專利名稱：一種乳中堿性蛋白的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測乳中堿性蛋白含量的方法，特別涉及強化了牛奶堿性蛋白牛乳的檢測方法，屬于分析技術領域。
背景技術：
堿性蛋白是指等電點大于7的一類蛋白質。牛奶堿性蛋白(milk basic protein),在我國2009年被批準為新資源食品。牛奶堿性蛋白是以鮮牛乳為原料，經脫脂、過濾、濃縮、去除酪蛋白等酸性蛋白、陽離子層析、冷凍干燥等工藝制成的產品(衛生部公告2009年第 18 號)。美國 FDA 對牛奶喊性蛋白(bovine milk basic protein fraction, BMBPF)的生產工藝描述為將經巴氏滅菌的脫脂牛奶通過陽離子交換樹脂，去除酸性牛奶蛋白和乳糖，得到牛奶堿性蛋白，后使用氯化鈉將保留在樹脂上的牛奶堿性蛋白洗脫下來，洗脫液經過膜濃縮得到牛奶堿性蛋白固體，最后粉碎包裝成成品。牛奶堿性蛋白是一個混合物，是乳清蛋白中的一部分，主要成分為乳鐵蛋白、乳過氧化物酶等，該類物質的等電點大于7。目前檢測蛋白質的方法很多，例如微量凱氏定氮法、Folin-酚試劑法、考馬斯亮藍法、雙縮脲法、液相色譜以及毛細管電泳等方法。由于牛奶中含有大量的蛋白質，以上方法均無法測定牛乳堿性蛋白。檢索國內以及國際資料，也未發現相關檢測方法和檢測標準。
發明內容
本發明的目的是提供一種乳及乳制品中牛奶堿性蛋白的檢測方法。由于牛奶堿性蛋白本身含量非常低，無法準確檢測出，此外牛奶檢測堿性蛋白不需要經常測定，無實際意義。因此本方法主要用于牛奶中添加了牛奶堿性蛋白的產品。本發明的牛奶堿性蛋白的檢測方法，包括以下步驟I)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分離；2)牛奶堿性蛋白的吸附；3)牛奶堿性蛋白的分離收集；4)將步驟3)中獲得的牛奶堿性蛋白定量測定。上述步驟I中酪蛋白和脂肪的沉淀分離的方法包括直接離心分離、酸沉淀結合離心分離、乙腈沉淀并結合離心分離。本發明優選的分離方法為酸沉淀并結合離心的方法，優選的酸為三氯乙酸和鹽酸。優化的酸的PH的調節方為先用lmol/L酸調制牛奶pH為4. 6，離心轉速為10000r/20min。并用0. 5mol/L NaOH調節牛奶的pH到6. 5，并在轉速為10000r/15mino優選的離心管的容量為100mL。牛奶處理量根據檢測方法而改變，凱氏定氮優選的牛奶處理量為100g。上述步驟2選用的吸附柱為陽離子吸附柱，柱材料選用陽離子交換樹脂，其中優選的陽離子交換材料為CM sephrose FF (GE)、CM sephadex C50 (GE),更優選的材料為CMsephrose FF(GE)。吸附柱優選的直徑為16mm，吸附選用的緩沖液為0. 01mol/L磷酸緩沖液，pH6. 5。上述步驟3選用的將堿性蛋白從吸附柱中解脫的方式采用含鹽緩沖液，優選鹽為NaCl，鹽溶液的濃度為O. 5^1. Omol/L，優選的鹽濃度為I. Omol/L。收集蛋白的監測采用能夠檢測蛋白的在線裝置，優選為核酸蛋白檢測器，收集開始時間為當檢測到有蛋白物質流出立即開始進行收集，收集終止時間為當蛋白檢測儀不能檢測有蛋白物質流出為止，即監測值的波動小于檢出值。上述步驟4所選用的定量測定方法為微量凱氏定氮法、Folin-酚試劑法、考馬斯亮藍法、雙縮脲法、液相色譜以及毛細管電泳等方法。其中優選的定氮方式為微量凱氏定氮和液相色譜法。本發明包括以下各項I. 一種乳中牛奶堿性蛋白的檢測方法，所述方法包括以下步驟
I)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分離；2)牛奶堿性蛋白的吸附；3)牛奶堿性蛋白的分離收集；4)將步驟3)中獲得的牛奶堿性蛋白定量測定。2.權利要求I的方法，其中所述牛奶堿性蛋白是乳鐵蛋白。3.權利要求I或2的方法，其中所述酪蛋白和脂肪的沉淀分離包括直接離心分離、酸沉淀結合離心分離、乙腈沉淀并結合離心分離，優選的是酸沉淀結合離心的方法。4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述酸沉淀并結合離心的方法包括稱取乳，將pH調節為3_7,優選的是4-6,優選的是4. 5-5. 5,優選的是4. 6,靜置并尚心以去除酪蛋白，獲得第一上清液，將第一上清液調節PH為5-8，優選地6-7，優選地6. 5，接著進行離心得到第二上清液。5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述吸附通過吸附柱進行，所述吸附柱為人工填充柱或購買的預裝柱，所述吸附柱的柱材料選用陽離子交換樹脂，其中優選的陽離子交換樹脂為 CM sephrose FF> CM sephadex C50,更優選的是 CM sephrose FF。6.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述吸附選用的緩沖液的pH為6. 2-6. 8，優選地6. 5，濃度為0. 01-0. 03mol/L，優選地0. 01mol/L，其中所述緩沖液優選的是磷酸緩沖液。7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述分離收集采用含鹽緩沖液洗脫來進行，其中收集蛋白的監測采用能夠檢測蛋白的在線裝置，優選為核酸蛋白檢測器進行，收集開始時間為當檢測到有蛋白物質流出，收集終止時間為當蛋白檢測儀不能檢測有蛋白物質流出，即監測值的波動小于檢出值。8.權利要求7的方法，其中所述含鹽緩沖液的鹽濃度為0. 5-1. 0mol/L,優選地lmol/L。9.權利要求1-8中任一項的方法，其中所述定量測定通過微量凱氏定氮法、Folin-酚試劑法、考馬斯亮藍法、雙縮脲法、液相色譜法或毛細管電泳，優選微量凱氏定氮或液相色譜法進行。10.權利要求9的方法，其中所述液相色譜法以乳鐵蛋白為標準品，通過將液相獲得圖譜所有的峰面積與乳鐵蛋白標準峰比較進行定量。
此外，本發明包括以下各項I. 一種添加牛奶堿性蛋白的牛奶中堿性蛋白的檢測方法，所述方法包括以下步驟I)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分離2)牛奶堿性蛋白的吸附3)牛奶堿性蛋白的分離收集4)將步驟3)中獲得牛奶堿性蛋白的定量測定2.項I的方法，其中酪蛋白和脂肪的沉淀分離的方法包括直接離心分離、酸沉淀結合離心分離、乙腈沉淀并結合離心分離。本發明優選的分離方法為酸沉淀并結合離心的 方法，優選的酸為三氯乙酸和鹽酸。3.項I的方法，其中所述吸附柱可以為人工填和購買預裝柱，柱材料選用陽離子交換樹脂，其中優選的陽離子交換材料為CM sephrose FF> CM sephadex C50,更優選的材料為 CM sephrose FF。4.項3的方法，其中人工填充柱的柱直徑為16mm，吸附選用的緩沖液為ρΗ6· 2-6. 8，優選為ρΗ6· 5磷酸緩沖液，其為濃度O. 01 O. 03mol/L，優選為O. 01mol/L。5.項I的方法，其中牛奶堿性蛋白的分離收集采用含鹽緩沖液，鹽溶液的濃度為O. 5-1. Omol/L,優選鹽為NaCL，優選的鹽濃度為lmol/L。6.項I的方法，其中所述蛋白定量方法包括微量凱氏定氮法、Folin-酚試劑法、考馬斯亮藍法、雙縮脲法、液相色譜以及毛細管電泳等方法。其中優選的定氮方式為微量凱氏定氮和液相色譜法。
具體實施例方式本發明提供了牛奶堿性蛋白的檢測方法。其中檢測物中含牛奶堿性蛋白為8-30mg/100go牛奶堿性蛋白為新西蘭tatua公司提供。如無特殊說明，本說明書中的科技術語的含義與本領域技術人員一般理解的含義相同，但如有沖突，則以本說明書中的定義為準。所述牛奶，可以是全脂、半脫脂或脫脂牛奶，還可以是用奶粉、奶油、乳清粉或牛奶的其它組分配制而成的還原奶。例如，所述牛奶優選為原奶。本發明中，對牛奶的來源、生產條件等沒有限制。本發明所述的乳是指任何形式的乳及乳制品，如牛乳、羊乳、馬乳或等同的乳粉，乳清蛋白粉，最佳選擇是牛乳，其中該乳中添加有牛奶堿性蛋白。如無特殊說明，本說明書中的重量份是相對于100重量份最終得到的液體乳制品產品而言的，本說明書中的百分比(%)均為重量百分比。在說明書和權利要求書中使用的涉及組分量、工藝條件等的所有數值在所有情形中均應理解被“約”修飾。涉及相同組分或性質的所有范圍均包括端點，該端點可獨立地組合。由于這些范圍是連續的，因此它們包括在最小值與最大值之間的每一數值。還應理解的是，本申請引用的任何數值范圍預期包括該范圍內的所有子范圍。實施例本實施例所指添加牛奶堿性蛋白的牛奶是在UHT后，加入了 10mg/100g牛奶堿性蛋白的牛奶。實施例I :微量凱氏定氮進行牛奶堿性蛋白測定I)添加牛奶堿性蛋白的牛奶中酪蛋白及脂肪的沉淀分離精確稱取添加牛奶堿性蛋白的牛奶100. 00g，用lmol/L HCl調節pH為4. 6，靜置30min，離心(10000r/20min)去除酪蛋白，獲得上清液，上清液用O. 5mol/L NaOH調節pH為6. 5,離心(10000r/15min),上清液備用，離心管選用100mL。2)牛奶堿性蛋白的吸附取陽離子交換樹脂20ml 25mL CM sephrose FF,裝入16x 400mm的柱,用減壓法除去樹脂中存留的氣泡，使得層析柱材料分布均勻。然后用四倍柱體積0. Olmol/L磷酸緩沖液(pH 6. 5)平衡，使核酸蛋白檢測的基線趨于穩定(其中使用的核酸蛋白檢測器的型號H D - 2000，上海精科實業有限公司；波長到280nm，靈敏度小于0. 01A，噪音彡0. 00025Au)。取15 20mL上清液，加樣于陽離子交換柱上，用0. Olmol/L磷酸緩沖液(pH 6. 5)洗脫至基線趨于穩定。3)牛奶堿性蛋白的分離收集用0. 01mol/L磷酸緩沖液，pH 6. 5 (含IM NaCl)洗脫，收集開始時間為當檢測到有蛋白物質(即核酸蛋白檢測儀值不斷增加)流出立即開始進行收集，收集終止時間為當蛋白檢測儀不能檢測有蛋白物質流出為止，即監測值的波動小于檢出值4)牛奶堿性蛋白的定量測定將100. OOg添加牛奶堿性蛋白的牛奶的所有收集物合并進行蛋白含量測定。蛋白測定方法采用微量凱氏定氮法。消化時加入硫酸鉀6g，硫酸銅0. 2g，將所有收集溶液全部加入消化管后，加入硫酸8ml ;樣品消化好后定容至IOOml容量瓶內，蒸餾時，取20ml樣液，加入40%Na0H 10ml，2%硼酸20ml ;用0. 01mol/l鹽酸進行滴定。蒸餾和滴定可以采用Foss1035 (Foss)(檢出限為 0.01%)。測定含量牛奶堿性蛋白含量為8. 6mg/100g。實施例2 :液相色譜進行乳鐵蛋白測定I)添加牛奶堿性蛋白的牛奶中酪蛋白及脂肪的沉淀分離精確稱取添加牛奶堿性蛋白的牛奶25. 00g，用lmol/L三氯乙酸調節pH為4. 6，靜置30min，離心(10000r ;20min)去除酪蛋白，獲得上清液，上清液用0. 5mol/L NaOH調節pH為6. 5,離心(10000r ; 15min),上清液備用。2)乳鐵蛋白的吸附取陽離子交換樹脂20ml 25mL CM sephrose FF,裝入16x400mm的柱,用減壓法除去樹脂中存留的氣泡，使得層析柱材料分布均勻。然后用四倍柱體積0. 01mol/L磷酸緩沖液(pH 6. 5)平衡，使核酸蛋白檢測的基線趨于穩定。取15 20mL上清液，加樣于陽離子交換柱上，用0. Olmol/L磷酸緩沖液(pH 6. 5)洗脫至基線趨于穩定。3)乳鐵蛋白的分離收集用0. 01mol/L磷酸緩沖液pH 6. 5 (含IM NaCl)洗脫，收集開始時間為當檢測到有蛋白物質(即核酸蛋白檢測儀值不斷增加)流出立即開始進行收集，收集終止時間為當蛋白檢測儀不能檢測有蛋白物質流出為止，即監測值的波動小于檢出值。
4)乳鐵蛋白的定量測定乳鐵蛋白的含量采用液相色譜的方法測定。高效液相色譜儀shimadzu公司 SPD-20A ；shimadzu 公司 LC-20A ；shimadzu 公司 IOAsup ;日本資生堂 proteonavi C4 柱(250mmX 4. 6mmX 5 μ m);乳鐵蛋白標樣(sigmaL9507)高效液相色譜條件流動相A :0. 1%三氟乙酸(TFA)-水溶液流動相B 0. 1%三氟乙酸(TFA)- 乙腈水溶液(95 5)檢測波長280nm流速0.5mT ,/mi η柱溫35°C進樣量20μ L梯度洗脫(見表I)表I梯度洗脫條件
權利要求
1.一種乳中牛奶堿性蛋白的檢測方法，所述方法包括以下步驟 1)乳中酪蛋白及脂肪的沉淀分離； 2)牛奶堿性蛋白的吸附； 3)牛奶堿性蛋白的分離收集； 4)將步驟3)中獲得的牛奶堿性蛋白定量測定。
2.權利要求I的方法，其中所述牛奶堿性蛋白是乳鐵蛋白。
3.權利要求I或2的方法，其中所述酪蛋白和脂肪的沉淀分離包括直接離心分離、酸沉淀結合離心分離、乙腈沉淀并結合離心分離，優選的是酸沉淀結合離心的方法。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述酸沉淀并結合離心的方法包括稱取乳，將pH調節為3-7，優選的是4-6，優選的是4. 5-5. 5，優選的是4. 6，靜置并離心以去除酪蛋白，獲得第一上清液，將第一上清液調節PH為5-8，優選地6-7，優選地6. 5，接著進行離心得到第二上清液。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述吸附通過吸附柱進行，所述吸附柱為人工填充柱或購買的預裝柱，所述吸附柱的柱材料選用陽離子交換樹脂，其中優選的陽離子交換樹脂為 CM sephrose FF> CM sephadex C50,更優選的是 CM sephrose FF。
6.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述吸附選用的緩沖液的pH為6.2-6. 8，優選地6. 5，濃度為O. 01-0. 03mol/L，優選地O. Olmol/L，其中所述緩沖液優選的是磷酸緩沖液。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述分離收集采用含鹽緩沖液洗脫來進行，其中收集蛋白的監測采用能夠檢測蛋白的在線裝置，優選為核酸蛋白檢測器進行，收集開始時間為當檢測到有蛋白物質流出，收集終止時間為當蛋白檢測儀不能檢測有蛋白物質流出，即監測值的波動小于檢出值。
8.權利要求7的方法，其中所述含鹽緩沖液的鹽濃度為O.5-1. Omol/L，優選地lmol/L。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中所述定量測定通過微量凱氏定氮法、Folin-酚試劑法、考馬斯亮藍法、雙縮脲法、液相色譜法或毛細管電泳，優選微量凱氏定氮或液相色譜法進行。
10.權利要求9的方法，其中所述液相色譜法以乳鐵蛋白為標準品，通過將液相獲得圖譜所有的峰面積與乳鐵蛋白標準峰比較進行定量。
全文摘要
本發明涉及一種乳中堿性蛋白的檢測方法。本發明提供了一種乳中堿性蛋白物質的測定方法，特別是牛奶堿性蛋白的測定。所述方法包括1)通過調酸離心的方式除去酪蛋白和脂肪；2)通過陽離子樹脂將堿性蛋白進行吸附，3)收集洗脫液，4)利用微量定氮的方式進行蛋白質測定。本發明還提供了利用層析設備代替手動所進行牛奶堿性蛋白的收集的方法。
文檔編號G01N30/02GK102866152SQ20121034414
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者陳偉, 李志偉, 錢文濤, 季國志, 高增麗, 李洪亮, 于景華, 高連勝 申請人:內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司