專利名稱：柯薩奇病毒a6型rt-lamp核酸檢測引物及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術應用領域，具體地說涉及柯薩奇病毒A6(Coxsackievirus A6,簡稱CA6)各種標本(糞便、肛拭,咽拭、皰疫液、腦脊液)核酸檢測用引物及試劑盒。
背景技術：
柯薩奇病毒A6為單股正鏈RNA病毒,屬于小RNA病毒科(Picoranviridae) <ΧΑ6可引起手足口病和皰疹性咽峽炎等疾病。雖然通常不認為CA6是手足口病的主要病原，但近年在新加坡、芬蘭、臺灣和日本等國家和地區都有CA6導致手足口病暴發的報道，而且CA6引起的手足口病與其它型別腸道病毒所引起的更可能引起博氏線(Beau’ s lines)和甲脫 落等癥狀，其機制尚不清楚，但可能表示CA6較其它型別腸道病毒有更廣的細胞感染譜，因此，CA6感染應受到重視。手足口病于2008年5月2日已被納入傳染病防治法規定的丙類傳染病進行管理。目前，經典的檢測腸道病毒的方法多為采用細胞分離培養、特異性抗體檢測，該方法步驟繁瑣，檢測周期長，而且一些腸道病毒難以在細胞中進行增殖，容易出現漏檢；基于CA6核酸擴增的分子生物學診斷技術如PCR、RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR(real-time fluorescentRT-PCR)等在病原微生物的檢測以及疫病診斷方面發揮著重大作用，但這些方法或者需要精密控溫設備和高級復雜的分析儀器，或者對操作人員的熟練度和專業水平要求比較高，且反應時間長，不利于現場樣品的檢測，不利于在基層推廣，無法滿足簡單、快速、準確診斷的要求；而疫情的防控和治療的關鍵在于對病原微生物的快速、準確、及早的檢測并確診。因此，建立一種快速、準確的新型診斷技術對于疫病的診斷就顯得尤為重要。環介導等溫擴增技術(LAMP)是由Notomi等于2000年報道的一種新型核酸擴增技術，它針對目的基因的6個區域設計4條引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等溫(60 65°C )的條件下高效、特異、快速的擴增目的基因。目前,LAMP技術已經被廣泛應用病原微生物的診斷中，包括人類致病細菌和病毒，動植物病毒和寄生蟲的檢測。
發明內容
本發明目的在于提供用于柯薩奇病毒A6型逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)檢測的引物及試劑盒，以能夠簡單、快速、準確地檢測樣品中是否含柯薩奇病毒A6型，滿足現場快速檢測的需要。本發明提供的用于檢測柯薩奇病毒A6型的RT-LAMP引物組，包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、以及兩條環引物LF和LB，其堿基序列分別如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4、及 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 所示。本發明提供的柯薩奇病毒A6型的RT-LAMP檢測試劑盒，包括上述的RT-LAMP引物組。
本發明提供的一種柯薩奇病毒A6型的RT-LAMP檢測試劑盒，包括含有上述RT-LAMP引物組的RT-LAMP反應液，23 μ I所述RT-LAMP反應液的配置為10 X buffer2. 5 μ l,25mM MgCl2 5 μ I, IOmM each dNTPs 3· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1μ1，40μΜ 所述ΒΙΡΙμ 1，10μΜ 所述 F3 O. 5 μ 1，10 μ M 所述 Β3 O. 5 μ 1，40 μ M 所述 LF 0·5μ1，40μΜ 所述 LB O. 5 μ I，5U/ μ I AMV 逆轉錄酶 O. 5 μ I，8U/ μ I Bst DNA polymerase I μ I, DEPC H2O6· 5 μ I ο優選地，所述柯薩奇病毒Α6型的RT-LAMP檢測試劑盒還包括SYBR Green I熒光染料。上述柯薩奇病毒Α6型的RT-LAMP檢測試劑盒的最佳檢測反應條件是63°C恒溫反應40min，80°C反應5min。具體地，操作時只需將RT-LAMP反應液和待檢RNA混勻，63°C反應40min即可完成逆轉錄和等溫擴增過程，80°C反應5min使酶滅活，反應結束后結果判斷可取擴增產物電泳檢測，或者在擴增產物管內加入SYBR Green I熒 光染料，根據反應液顏色的變化來判定結果。與現有的CA6RT-PCR、Real-time RT-PCR 相比，本發明建立了 CA6RT-LAMP 檢測技術，它以樣品(糞便、肛拭，咽拭、皰疹液、腦脊液)RNA為模板，省略了單獨的逆轉錄步驟和模板的變性、退火和延伸反應過程中溫度變化的耗時，只需一步就可以完成在等溫環境中的循環置換擴增反應，不需要復雜的儀器，最后用電泳或加熒光染料后肉眼、紫外光下就可以觀察結果，具有操作方法簡單、檢測快速、結果易于判斷、成本低等特點。同時，本發明CA6RT-LAMP特異性強，靈敏度高。因此，本發明試劑盒及CA6RT-LAMP檢測技術能夠快速、簡單、準確地判斷樣品是否有CA6感染，能夠較好滿足現場快速檢測的要求，易于在基層單位推廣應用，可用于疾病預防控制機構、醫院、托幼機構在手足口病等暴發疫情和臨床病例的早期快速診斷，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
圖I是CA6RT-LAMP、RT-PCR靈敏度實驗的結果圖；其中，圖I-A和圖I-B分別是CA6RT-LAMP產物加熒光染料后在可見光下觀察的結果和紫外光下觀察的結果，圖中，1-8 :分別為標準品RNA的10-1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，10_8梯度稀釋的RT-LAMP產物，9 :陰性對照；圖I-C是CA6RT-LAMP產物電泳條帶，圖1-D是CA6RT-PCR產物電泳條帶，LaneM IOObp DNA Ladder Marker(100, 200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1500bp)；Lane 1-8 :分別為標準品 RNA 的 ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3，1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6，10' 1(Γ8 梯度稀釋的 RT-LAMP產物；Lane 9 :陰性對照；圖2是CA6RT-LAMP引物特異性實驗的結果圖；其中，圖2-A和圖2-B分別是CA6RT-LAMP產物加熒光染料后在可見光下觀察的結果和紫外光下觀察的結果，圖中，1-12 CA6病毒，13 - 24 :分別為CA2，CA4, CA5, CA8, CA10, CA12,CA16, CBl, CB3, Echo9, Echol4 及 EV71 病毒，25 :陰性對照；圖 2-C 是 CA6RT-LAMP 產物電泳條帶，Lane M :IOObp DNA Ladder Marker ；Lanesl - 12 CA6 病毒；Lanes 13 - 24 :分別為 CA2, CA4, CA5, CA8, CA10, CA12, CA16, CBl, CB3，Echo9, Echol4 及 EV71 病毒；Lane 25 :陰性對照；
圖3是CA6RT-LAMP方法的可重復性檢測實驗的結果圖；其中，圖3-A和圖3-B分別是CA6RT-LAMP產物加熒光染料后在可見光下觀察的結果和紫外光下觀察的結果，圖中，1、3、5、7 :分別為CA6陽性標準品4次重復；2、4、6、8 :分別為4次重復實驗的陰性對照；圖 3-C是CA6RT-LAMP產物電泳條帶，Lane M IOObp DNA Ladder Marker ;Lane I、3、5、7 :分別為CA6陽性標準品4次重復；Lane2、4、6、8 :分別為4次重復實驗的陰性對照。
具體實施例方式下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I : LAMP引物的設計和合成根據GenBank公布的CA6VP1基因序列，利用生物軟件CLAST分析其相對保守區， 利用 LAMP 在線設計軟件 PrimerExplorer V4 (http: //primerexplorer. ip/e/)針對相對保守序列區設計了 6條引物，包括兩條內引物FIP (F2+F1C)和BIP(B2+B1C)、兩條外引物F3和B3、以及兩條環引物LF和LB，分別與靶序列中8個結合區匹配，在利用Oligo 6軟件和BLAST對引物進行評價。引物序列為F3 (正向外引):5，-ACTCGCTGTGTGATGAATCG-3’ ；即 SEQ ID NO: IB3 (反向外引)5，-GCGTTGTGCTATCATTGAGG-3’ ;即 SEQ ID NO:2FIP(F1C+F2，正向內引):5，-CCTTCACCTCCACAACTCCTACTGAGGCGAGTGTGGAACA-3，；即 SEQ ID NO:3BIP(B1C+B2，反向內引)5，-TTGGCCCATAGATGTGATGGGCGGCATCAAAGCGCATGT-3，；即 SEQ ID NO:4LF :5，-GCCCTGCACGAGAGTAAAAG-3，；即 SEQ ID NO:5LB :5，-GCGGCGTAAACTGGAGCTGT-3，；即 SEQ ID NO:6其中，F2:5’ -TGAGGCGAGTGTGGAACA-3，；即 SEQ ID NO:7FlC :5，-CCTTCACCTCCACAACTCCTAC-3，；即 SEQ ID NO:8B2 :5， -CGGCATCAAAGCGCATGT-3，；即 SEQ ID NO:9BlC :5，-TTGGCCCATAGATGTGATGGG-3，；即 SEQ ID NO:10實施例2 =RNA的提取病毒樣品RNA的抽提使用Roche High Pure Viral RNA KU，步驟按照其操作說明書進行，具體步驟1.在200 μ I樣品處理液中加入400 μ I Binding Buffer，混勻后轉移到濾柱上，8000g/min離心15s ;2.棄濾液，更換收集管，加入500 μ I Inhibitor RemovalBuffer, 8000g/min 離心 Imin ;3·棄濾液，更換收集管，加入 450 μ I Wash Buffer, 8000g/min離心Imin ；4.重復步驟3 —次；5.棄濾液,更換收集管，以離心機最大轉速離心IOs ；6.將濾柱轉移至1.5ml EP管，加入50μ1 Elution Buffer,8000g/min離心lmin,洗脫液即為提純核酸。病毒細胞培養物和皰疹液按上述方法直接提取；糞便樣品、肛拭子和咽喉拭子需經過預處理，在抽提前需加Hank’Balanced Salt Solution,其中,O. Ig糞便樣品(100 μ I液態)加Iml Hank’s液,充分振蕩后將懸液8000rpm離心5min,取200 μ I上清液進行RNA抽提，用 50 μ I Elution Buffer 洗脫，于 _80°C保存。
實施例3 CA6RT-LAMP擴增方法的建立I、CA6RT-LAMP 反應體系 以待檢樣品RNA為模板，進行RT-LAMP反應。表1CA6RT-LAMP 反應體系
權利要求
1.一種用于檢測柯薩奇病毒A6型的RT-LAMP引物組，其特征在于包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、以及兩條環引物LF和LB，其堿基序列分別如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4、及 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 所示。
2.—種柯薩奇病毒A6型的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求I所述的RT-LAMP引物組。
3.一種柯薩奇病毒A6型的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括含有權利要求I所述RT-LAMP引物組的RT-LAMP反應液，23^1所述RT-LAMP反應液的配置為10Xbuffer2.5 u l,25mM MgCl2 5u I, IOmM each dNTPs 3. 5 u l，40yM 所述 FIP I u l，40yM 所述 BIPIii 1，IOii M 所述 F3 0. l，10iiM 所述 B3 0. 5 y 1，40 y M 所述 LF 0. 5 y 1，40 y M 所述 LB0.5u l,5U/u I AMV逆轉錄酶0. l,8U/u I Bst DNApolymerase I u I,DEPC H2O 6. I。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于還包括SYBRGreen I熒光染料。
5.根據權利要求2-4任意一項所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒的檢測反應條件是63°C恒溫反應40min,80°C反應5min。
全文摘要
本發明涉及生物檢測技術應用領域，特別是柯薩奇病毒A6型RT-LAMP核酸檢測用引物組及試劑盒，所述引物組包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、以及兩條環引物LF和LB，所述試劑盒包括該引物組。本發明CA6RT-LAMP特異性強，靈敏度高，而且具有操作方法簡單、檢測快速、結果易于判斷、成本低等特點，能夠較好滿足現場快速檢測的要求，易于在基層單位推廣應用，可用于疾病預防控制機構、醫院、托幼機構在手足口病等暴發疫情和臨床病例的早期快速診斷，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
文檔編號G01N21/64GK102816870SQ201210319290
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者何雅青, 陳惠玲, 舒柏華 申請人:何雅青, 陳惠玲, 舒柏華