專利名稱：診斷奶牛隱性乳房炎的試劑、試紙條及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種診斷試劑，尤其涉及一種診斷奶牛隱性乳房炎的試劑以及由該試劑制備成的試紙條，本發明進一步涉及它們的制備方法及在臨床診斷奶牛隱性乳房炎中的應用，屬于奶牛隱性乳房炎的診斷領域。
背景技術：
奶牛乳房炎是奶牛業發病率最高、引起經濟損失最嚴重的疾病之一。全世界每年僅乳房炎一項所造成的損失就高達350億美元，中國由于乳房炎所造成的損失每年約50多億美元。根據乳房和乳汁有無肉眼可見變化，奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎兩種類型。奶牛隱性乳房炎，一般不表現臨床癥狀或由于其臨床癥狀不明顯，難于發現而常常被人們所忽視，但其發病率極高，當發展為臨床型乳房炎時，就失去最佳的治療時間。所 以在奶牛隱性乳房炎階段及時作出診斷，可減輕其對奶牛乳腺的損傷及產奶量和奶質的影響。據統計，中國隱性乳房炎陽性率為46. 4-85. 7%，奶牛隱性乳房炎的診斷一直是制約奶牛養殖業的難題。國內外對奶牛乳房炎的早期診斷均進行了大量的研究，并取得了可喜的研究成果，但這些科研成果并沒有在基層得到很好的應用與推廣，主要原因是理論與生產實際脫節或高昂的費用，基層難以承擔，如亞細胞水平方面的診斷與治療，技術高難，要求有專業人員開展相關工作，但基層缺乏這樣人員配備，所以無法推廣與實施；二是理論性強，不具備應用價值，如機理方面的研究；三是監測需要昂貴的設備與專業人員，而中國基層難以達到這一要求；四是費用太高，基層難以承擔，如一些生物學方面的檢測試劑盒及研發的新的抗生素藥物等。國外關于隱性乳房炎診斷主要集中在體細胞監測及對奶中成分的監控，現在被美、德、法等許多國家作為監測和控制奶牛隱性乳房炎的主要措施。如丹麥研制FossRBentley SomacountCC-150型體細胞分析儀等,可以及時發現隱性乳房炎,但檢測設備和費用較高，不適合中國基層推廣應用。在乳房炎診斷方面，國內目前采用的是CMT法或CMT改良法，這些方法基本原理就是診斷液與乳汁混合后出現絮狀沉淀，根據沉淀的出現時間及量判斷乳房炎程度，這些方法一是存在主觀判斷不確定性，判斷標準難以精確界定，不同的人主觀標準不一樣，結果也不一樣，假陰性高；另一就是需要檢測人員具有一定的專業知識，也限制其臨床推廣應用。故研制一種適合于基層工作人員使用的簡便、快捷、經濟實惠的隱性乳房炎診斷試紙，對奶牛養殖業的健康發展具有重要的意義。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種簡便、快捷、準確的診斷奶牛隱性乳房炎的試劑；本發明的目的之二是提供一種制備所述診斷奶牛隱性乳房炎試劑以及由該試劑所制備的診斷試紙條的方法。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的
一種診斷奶牛隱性乳房炎的試劑，包括以下組分兒茶酚紫，中性紅，石蕊，耐爾藍Α，α 一萘酚苯甲醇；優選的，各組分的重量份是兒茶酚紫O. 2-2份，中性紅1-10份，石蕊20-80份，耐爾藍A 5-20份，α —萘酌·苯甲醇1-10份；更優選的，各組分的重量份是兒茶酚紫O. 5-1. 5份，中性紅2-8份，石蕊40_60份，耐爾藍A 8_15份，α —萘酌·苯甲醇2_8份； 最優選的，各組分的重量份是兒茶酚紫I份，中性紅5份，石蕊50份，耐爾藍A 10份，α —萘酚苯甲醇5份。本發明中所述的“兒茶酚紫”又名為“鄰苯二酚紫”。本發明中所述“中性紅”的學名是“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸鹽”，是 細胞活體染色和酸堿性指示劑的一種堿性吩嗪染料。本發明中所述耐爾藍A又名為硫酸尼羅藍。本發明中所用到的所有組分或原料都能通過商業途徑購買得到，其規格符合行業標準。本發明提供了一種由所述診斷奶牛隱性乳房炎試劑制備得到診斷液的方法，包括以下步驟(I)將兒茶酚紫以及中性紅分別用水溶解，備用；(2)將耐爾藍A以及α —萘酚苯甲醇分別用冰醋酸溶解，備用；(3)將石蕊用乙醇回流煮沸，靜置，傾去上層清液；將下層沉淀再用相同方法處理2次；殘渣用水洗滌，傾去水洗液，再加水煮沸，放冷，濾過得石蕊溶液，備用；(4)將步驟(I)、( 2 )和(3 )所得到的五種備用液混均，調整pH至7. 2-7. 5，加水定容，靜置，即得。其中，步驟(3)中所述的乙醇優選為濃度95%的乙醇40mL ;所述的回流煮沸時間優選為I小時。本發明進一步提供了一種用于診斷奶牛隱性乳房炎的試紙條，該試紙條的制備方法包括將定性濾紙剪成長條形的試紙條，浸入到本發明提供的用于診斷奶牛隱形乳房炎的診斷液中，取出，冷凍負壓抽干，制得診斷試紙條。其中，所述的長條形的試紙條可以是寬O. 3-0. 8cm、長I. 5-3cm的試紙條，優選為寬O. 5cm、長2cm的試紙條。本發明進一步提供了診斷試紙條在診斷奶牛隱性乳房炎的使用方法，包括每次棄去待檢測奶牛的頭兩把奶，然后按順序將四個乳區各擠出I滴奶，分別滴到試紙條上，立即觀察試紙條的顏色變化；如果無顏色變化即紅色，為陰性；若變成淡綠色為輕度隱性乳房炎，變為藍色為重度隱性乳房炎。本發明診斷試紙條具有成本低廉，使用方便，診斷精度高等優點，臨床診斷檢測結果表明，本發明試紙條檢測隱性奶牛乳房炎的準確率達95%以上，適合于基層推廣應用。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例I診斷試劑的制備取兒茶酚紫lg，加水IOOmL使其溶解，備用；取中性紅5g，加水IOOmL使其溶解，備用；取耐爾藍AlOg，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取α —萘酚苯甲醇5g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取石蕊粉末50g，加濃度為95%的乙醇40mL，回流煮沸I小時，靜置，傾去上層清液，將沉淀物再用相同方法處理2次，每次用乙醇30mL，殘渣用IOmL水洗滌，傾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，濾過得石蕊溶液，備用；將上述處理好的五種備用液混均，用鹽酸或氫氧化鈉調整pH至7. 2，加水定容至IOOOmL,靜置15天，得到診斷試劑。
實施例2診斷試劑的制備取兒茶酚紫O. 2g，加水IOOmL使其溶解，備用；取中性紅lg，加水IOOmL使其溶解，備用；取耐爾藍A5g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取α —萘酚苯甲醇lg，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取石蕊粉末20g，加濃度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小時，靜置，傾去上層清液，再用相同方法處理2次，每次用乙醇30mL，殘渣用IOmL水洗滌，傾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，濾過得石蕊溶液，備用；將上述處理好的五種備用液混均，用鹽酸或氫氧化鈉調整pH至7. 5，加水定容至IOOOmL,靜置15天，得到診斷試劑。實施例3診斷試劑的制備取兒茶酚紫2g，加水IOOmL使其溶解，備用；取中性紅10g，加水IOOmL使其溶解，備用；取耐爾藍A20g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取α —萘酚苯甲醇10g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取石蕊粉末80g，加濃度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小時，靜置，傾去上層清液，再用相同方法處理2次，每次用乙醇30mL，殘渣用IOmL水洗滌，傾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，濾過得石蕊溶液，備用；將上述處理好的五種備用液混均，用鹽酸或氫氧化鈉調整pH至7. 4，加水定容至IOOOmL,靜置15天，得到診斷試劑。實施例4診斷試劑的制備取兒茶酚紫0. 5g，加水IOOmL使其溶解，備用；取中性紅2g，加水IOOmL使其溶解，備用；取耐爾藍A8g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取α —萘酚苯甲醇2g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取石蕊粉末40g，加濃度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小時，靜置，傾去上層清液，再用相同方法處理2次，每次用乙醇30mL，殘渣用IOmL水洗滌，傾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，濾過得石蕊溶液，備用；將上述處理好的五種備用液混均，用鹽酸或氫氧化鈉調整pH至7. 3，加水定容至IOOOmL,靜置15天，得到診斷試劑。實施例5診斷試劑的制備取兒茶酚紫I. 5g，加水IOOmL使其溶解，備用；取中性紅8g，加水IOOmL使其溶解，備用；取耐爾藍A15g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取α —萘酚苯甲醇Sg，加冰醋酸IOOmL使其溶解，備用；取石蕊粉末60g，加濃度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小時，靜置，傾去上層清液，再用相同方法處理2次，每次用乙醇30mL，殘渣用IOmL水洗滌，傾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，濾過得石蕊溶液，備用；將上述處理好的五種備用液混均，用鹽酸或氫氧化鈉調整pH至7. 5，加水定容至IOOOmL,靜置15天，得到診斷試劑。實施例6診斷試紙條的制備將定性濾紙剪成寬O. 5cm、長2cm的試紙條,浸入實施例I所制備的診斷試劑中，5分鐘后取出，冷凍負壓抽干，制得診斷試紙條。實施例7診斷試紙條的制備將定性濾紙剪成寬O. 5cm、長2cm的試紙條,浸入實施例2所制備的診斷試劑中，4分鐘后取出，冷凍負壓抽干，制得診斷試紙條。實施例8診斷試紙條的制備 將定性濾紙剪成寬O. 8cm、長2cm的試紙條,浸入實施例3所制備的診斷試劑中，6分鐘后取出，冷凍負壓抽干，制得診斷試紙條。實施例9診斷試紙條的制備將定性濾紙剪成寬O. 5cm、長2cm的試紙條,浸入實施例4所制備的診斷試劑中，5分鐘后取出，冷凍負壓抽干，制得診斷試紙條。實施例10診斷試紙條的制備將定性濾紙剪成寬O. 8cm、長2. 5cm的試紙條,浸入實施例5所制備的診斷試劑中，5分鐘后取出，冷凍負壓抽干，制得診斷試紙條。實驗例I本發明診斷試劑在檢測奶牛隱形乳房炎中的應用實驗I.實驗藥品(I)加州乳房炎診斷液(CMT)，乳房炎檢驗盤；(2)診斷試紙條,實施例6-10所制備的診斷試紙條；(3)丹麥福斯公司Fossmatic 5000系列體細胞快速測定儀,完達山乳業集團提供。2.實驗動物在黑龍江省哈爾濱市選擇3個中大型奶牛場，奶牛品種為荷斯坦奶牛，2009年I月至2009年12月，在所選的奶牛場中去除臨床型乳房炎病牛，每月對眼觀正常的泌乳期健康奶牛進行隱性乳房炎檢驗試驗。3.實驗方法乳汁體細胞計數試驗2009年I月至2009年12月，每月中旬采集奶牛乳汁，每次棄去頭兩把奶后，擠取奶樣50mL，進行乳汁體細胞計數分析，記錄檢測數據。乳汁體細胞計數檢測隱性乳房炎，陽性判定閾值為5X IO5個/mL，乳汁體細胞計數高于該閾值為隱性乳房炎陽性。對于確診為隱性乳房炎陽性牛再用下述兩種方法檢測。加州乳房炎試驗(CMT):奶牛場現場取奶牛四個乳區的乳樣分別加入對應的檢測皿檢測區內，傾斜檢驗盤45°C左右，流出多余的乳汁，于四個檢測區內分別加入等量(3mL)的CMT診斷液，隨即平持轉動檢測盤，使診斷液與乳汁充分混合，IOs后觀察結果。表ICMT檢測判定標準
權利要求
1.一種診斷奶牛隱性乳房炎的試劑，其特征在于，包括以下各組分組成兒茶酚紫，中性紅，石蕊，耐爾藍A和a —萘酚苯甲醇。
2.按照權利要求I所述的試劑，其特征在于，各組分的重量份是兒茶酚紫0.2-2份，中性紅1-10份，石蕊20-80份，耐爾藍A5-20份，a —萘酚苯甲醇1_10份。
3.按照權利要求2所述的試劑，其特征在于，各組分的重量份是兒茶酚紫0.5-1. 5份，中性紅2-8份，石蕊40-60份，耐爾藍A8-15份，a —萘酚苯甲醇2_8份。
4.按照權利要求3所述的試劑，其特征在于，各組分的重量份是兒茶酚紫I份，中性紅5份，石蕊50份，耐爾藍AlO份，a —萘酚苯甲醇5份。
5.由權利要求1-4任何一項所述試劑制備得到的診斷液。
6.一種制備權利要求5所述診斷液的方法，包括以下步驟 (1)將兒茶酚紫以及中性紅分別用水溶解，備用； (2)將耐爾藍A以及a—萘酚苯甲醇分別用冰醋酸溶解，備用； (3)將石蕊用乙醇回流煮沸，靜置，傾去上層清液；再用相同方法處理2次；殘渣用水洗滌，傾去水洗液，再加水煮沸，放冷，濾過得石蕊溶液，備用； (4)將步驟(I)、(2)和(3)所得到的五種備用液混均，調整pH至7.2-7. 5，加水定容，靜置，即得。
7.—種診斷奶牛隱性乳房炎的試紙條，其特征在于含有權利要求1-4任何一項所述的試劑。
8.—種診斷奶牛隱性乳房炎的試紙條，其特征在于含有權利要求5所述的診斷液。
9.一種制備權利要求7所述試紙條的方法，包括將定性濾紙剪成長條形的試紙條，將其浸入權利要求5所述的診斷液中，取出試紙條，冷凍負壓抽干，制得。
10.權利要求1-4任何一項所述試劑或權利要求5所述診斷液在制備診斷奶牛隱性乳房炎的藥物或試劑中的用途。
全文摘要
本發明公開了診斷奶牛隱性乳房炎的試劑、試紙條及其制備方法。所述試劑包括以下各組分兒茶酚紫，中性紅，石蕊，耐爾藍A和α-萘酚苯甲醇。本發明進一步公開了由所述試劑制備成的奶牛隱性乳房炎的診斷試紙條及其使用方法。本發明診斷試紙條具有成本低廉，使用方便，診斷精度高等優點。臨床診斷檢測結果表明，本發明試紙條檢測隱性奶牛乳房炎的準確率達95%以上，能應用于奶牛隱性乳房炎的臨床檢測。
文檔編號G01N21/78GK102818805SQ20121029265
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者高利, 肖建華, 范洪剛, 李艷飛, 張建濤, 魏成威, 劉本軍, 王洪斌 申請人:高利, 肖建華, 范洪剛