(6 :檢測接口，7 :微流注射泵，8 :鉬電極，9 :緩沖液蓄池，10 :廢液池，11 :光電倍增管，12 :暗盒)。圖3為本發明的檢測接口毛細管出口端酶催化的化學發光原理圖(HRP :辣根過氧化物酶；BPB :溴酚藍，I :檢測接口蓋，2 :密封墊片，3 :透明窗片，4 :固定化酶的膜，5 :毛細管)。圖4為本發明的檢測接口運用到毛細管電色譜化學發光中檢測甘氨酸的工作曲線。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。實施例I
基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接口，如附圖I所示，包括檢測接口蓋I、透明窗片3和位于檢測接口蓋和透明窗片之間的密封墊片2，檢測接口蓋I使用聚四氟乙烯最佳，密封墊片2上設有鏤空的反應通道，檢測接口蓋I與密封墊片2之間設有蓋在反應通道上的固定化酶的膜4，且檢測接口蓋I設有分別與反應通道兩端相通的反應液入口和廢液出口，在檢測接口上還設有與所述反應通道相通并用于插入毛細管5的毛細管接口，毛細管接口位于反應通道的反應液入口端。為了提高檢測的靈敏度，避免稀釋效應及死體積存在，反應通道設置為條形，并將條形兩端呈圓弧形，體積優選為2. 5 μ L"10 μ L,更優選為4. 5 μ L,反應通道高為O. 01cnTO.05 cm，長為I. 5 cnT3. O cm，寬為O. 10 cnTO. 15 cm。進一步，將檢測接口蓋I上的反應液入口與廢液出口之間的距離與反應通道的長度一致，反應液入口與廢液出口的直徑為
O.05 cnTO. 10 cm，優選為O. 08 cm。密封墊片具有將反應池封閉的作用，選用彈性材料密封效果更好，硅膠或橡膠制成的密封墊片最佳。透明窗片選用透光性的材料，優選為透明無色的有機玻璃。為了使檢測接口能夠配合現有的儀器使用，可以將檢測接口的大小設置與現有儀器匹配的尺寸。本實施例將檢測接口蓋I設置為長4. O cm，寬為2. 5 cm，厚度為O. 8cm ;透明窗片3的長為4. O cm,寬為2. 5 cm,厚度為O. 3 cm。實施例2
毛細管電色譜化學發光裝置，如圖2所示，將毛細管5與檢測接口的毛細管接口連接，以修飾了納米金的毛細管的毛細管電色譜柱為例，將長為60 cm,內徑為75 μ m的毛細管電色譜柱一端用火燒掉O. 5 cm的聚丙酰亞胺涂層，插入檢測接口反應通道，毛細管電色譜柱另一端放入緩沖液蓄池9中。然后將檢測接口 6置于光電倍增管11上方，并使透明窗片3的面與光電倍增管11檢測面接觸，再將檢測接口 6和光電倍增管11都置于密閉的暗盒12中，以避免外界光線的干擾。檢測接口 6的反應液入口與微流注射泵7連接；廢液出口與廢液池10連接，將緩沖液蓄池9與廢液池10之間放入鉬電極8，整個流通系統中用聚四氟乙烯管接通，內徑優選為O. 08 cm。電泳時通過鉬電極8在毛細管電色譜柱的兩端形成電壓，由于不同物質的帶電量不同，從而達到分離物質的效果。實施例3
毛細管電色譜化學發光裝置檢測甘氨酸
固定化酶紙膜制備方法如下將30 μ L濃度為5. O mg/mL辣根過氧化物酶溶液滴加到醛基活化的UltraBind膜(2. 7 cm X O. 20 cm)上，在濕潤的環境下室溫放置2h，然后滴加1.0 mg/mL NaCNBH3溶液，室溫下反應40 min后取出晾干。制作好的酶紙膜用雙面膠緊貼于聚四氟乙烯蓋內側中心。毛細管電色譜柱固定于酶紙膜下方，毛細管出口伸入反應通道
O.5 cm ;各部分通過螺絲緊緊固定在一起，形成一個約為4. 5 μ L的反應通道。檢測時，將光電倍增管的工作電壓設置為-800 V，微流注射泵以20 μ L/min的流速將含6. 2 μ M溴酚藍的磷酸緩沖液(12 mM,pH 9. O)導入到反應通道中，作為固定化酶反應的共反應劑。含O. 75 mM過氧化氫的磷酸緩沖液(5. O mM,pH 8. 5)作為毛細管分離緩沖液，盛入緩沖液蓄池9，通過12 KV的電壓差產生的電泳驅動力進入毛細管中。待化學發光信號基線穩定后，通過20 cm高度差的重力驅動進樣15 s完成毛細管進樣。在反應通道入口處，甘氨酸和含過氧化氫的磷酸緩沖液從毛細管柱中流出與共反應劑反應，在固定化辣根過氧化物酶的催化下產生化學發光信號，其檢測原理如附圖3所示。光信號一經發射就能立即被光電倍增管11捕捉到，并將其轉換為電信號。樣品預處理甘氨酸本身不能發生化學發光，檢測中采用乙二胺催化法使用#-(4-氨基丁基)-Λ/-乙基異魯米諾衍生甘氨酸，使甘氨酸分子帶上化學發光屬性基團。具體步驟為(I)將200 μ L O. 50 mM的N- (4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾加入到同體積的
O.50 mM的％ 二琥珀酰亞胺基碳酸酯溶液中，混合溶液經渦流混合后于室溫下反應2小時。(2)將100 μ L甲醇溶解的樣品與20 yL的O. 15Μ乙二胺甲醇溶液一起加入到步驟
(I)反應得到的溶液中，同樣經渦流混合后于室溫下再反應2小時，得檢測樣品。然后將檢測樣品用水稀釋10倍后按上述的方法重力進樣。在上述實驗方法和條件下，測定了濃度為O. 5 μ MU μ MUO μΜ、30 μΜ、50 μ Μ、100 μΜ和200 μ M的甘氨酸標準溶液，結果如圖4所示。結果表明，甘氨酸濃度在O. 5μ Μ^200 μ M范圍內與化學發光峰高呈良好的線性關系，擬合線性回歸方程為J (a. u.)=66.15 C (μ Μ) + 812.84 {if = O. 9921)，J代表化學發光強度，C代表甘氨酸的濃度，其檢測限(S/N=3)為O. 12 μ M0連續五次檢測50 μ M甘氨酸，甘氨酸的遷移時間和出峰強度的相對標準偏差分別為7. 5%和5. 4%，顯示了該方法良好的重復性。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明。
權利要求
1.基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述檢測接ロ包括檢測接ロ蓋(I)、透明窗片(3)和位于檢測接ロ蓋和透明窗片之間的密封墊片(2)，所述密封墊片上設有鏤空的反應通道，所述檢測接ロ蓋(I)與密封墊片(2)之間設有蓋在所述反應通道上的固定化酶的膜(4)，且檢測接ロ蓋(I)設有分別與反應通道兩端相通的反應液入口和廢液出口，所述檢測接ロ上還設有與所述反應通道相通并用于插入毛細管的毛細管接ロ，所述毛細管接ロ位于反應通道的反應液入口端。
2.根據權利要求I所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述反應通道容納的體積為2. 5 μ L^lO μし
3.根據權利要求I所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述反應通道為條形且兩端呈圓弧形。
4.根據權利要求3所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述反應通道為高為 O. 01 O. 05 Cm,長為 I. 5 cnT3. 0cm,寬為 O. 10 cnT O. 15 cm。
5.根據權利要求1-4任ー項所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在干所述反應液入口與廢液出口之間的距離與反應通道的長度相等，所述反應液入口與廢液出口的直徑為O. 05 cnTO. 10 cm。
6.根據權利要求I所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述檢測接ロ蓋(I)的材料為聚四氟こ烯。
7.根據權利要求I所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述密封墊片(2)為彈性材料。
8.根據權利要求7所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述彈性材料為硅膠或橡膠。
9.根據權利要求I所述基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述透明窗片(3)為透明無色有機玻璃。
全文摘要
本發明提供了一種基于固定化酶的毛細管電泳柱后檢測接口，包括檢測接口蓋、透明窗片和位于檢測接口蓋和透明窗片之間的密封墊片，所述密封墊片上設有鏤空的反應通道，所述檢測接口蓋與密封墊片之間設有蓋在所述反應通道上的固定化酶的膜，且檢測接口蓋設有分別與反應通道兩端相通的反應液入口和廢液出口，所述檢測接口上還設有與所述反應通道相通并用于插入毛細管的毛細管接口，所述毛細管接口位于反應通道的反應液入口，該檢測接口能顯著減少酶的用量，提高酶的穩定性和活性，能有效防止反應通道中死體積和稀釋效應的產生，提高檢測靈敏度，為固定化酶的毛細管電泳柱后檢測提供了一個理想的檢測接口，可用于酶催化反應的毛細管電泳柱后檢測。
文檔編號G01N27/447GK102866195SQ201210348410
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者付志鋒, 謝皓玥 申請人:西南大學