專利名稱：基于示蹤分子的蛋白質-微球化學偶聯效率的檢測方法
技術領域：
本發明屬于免疫化學技術領域，涉及一種蛋白質-固體支持介質化學偶聯的檢測辦法，具體涉及一種蛋白質-羧基化聚苯乙烯微球之間化學偶聯效率的檢測辦法，尤其適用于變應原提取物與羧基化聚苯乙烯微球之間化學偶聯效率的檢測與評估。
背景技術：
在免疫化學產品的開發過程中，經常需要將抗體等蛋白質以共價鍵的方式同固相支持介質偶聯。在偶聯反應中，通常使用高純度的蛋白質溶液作為偶聯底物。但是在一些情況下，高純度的蛋白質難以獲得，蛋白質溶液中混有大量雜質。以血清變應原特異性IgE或IgG4檢測產品開發為例，需要將變應原提取物同固相支持介質(如羧基化聚苯乙烯微球)之間進行化學偶聯。變應原提取物是動物、植物、微生物的蛋白質粗提物，其有效成分是可以引發過敏的蛋白質或多肽。許多變應原提取物成分復雜、雜質較多。以屋塵螨提取物為例，其中蛋白質總含量較低，通常只占總重量的1/8到1/5，有效成分的含量更低，其余為雜 質，并且其中已知的引發過敏的蛋白質就有19種。由于目前還沒有一個完善的變應原提取物標準，以及蛋白質化學性質不穩定、容易降解，造成不同供應商、不同批次的變應原提取物之間有很大差異。此外，變應原種類繁多，僅常見的變應原就有六十余種。合理、精確、有效地監測偶聯反應是產品開發、原材料質量評估和產品質量控制的關鍵。通常而言，對于蛋白質與固相支持介質之間偶聯反應的效率有兩個檢測方案。第一個技術方案是直接測定偶聯后固相支持介質表面上的目標蛋白質濃度。這一技術方案的實施需要使用針對目標蛋白的特異性抗體。例如，在屋塵螨血清變應原特異性IgE檢測產品開發過程中，需要測定偶聯后的固相支持介質表面變應原的種類與數量，但是已知的引發過敏的蛋白質就有19種。此外，由于常見的變應原就有六十余種，每一個變應原-固相支持介質之間偶聯反應的檢測就需要使用多個抗體，這一技術方案的工作量大，成本高。第二個方案是測定固體介質表面上的目標蛋白質與其對應檢測對象的結合。以屋塵螨血清變應原特異性IgE檢測產品為例，需要測定固相支持介質表面的變應原可以特異性地結合多少IgE。這一技術方案的實施的難點在于實驗步驟多，并且需要大量來源于不同過敏患者的血清。此外，當偶聯反應出現問題時，由于在反應中缺乏內參，上面兩個技術方案均無法對偶聯反應的結果進行直接分析。例如，當上述兩個方案均測定出偶聯反應的效率低于預期值時，兩個方案均無法確定失誤的具體原因是由于化學試劑或反應條件的問題，還是變應原提取物的質量問題。
發明內容
為了解決上述的技術問題，本發明提出一種基于外源性示蹤分子的蛋白質-羧基化聚苯乙烯微球之間化學偶聯效率的檢測方法，其通過向氨基-羧基的偶聯反應中加入少量的外源性示蹤分子，并對其進行跟蹤，可以有效地監測蛋白質與聚苯乙烯微球之間化學偶聯的效率。此外，通過外源性示蹤分子上的氨基與反應中其它蛋白質的氨基競爭，可以計算出其它蛋白質的氨基濃度，其可以作為蛋白質提取物質量好壞的評估指標之一。由于外源性示蹤分子不干擾下游的免疫化學反應，不會對偶聯后的聚苯乙烯微球的正常使用造成不良影響。為實現上述發明目的，本發明采用了如下技術方案—種基于外源性示蹤分子的蛋白質-羧基化聚苯乙烯微球之間化學偶聯效率的檢測方法，包括如下步驟(I)將蛋白質與外源性示蹤分子按照一定質量比或者摩爾比混合；(2)在特定偶聯反應條件下，將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質-外源性示蹤分子溶液進行化學偶聯；并通過改變偶聯反應條件以及使用不同濃度的蛋白質-外源性示蹤分子溶液，對化學偶聯反應進行進一步的優化；
(3)對羧基化聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進行定量。優選地，所述步驟(I)中，所述蛋白質為蛋白質粗提取物(例如變應原提取物)或者純化的蛋白質(例如牛血清白蛋白)溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G(IgG)或者其它純化的蛋白質。優選地，所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. 0，含O. 05M O. 2M的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進一步封閉微球的活性基團，偶聯后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。優選地，所述步驟(2)中，所述超聲處理的時間為20秒 5分鐘，超聲頻率為20KHz。優選地，所述步驟(2)中，所述偶聯后的聚苯乙烯微球是被懸浮于貯存液中保藏的，所述貯存液為PH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. Owt%牛血清白蛋白、O. 01 O. 05wt%吐溫-20和O. I O. 5wt%疊氮鈉。更優選地,所述磷酸緩沖鹽溶液采用含O. 8% WtNaCl的磷酸鹽緩沖液。優選地，所述步驟(3)為，取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清，以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)底物顯色，數分鐘后，加入2N的硫酸終止反應，采用酶標儀或分光光度計在450nM波長處讀取吸光度。更優選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. Owt %牛血清白蛋白和O. 01 O. 05wt%吐溫-20 ；或者是，取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有熒光基團標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 Ih,其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細胞儀(如FACS Calibur等)進行定量。更優選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. O,濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. Owt %牛血清白蛋白和0.01 O. 05wt% 吐溫-20。本發明還提供了一種采用外源性示蹤分子測定待測蛋白溶液中有效成分濃度的方法，包括如下步驟(I)按照質量比或摩爾比，將固定量的外源性示蹤分子與不同量的待測蛋白質分子混合；(2)將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質-外源性示蹤分子溶液進行化學偶聯；(3)對偶聯后的聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進行定量；(4)通過數學計算，測量蛋白質溶液中有效成分的含量。
優選地，所述步驟(I)中，所述蛋白質為蛋白質粗提取物(例如變應原提取物)或者純化的蛋白質(例如牛血清白蛋白)溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G(IgG)或者其它純化的蛋白質。偶聯反應中，將固定量的外源性示蹤分子(如5ug兔IgG)與不同量的蛋白質溶液(如5、10、20ug不知純度的蛋白質)混合。優選地，所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. 0，含O. 05M O. 2M的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進一步封閉微球的活性基團，偶聯后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。優選地，所述步驟⑵中，所述超聲處理的時間為20秒 5分鐘，超聲頻率為20KHz。優選地，所述步驟(2)中，所述偶聯后的聚苯乙烯微球微球是被懸浮于貯存液中保藏的，所述貯存液為PH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I L Owt%牛血清白蛋白、O. 01 O. 05wt%吐溫-20和O. I O. 5界七％疊氮鈉。更優選地,所述磷酸緩沖鹽溶液采用含O. 8% WtNaCl的磷酸鹽緩沖液。優選地，所述步驟(3)為，取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’_四甲基聯苯胺(TMB)底物顯色，數分鐘后，加入2N的硫酸終止反應，采用酶標儀或分光光度計在450nM波長處讀取吸光度。更優選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. 0，濃度為O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含O. I I. 0wt%牛血清白蛋白和O. 01 O. 05wt%吐溫-20。或者是，取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有熒光基團標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 Ih,其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細胞儀(如FACS Calibur等)進行定量。更優選地，所述PBST緩沖溶液的pH值為7. 2 8. O,濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其含0. I I. Owt %牛血清白蛋白和0.01 0. 05wt% 吐溫-20。步驟(4)中，在偶聯反應中，羧基化聚苯乙烯微球同蛋白質上的氨基結合，形成共價鍵。
權利要求
1.一種基于示蹤分子的蛋白質-微球化學偶聯效率的檢測方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將蛋白質與外源性示蹤分子按照一定質量比或者摩爾比混合； (2)在特定偶聯反應條件下，將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質-外源性示蹤分子溶液進行化學偶聯；并通過改變偶聯反應條件以及使用不同濃度的蛋白質-外源性示蹤分子溶液，對化學偶聯反應進行進一步的優化； (3)對羧基化聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進行定量。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述蛋白質為蛋白質粗提取物或者純化的蛋白質溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G或者其它純化的蛋白質。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. O，含O. 05M O. 2M的2- (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. O，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. O，含O. 05M O.2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進一步封閉微球的活性基團，偶聯后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。
4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于所述步驟(3)為取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清，以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)底物顯色，數分鐘后，加入2N的硫酸終止反應，采用酶標儀或分光光度計在450nM波長處讀取吸光度； 或者是，取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有熒光基團標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細胞儀進行定量。
5.一種采用外源性示蹤分子測定待測蛋白溶液中有效成分濃度的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)按照質量比或摩爾比，將固定量的外源性示蹤分子與不同量的待測蛋白質分子混合； (2)將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質-外源性示蹤分子溶液進行化學偶聯； (3)對偶聯后的聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進行定量； (4)通過數學計算，測量蛋白質溶液中有效成分的含量。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述蛋白質為蛋白質粗提取物或者純化的蛋白質溶液，所述外源性示蹤分子為兔子正常免疫球蛋白G(IgG)或者其它純化的蛋白質。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為取羧基化聚苯乙烯微球經水洗處理后，均勻分散于pH值為5. O 6. O，含O. 05M O. 2M的2- (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖溶液中或者pH值為5. O 7. O，含O. 05M O. 2M的磷酸鹽緩沖溶液中，經超聲處理后，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而后離心移去上清，獲得活化的聚苯乙烯微球；向活化后的聚苯乙烯微球加入含有蛋白質/兔IgG的MES緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液，室溫下暗處震蕩孵育I 2h，其后離心移去上清，以pH值為7. 2 8. O，含O. 05M O.2M的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀物，并使用貯存液進一步封閉微球的活性基團，偶聯后的聚苯乙烯微球保存于貯存液中。
8.根據權利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于所述步驟(3)為取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清。以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用3’，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)底物顯色，數分鐘后，加入2N的硫酸終止反應，采用酶標儀或分光光度計在450nM波長處讀取吸光度； 或者是，取偶聯后的聚苯乙烯微球，使用PBST緩沖溶液洗滌數次，將微球懸浮于含有熒光基團標記的山羊抗兔IgG抗體的PBST緩沖溶液中，室溫下暗處震蕩孵育O. 5 lh，其后離心移去上清，以PBST緩沖溶液洗滌沉淀物3-5次，之后使用流式細胞儀進行定量。
9.根據權利要求5-8任一項所述的方法，其特征在于步驟(4)中，在偶聯反應中，羧基化聚苯乙烯微球同蛋白質上的氨基結合，形成共價鍵，當偶聯反應中，蛋白質的濃度>>羧基化聚苯乙烯微球的可結合蛋白質的最大值時， Y值為微球表面結合的兔IgG的量；Ymax =微球表面結合兔IgG的最大值，(也近似于微球表面可結合蛋白質的最大值) [IgG]為偶聯反應中兔IgG的濃度，[X]為偶聯反應中待測蛋白質的濃度； 微球表面上兔IgG的比例與反應中的比例一致，即
全文摘要
本發明涉及一種基于示蹤分子的蛋白質-微球化學偶聯效率的檢測方法，包括如下步驟(1)將蛋白質與外源性示蹤分子按照一定質量比或者摩爾比混合；(2)在特定偶聯反應條件下，將羧基化聚苯乙烯微球與蛋白質-外源性示蹤分子溶液進行化學偶聯；并通過改變偶聯反應條件以及使用不同濃度的蛋白質-外源性示蹤分子溶液，對化學偶聯反應進行進一步的優化；(3)對羧基化聚苯乙烯微球表面的外源性示蹤分子進行定量。本發明通過向氨基-羧基的偶聯反應中加入少量的外源性示蹤分子，并對其進行跟蹤，可以有效地監測蛋白質與聚苯乙烯微球之間化學偶聯的效率。該方法可以迅速、合理、有效地監測偶聯反應。
文檔編號G01N33/532GK102818901SQ20121029297
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者程愛陽 申請人:天津博敏達生物科技有限公司