一種測定超氧化物歧化酶活性的方法
【專利摘要】本發明提供了一種測定超氧化物歧化酶活性的方法。解決現有技術中測定超氧化物歧化酶活性的方法存在檢測困難，準確度低，重現性差的技術問題。本方法是選用鄰苯三酚堿性自氧化體系，結合紫外-可見分光光度法對超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除作用進行評價，通過檢測與超氧陰離子作用后捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜吸光度的變化計算出超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，進而得出超氧化物歧化酶的活性。本方法具有重現性好，準確度高，操作簡便的優點。
【專利說明】一種測定超氧化物歧化酶活性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種測定超氧化物歧化酶活性的方法。
【背景技術】
[0002]活性氧包括超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫、單線態氧等，這些粒子均十分微小。由于存在未配對的自由電子，活性氧的化學性質十分活躍。活性氧往往是生物生化過程中的一種副產品，當其過量時，機體內的活性氧會對細胞和基因結構造成損壞，引發多種疾病，如細胞毒性、衰老、癌癥等。超氧陰離子是其他幾種活性氧的源頭，超氧化物歧化酶能夠清除機體中過量的超氧陰離子，它能夠催化超氧陰離子發生歧化反應，產生氧氣和過氧化氫，具有抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。因此，近年來，對測定超氧化物歧化酶活性的方法的研究備受:關注。
[0003]現有的測定超氧化物歧化酶活性的方法主要是黃嘌呤氧化酶-NBT法、腎上腺素自氧化法、Marklund鄰苯三酚法、化學發光法等。但是黃嘌呤氧化酶-NBT法中，NBT產物甲臜水溶性差，需要加入助溶劑增加水溶性，因此此法應用有一定的限制。腎上腺素自氧化法和Marklund鄰苯三酚法是根據腎上腺素和鄰苯三酚在堿性條件下自氧化，產生超氧陰離子和有色物質，根據有色物質的含量變化測定超氧化物歧化酶活性，但是有色物質不穩定，存在時間短，因此測定有誤差，重現性較差。化學發光法是通過使用化學發光劑使體系產生化學發光，間接的檢測超氧陰離子的方法，該方法由于發光時間短暫，測定困難并易產生誤差，重現性較差。
【發明內容】
[0004]本發明為解決現有技術中測定超氧化物歧化酶活性的方法存在檢測困難，準確度低，重現性差的技術問題，而提供了一種涉及紫外-可見分光光度法測定超氧化物歧化酶的活性的方法。
`[0005]為了解決上述技術問題，本發明的測定超氧化物歧化酶活性的方法的技術方案具體如下:
[0006]一種測定超氧化物歧化酶活性的方法，該方法包括以下步驟:
[0007]步驟a、超氧陰離子產生體系緩沖溶液的配制
[0008]配制pH值為8.5~9.5的30-50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液；
[0009]步驟b、標準品的配制
[0010]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標準品配成濃度為50微摩爾/升的標準溶液，所述的標準品為2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽；
[0011]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0012]對照品的制備:取40微升0.4^8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升生理鹽水，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37 V反應8~20分鐘后，作為對照品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0013]樣品的制備:取40微升0.4、毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)~5~ (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應8~20分鐘后，作為樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0014]空白樣品的制備:取40微升0.4~8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，370C反應8~20分鐘后，作為空白樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0015]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0016]設定紫外-可見檢測波長為450納米，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中對步驟c中制備的對照品、樣品和空白樣品進行測定，得到對照品、樣品和空白樣品的吸光度
值A *tMn°n、A樣S和A舶樣品；
[0017]步驟e、超氧化物歧化酶的活性的計算
[0018]超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率按照以下公式計算:
[0019]I樣品=[A對照品-(A樣品-A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0020]式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率；
[0021]Ams為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0022]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0023]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0024]超氧化物歧化酶活性的計算公式如下:
[0025]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0026]式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率；超氧化物歧化酶活性單位為U。
[0027]在上述技術方案中，步驟a中所述的緩沖溶液優選pH值為9.0~9.5，最優選pH值為9.3。
[0028]在上述技術方案中，步驟c中所述的乙二胺四乙酸二鈉鹽的濃度優選為0.1~2毫
摩爾/升，最優選為2毫摩爾/升。
[0029]本發明的測定超氧化物歧化酶活性的方法的有益效果是:
[0030]本發明的測定超氧化物歧化酶活性的方法，是選用鄰苯三酚堿性自氧化體系，結合紫外-可見分光光度法對超氧化物歧化酶清除超氧陰離子的清除率進行計算，進而可得到超氧化物歧化酶的活性，避免了黃嘌呤氧化酶-NBT法產物甲臜水溶性差，應用有一定限制的缺點。同時克服了腎上腺素法、Marklund鄰苯三酚自氧化法和化學發光法產物不穩定，檢測困難并易產生誤差的問題。
[0031]另外，本發 明的測定超氧化物歧化酶活性的方法重現性好，準確度高，操作簡便。【具體實施方式】
[0032]本發明的發明思想為:本發明是選用鄰苯三酚堿性自氧化體系，結合紫外-可見分光光度法對超氧化物歧化酶清除超氧陰離子的清除率進行計算，進而可得到超氧化物歧化酶的活性。
[0033]本發明選用鄰苯三酚堿性自氧化體系產生超氧陰離子，以2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽為超氧陰離子捕集劑，加入超氧化物歧化酶，產物水溶性甲臜在450納米下具有光吸收，通過產物水溶性甲臜的吸光度變化計算出超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，進而可得到超氧化物歧化酶的活性。
[0034]超氧化物歧化酶可催化超氧陰離子發生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而導致與2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產物水溶性甲臜染料的量減少；所以超氧化物歧化酶的活性可以通過捕集劑2-(4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜染料含量的變化進行評價。
[0035]實施例1
[0036]本發明提供的一種測定超氧化物歧化酶活性的方法，該方法包括以下步驟:
[0037]步驟a、超氧陰離子產生體系緩沖溶液的配制
[0038]配制濃度為50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調節pH值為9.3 ;
[0039]步驟b、標準品的配制
[0040]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標準品配成濃度為50微摩爾/升的標準溶液，所述的標準品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應產生水溶性甲臜染料；
[0041]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0042]對照品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升生理鹽水，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應12分鐘后，作為對照品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0043]樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶標準品溶液(生理鹽水溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應12分鐘后，作為樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0044]空白樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶標準品溶液(生理鹽水溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應12分鐘后，作為空白樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0045]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0046]對照品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進行測定，得到對照品的
吸光度值A對照品；
[0047]樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0048]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進行測定，得到空白樣
品的吸光度值A空白樣品；
[0049]步驟e、超氧化物歧化酶的活性的計算
[0050]超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率按照以下公式計算:
[0051]I樣品=[A對照品-(A樣品-A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0052]式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率；
[0053]A對照品為對照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)_5_(2’ 4_ 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0054]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0055]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0056]超氧化物歧化酶活性的計算公式如下:
[0057]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0058]根據測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，經計算得到
0.78毫克/升超氧化物歧化酶標準品對超氧陰離子的清除率為42%，進而得出超氧化物歧化酶標準品的活性為5.8U/ μ go
[0059]超氧化物歧化酶標準品對超氧陰離子的清除率，是超氧化物歧化酶可催化超氧陰離子發生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而導致與2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產物水溶性甲臜染料的量減少；所以超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2-(4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜染料含量的變化計算得到，進而得出超氧化物歧化酶標準品的活性。
[0060]實施例2
[0061]本發明提供的一種測定超氧化物歧化酶活性的方法，其包括以下步驟:
[0062]步驟a、超氧陰離子產生體系緩沖溶液的配制
[0063]配制濃度為30毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調節pH值為9.5 ;
[0064]步驟b、標準品的配制
[0065]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標準品配成濃度為50微摩爾/升的標準溶液，所述的標準品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應產生水溶性甲臜染料；[0066]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0067]對照品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升生理鹽水，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應8分鐘后，作為對照品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0068]樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升大鼠肝臟勻漿液(生理鹽水溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應8分鐘后，作為樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定;
[0069]空白樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升大鼠肝臟勻漿液(生理鹽水溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應10分鐘后，作為空白樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0070]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0071]對照品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進行測定，得到對照品的
吸光度值A5iws ；
[0072]樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0073]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進行測定，得到空白樣
品的吸光度值A空白樣品；
[0074]步驟e、超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率的計算
[0075]超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率按照以下公式計算:
[0076]I樣品=[A對照品-(A樣品一A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0077]式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率；
[0078]Ams為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0079]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0080]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4-硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0081]超氧化物歧化酶活性的計算公式如下:
[0082]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0083]根據測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，經計算得到健康大鼠肝臟中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，再根據樣品質量以及稀釋倍數，換算得到健康大鼠肝臟中超氧化物歧化酶的活性為19100U/g。
[0084]健康大鼠肝臟中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，是健康大鼠肝臟中超氧化物歧化酶可催化超氧陰離子發生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而導致與2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產物水溶性甲臜染料的量減少；所以健康大鼠肝臟中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜染料含量的變化計算得到，進而得出健康大鼠肝臟中超氧化物歧化酶的活性。
[0085]實施例3
[0086]本發明提供的一種測定超氧化物歧化酶活性的方法，其包括以下步驟:
[0087]步驟a、超氧陰離子產生體系緩沖溶液的配制
[0088]配制濃度為45毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調節pH值為9.0 ;
[0089]步驟b、標準品的配制
[0090]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標準品配成濃度為50微摩爾/升的標準溶液，所述的標準品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應產生水溶性甲臜染料；
[0091]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0092]對照品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升0.4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升生理鹽水，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應16分鐘后，作為對照品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0093]樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升0.4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升大鼠腎臟勻漿液(生理鹽水溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的
2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應16分鐘后，作為樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0094]空白樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升0.4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升大鼠腎臟勻漿液(生理鹽水溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應16分鐘后，作為空白樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0095]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0096]對照品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進行測定，得到對照品的
吸光度值A5iws ；
[0097]樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0098]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進行測定，得到空白樣品的吸光度值A空白樣品；
[0099]步驟e、超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率的計算
[0100]超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率按照以下公式計算:
[0101]I樣品=[A對照品-(A樣品一A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0102]式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率；
[0103]A對照s為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0104]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0105]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4-硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0106]超氧化物歧化酶活性的計算公式如下:
[0107]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0108]根據測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，經計算得到健康大鼠腎臟中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，再根據樣品質量以及稀釋倍數，換算得到健康大鼠腎臟中超氧化物歧化酶的活性為4900U/g。
[0109]健康大鼠腎臟中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，是健康大鼠腎臟中超氧化物歧化酶可催化超氧陰離子發生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而導致與2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產物水溶性甲臜染料的量減少；所以健康大鼠腎臟中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜染料含量的變化計算得到，進而得出健康大鼠腎臟中超氧化物歧化酶的活性。
[0110]實施例4
[0111]本發明提供的一種測定超氧化物歧化酶活性的方法，其包括以下步驟:
[0112]步驟a、超氧陰離子產生體系緩沖溶液的配制
[0113]配制濃度為40毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調節pH值為8.5 ；
[0114]步驟b、標準品的配制
[0115]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標準品配成濃度為50微摩爾/升的標準溶液，所述的標準品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應產生水溶性甲臜染料；
[0116]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0117]對照品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升生理鹽水，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應20分鐘后，作為對照品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0118]樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升大鼠血清(生理鹽水稀釋的)，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽,最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應20分鐘后，作為樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定;
[0119]空白樣品的制備:反應總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升大鼠血清(生理鹽水稀釋的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37 °C反應20分鐘后，作為空白樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定；
[0120]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0121]對照品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進行測定，得到對照品的
吸光度值A5iws ；
[0122]樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0123]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中進行測定，設定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進行測定，得到空白樣
品的吸光度值A空白樣品；
[0124]步驟e、超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率的計算
[0125]超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率按照以下公式計算:
[0126]I樣品=[A對照品-(A樣品一A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0127]式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率；
[0128]Ams為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0129]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0130]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4-硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0131]超氧化物歧化酶活性的計算公式如下:
[0132]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0133]根據測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，經計算得到大鼠血清中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，再根據樣品體積以及稀釋倍數，換算得到大鼠血清中超氧化物歧化酶的活性為1100U/mL。
[0134]大鼠血清中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率，是大鼠血清中超氧化物歧化酶可催化超氧陰離子發生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而導致與2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產物水溶性甲臜染料的量減少；所以大鼠血清中超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜染料含量的變化計算得到，進而得出大鼠血清中超氧化物歧化酶的活性。
[0135] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。
【權利要求】
1.一種測定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 步驟a、超氧陰離子產生體系緩沖溶液的配制 配制PH值為8.5~9.5的30-50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液； 步驟b、標準品的配制 用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標準品配成濃度為50微摩爾/升的標準溶液，所述的標準品為2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽； 步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備 對照品的制備:取40微升0.1-8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升生理鹽水，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應8~20分鐘后，作為對照品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定； 樣品的制備:取40微升0.4^8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)~5~ (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應8~20分鐘后，作為樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定； 空白樣品的制備:取40微升0.4^8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)~5~ (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應8~20分鐘后，作為空白樣品，供內置紫外可見分光光度計的酶標儀測定； 步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測 設定紫外-可見檢測波長為450納米，在內置紫外可見分光光度計的酶標儀中對步驟c中制備的對照品、樣品和空白樣品進行測定，得到對照品、樣品和空白樣品的吸光度值Aw照品、A樣品矛卩A空白樣品； 步驟e、超氧化物歧化酶的活性的計算 超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率按照以下公式計算: 1樣品=[A對照品"(A樣品"A空白樣品)]/ A對照品X 100% 式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率； AwmsS對照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱； A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱； A空白樣品為空白樣品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱； 超氧化物歧化酶活性的計算公式如下: 超氧化物歧化酶活性=I / ( 1-1 ) 式中，I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率；超氧化物歧化酶活性單位為U。
2.如權利要求1所述的測定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步驟a中所述的緩沖溶液PH值為9.0~9.5。
3.如權利要求2所述的測定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步驟a中所述的緩沖溶液pH值為9.3。
4.如權利要求1所述的測定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步驟c中所述的乙二胺四乙酸二鈉鹽的濃度為0.1~2毫摩爾/升。
5.如權利要求4所述的測定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步驟c中所述的乙二胺四乙酸二鈉鹽的濃度為2毫摩爾/升。
【文檔編號】G01N21/33GK103674870SQ201210341599
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2012年9月14日
【發明者】劉志強, 徐晨, 劉舒, 邢俊鵬, 宋鳳瑞, 鄭重, 劉淑瑩 申請人:中國科學院長春應用化學研究所