專利名稱：熒光增白劑cbs-x檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種添加劑檢測技術，具體來說，特別是涉及一種用于熒光增白劑CBS-X含量的酶聯免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
熒光增白劑0851，化學名稱為4，4/ -雙(2_磺酸鈉苯乙烯基)聯苯，屬雙二苯乙烯-聯苯型光學增白劑，特點是增白強度高，耐氯漂，氧漂性能優良，具有優異的耐洗牢度和干、濕日曬度，勻染性能良好，適合用于洗滌用品，也可直接用于紡織品、紙張的光學增白。長期以來，熒光增白劑的安全性頗受爭議，有資料顯示熒光增白劑是低毒的，也有 資料顯示熒光增白劑的分子結構穩定，不易被分解，在生物體內長期累積，會使細胞發生變異，產生潛在的致癌因素。因此，在未充分評估熒光增白劑的安全性的情況下，并不是所有熒光增白劑都被允許使用，歐盟、美國、日本、中國等許多國家對熒光增白劑都有一定的監管，相關法規如歐盟2002/72/EC指令、美國聯邦法規21CFR178. 3297和GB 9685-2008《食品容器、包裝材料用添加劑使用衛生標準》都制定了允許用于生產塑料食品接觸材料和制品的添加劑清單，對允許使用的熒光增白劑的最大添加量進行限制。鑒于此，建立相關產品的熒光增白劑的快速檢測方法，開展定期監測和安全性評估，對于規范行業發展，保證產品質量，保護消費者身體健康和保護環境等具有深遠的意義。而熒光增白劑CBS-X做為允許添加的熒光增白劑中的一種，也亟需一種合適的快速檢測方法。目前，國內外對熒光增白劑的檢測方法包括以下幾種紫外燈直接照射觀測法、色譜法、色譜質譜聯用法。其中，紫外燈直接照射觀測法只是一種簡單的判斷，不能鑒別熒光增白劑的種類；色譜法和色譜質譜聯用法具有特異性高、結果準確的優點，但是這兩種方法的缺點是樣品前處理繁瑣，消耗大量溶劑，且需要昂貴的實驗室設備，檢測成本高。
發明內容
基于此，本發明在于克服現有技術的缺陷，提供一種熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒和一種熒光增白劑CBS-X試劑盒制備方法，該試劑盒在檢測熒光增白劑CBS-X時可一次連續檢測多個樣品，具有便捷，快速，靈敏、成本低的特點。本發明的第一個目的在于提供一種突光增白劑CBS-X檢測試劑盒,其技術方案如下一種熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，主要包括I)包被熒光增白劑CBS-X特異性抗原的酶標板所述酶標板的每個微孔內熒光增白劑CBS-X特異性抗原的濃度為1-3 μ g/mL ；2)熒光增白劑CBS-X特異性抗體溶液該熒光增白劑CBS-X特異性抗體的濃度為
1-3 μ g/mL ；所述熒光增白劑CBS-X特異性抗原與熒光增白劑CBS-X特異性抗體溶液的用量比為 I :1。
在其中一個實施例中，所述熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒還包括有酶標二抗，所述酶標二抗是濃度按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗。在其中一個實施例中，所述熒光增白劑CBS-X特異性抗原的濃度為2μ g/mL ;所述熒光增白劑CBS-X特異性抗體的濃度為2 μ g/mL。在其中一個實施例中，所述熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒還包括熒光增白劑CBS-X標準品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。在其中一個實施例中，所述特異性熒光增白劑CBS-X特異性抗體是鼠源單克隆抗體；所述熒光增白劑CBS-X特異性抗原為熒光增白劑CBS-X與載體蛋白的偶聯物；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述熒光增白劑 CBS-X 標準品溶液濃度分別為 I X IO5 μ g/L, I X IO4 μ g/L, I X IO3 μ g/L, I X IO2 μ g/L,IXIOiU g/L、I X 10° μ g/L ;所述顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；所述終止液為l-2mol/L的硫酸 溶液；所述洗滌液為含有O. 05%-0. 5%吐溫-20的O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述酶標板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。本發明的第二個目的在于提供一種熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒制備方法，主要包括以下步驟I)制備包被熒光增白劑CBS-X特異性抗原的酶標板將2-磺酸基苯甲醛、2-磺酸基-5羥基-苯甲醛和熒光增白劑CBS-X分散于干燥DMSO中，加入哌啶，微波加熱，反應結束倒入水中，抽濾固體，得到帶有酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物；將帶酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物和碳酸鉀分散于干燥DMF中，常溫攪拌，加入N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加熱回流，熒光增白劑CBS-X的酚羥基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；隨后將中間產物加入三氟乙酸中，回流攪拌，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的熒光增白劑CBS-X的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺(NHS)和碳二亞胺(EDC)混合后反應，與載體蛋白偶聯制備得到熒光增白劑CBS-X特異性抗原，將熒光增白劑CBS-X特異性抗原包被于酶標板中，所述酶標板的每個微孔內熒光增白劑CBS-X特異性抗原的濃度為
1-3 μ g/mL ；2)制備熒光增白劑CBS-X特異性抗體以步驟I)中合成的熒光增白劑CBS-X特異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫；免疫后，取血清效價高的小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株；并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑CBS-X單克隆抗體；所述熒光增白劑CBS-X特異性抗體的濃度為1-3 μ g/mL。在其中一個實施例中，上述步驟I)中，制備熒光增白劑CBS-X特異性抗原的方法優選為將O. 186g,即I. Ommol的2-磺酸基苯甲醒、O. 20g,即I. Ommol的2-磺酸基_5輕基-苯甲醛和O. 40g,即I. Ommol的熒光增白劑CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加熱5min，反應結束倒入水中，抽濾固體，得到帶有酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物；將O. 53g，即I. Ommol的帶酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物和I. Olg,即IOmmol的碳酸鉀分散于80mL干燥DMF中，常溫攪拌30min,加入I. 2g,即5mmol的N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加熱回流5h，熒光增白劑CBS-X的酚羥基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；隨后將中間產物加入30倍的三氟乙酸(TFA)中，回流攪拌lh，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的熒光增白劑CBS-X的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反應，與牛血清白蛋白偶聯制備得到熒光增白劑CBS-X特異性抗原。在其中一個實施例中，上述步驟2)為以步驟I)中合成的熒光增白劑CBS-X特異性抗原作為免疫原對10周齡的Ba lb/c小鼠進行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐劑與熒光增白劑CBS-X特異性抗原溶液乳化，抗原濃度為O. 5mg/mL，劑量為100 μ g/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與熒光增白劑CBS-X特異性抗原溶液乳化，劑量同初次免疫；初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次,共免疫8-10次，當抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐劑直接用熒光增白劑CBS-X特異性抗原水溶液直接腹腔注射，劑量同初次免疫；尾部取血檢測血清效價；取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細胞按6:1比例與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株；并Balb/C小鼠，于一周 前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為O. 5mL/只；將細胞濃度為I. 5萬/mL的雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為O. 5mL/只；接種雜交瘤細胞6-10天后，收集腹水，反復收集數次；存于4°C冰箱保存；經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑CBS-X單克隆抗體。本發明的熒光增白劑CBS-X檢測原理為將熒光增白劑CBS-X特異性抗原吸附于固相載體上，加入樣品或熒光增白劑CBS-X的標準溶液及熒光增白劑CBS-X特異性抗體工作液，待測樣品中熒光增白劑CBS-X和固相載體上包被的熒光增白劑CBS-X特異性抗原競爭結合熒光增白劑CBS-X特異性抗體，孵育后，加入酶標二抗進行酶活性的放大作用，孵育，顯色后終止，測定樣品的吸光度，該值與樣品中熒光增白劑CBS-X的量呈負相關，與標準曲線比較即可得出熒光增白劑CBS-X濃度范圍。下面對前述技術方案的優點進行說明本發明的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，利用競爭酶聯免疫測定法檢測熒光增白劑CBS-X，具有特異性高，結果準確且前處理簡單，對儀器設備要求低、檢測成本低的特點。同時，本試劑盒中的試劑以工作液形式提供，操作簡單、快捷，為使用者節省了時間并減少因步驟復雜造成的誤差。適合用于快速而準確得檢測大批量樣品中的熒光增白劑CBS-X。
具體實施例方式下面對本發明的實施例進行詳細說明，但不對本發明的內容造成任何限制。實施例I本實施例所述的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒的主要組成成份如下I)熒光增白劑CBS-X特異性抗原工作液；通過以下方法制得將O. 186g,即I. Ommol的2_磺酸基苯甲醒、O. 20g,即I. OmmoI的2-磺酸基-5羥基-苯甲醛和O. 40g,即I. Ommol的熒光增白劑CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加熱5min，反應結束倒入水中，抽濾固體，得到帶有酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物；將O. 53g，即I. Ommo I的帶酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物和I. Olg,即IOmmol的碳酸鉀分散于8OmL干燥DMF中,常溫攪拌30min,加入I. 2g,即5mmol的N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加熱回流5h,突光增白劑CBS-X的酹輕基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；隨后將中間產物加入30倍的三氟乙酸(TFA)中，回流攪拌lh，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的熒光增白劑CBS-X的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺(NHS)和碳二亞胺(EDC)混合，與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌lh，偶聯制備熒光增白劑CBS-X特異性抗原，并用濃縮樣品稀釋液稀釋至濃度為2 μ g/mL。2)熒光增白劑CBS-X特異性抗體工作液；通過以下方法制得將合成得到的熒光增白劑CBS-X特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐劑與熒光增白劑CBS-X特異性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液乳化，抗原濃度為O. 5mg/mL，劑量為100 μ g/只，以后每 次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與熒光增白劑CBS-X特異性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液乳化，劑量同初次免疫。初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次，共免疫8-10次，當抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫。最后一次不加免疫佐劑直接用熒光增白劑CBS-X特異性抗原的O. 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液直接腹腔注射，劑量同初次免疫。尾部取血檢測血清效價。取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細胞按6:1比例與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合。采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株。單克隆抗體的制備與純化Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為O. 5mL/只。將細胞濃度為I. 5萬/mL的雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為O. 5mL/只。接種雜交瘤細胞6-10天后，收集腹水，反復收集數次。存于4 °C冰箱保存。經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化。具體方法每I份腹水中加入3份乙酸鈉緩沖液(濃度 O. 05mol/L, ρΗ4· 0)，用濃度 O. lmmol/L NaOH 調整 pH 至 4. 5，在 4°C下攪拌 30min，期間緩慢加入辛酸，按稀釋前腹水體積計算40 μ L/mL ;在4 靜止3h,離心(10140r/min, 30min),取上清液，保持在4°C環境中，30min內加入(NH4) 2S04使終濃度為O. 277g/mL,靜止lh，4V離心(10140r/min, 30min),棄上清液,得到單克隆抗體沉淀，并用濃縮樣品稀釋液稀釋至濃度為 2 μ g/mL。3)辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗；由商業公司提供的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗；4)熒光增白劑CBS-X標準品溶液6瓶；濃度分別為IX IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、
IX 10° μ g/L ；5)酶標板；96孔聚苯乙烯酶標板，由商業公司提供；6)底物顯色劑；由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為濃度為30%的過氧化氫水溶液，顯色劑B為濃度為10mg/mL的四甲基聯苯胺DMSO溶液；7)洗滌液；為含有重量比為(λ 05%-0. 5%吐溫-20的(λ 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；
8)終止液；為2mol/L的硫酸溶液；9)封閉液；為含5%脫脂奶粉的O. 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；10)濃縮樣品稀釋液；為O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(即磷酸根濃度為O. 01M/L，pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液)；11)自封袋；
由商業公司提供。實施例2間接競爭ELISA方法的建立。采用間接競爭ELISA法檢測熒光增白劑CBS-X單克隆抗體的競爭抑制率，方法如下I)用2 μ g/mL的熒光增白劑CBS-X特異性抗原包被96孔酶標板，100 μ L/孔，放置于4°C冰箱包被過夜，用250yL/孔封閉液(即5%脫脂奶粉)封閉后用洗滌液洗滌，并拍干;2)加入熒光增白劑CBS-X標準品溶液(濃度分別為1Χ105 μ g/L、I X IO4 μ g/L、
1X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、I X IO1 μ g/L、I X 10° μ g/L)或樣品溶液 50 μ L，再加入濃度為
2μ g/mL的熒光增白劑CBS-X特異性抗體工作液50 μ L，混合均勻，37°C溫育Ih ；3)洗滌拍干后，加入用稀釋液按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗工作液，100 μ L/孔，37°C溫育Ih ；4)洗漆拍干，每孔加入50 μ L顯色液B液、10 μ L顯色液A液顯色15mi η,加入濃度為2mol/L的硫酸溶液，50 μ L/孔，終止反應，設定酶標儀于450nm處(優選用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據)，測定OD值。以抑制率1%為縱坐標，以熒光增白劑CBS-X濃度的對數Ig[熒光增白劑CBS-X (ng/mL)]為橫坐標，繪制熒光增白劑CBS-X競爭抑制曲線。將樣品的抑制率代入標準曲線回歸方程，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中熒光增白劑CBS-X的實際含量。抑制率計算公式如下I =-— X I 00%
B, - Bs其中1-抑制率B——(樣本溶液的平均吸光度值)B0——(O μ g/L標準溶液的平均吸光度值)Bn——(參比空白對照平均吸光度值)實施例3試劑盒靈敏度、特異性、準確度。I.靈敏度測定。利用實施例2的間接競爭ELISA法測定結果建立熒光增白劑CBS-X檢測的標準工作曲線。熒光增白劑CBS-X單克隆抗體在I μ g/L IX 105μ g/L范圍內有良好的線性，IC 50=905. Ing/mL,最低檢測限為O. 553ng/mL,檢測范圍(抑制20% 80%之間)為4. 714ng/mL 1520. 113 μ g/mL。紙和塑料制品的檢測限為O. 277ng/cm2，食品樣品的檢測限為
O.277ng/g,日化產品的檢測限為50ng/g。2.特異性測定。采用實施例2的間接競爭ELISA法測定熒光增白劑CBS-X結構類似物(聯二苯、2-乙烯基苯磺酸鈉鹽、2-苯乙烯苯磺酸鈉鹽、2-聯二苯乙烯基苯磺酸鈉鹽)與單抗混合物的交叉反應。將系列濃度(1Χ107μ g/L、lX10V g/L、lX105y g/L、lX104y g/L、
IX IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、I X IO1 μ g/L)的上述物質分別與抗體同時加入到已包被封閉好的酶標板中，具體步驟同實施例2，分別計算各類似物的抑制率。利用單克隆抗體對熒光增白劑CBS-X的IC5tl值與單克隆抗體對各類似物的IC5tl值的比值得到交叉反應率(CR%)，公 式如下
類似物的IC5()值結果表明熒光增白劑CBS-X單克隆抗體與聯二苯、2-乙烯基苯磺酸鈉鹽、2-苯乙烯苯磺酸鈉鹽、2-聯二苯乙烯基苯磺酸鈉鹽的交叉反應率均檢測不到具體數值，為少于
O.05%。3.準確度測定。向空白紙制品、塑料制品和食品樣品中添加O. I μ g/mL和10 μ g/mL的突光增白劑CBS-X,日用產品樣品中添加100μ g/mL和1000 μ g/mL的熒光增白劑CBS-X，重復三次，每次做三個平行，采用實施例2的間接競爭ELISA法測定抑制率，然后將抑制率(三個平行的平均值)代入標準曲線回歸方程，算出含量，并計算回收率。回收率公式如下
回收率=f§§xioo%
添加值結果表明紙制品的回收率為87. 5% 103. 2%，塑料制品的回收率為90. 5% 99. 7%，食品的回收率為87. 5% 98. 2%,日用產品的回收率為86. 5% 95. 8%。實施例4檢測紙樣品中的熒光增白劑CBS-X的遷移。I.樣品的前處理。將紙制品測得面積后，按每平方厘米2mL的量注入蒸餾水，或采用全部浸泡的方法，其面積以紙制品的二面計算，在室溫(>20°C)浸泡2h后，取50 μ L進行分析。2.間接競爭ELISA法檢測樣品中熒光增白劑CBS-X的殘留。采用實施例2的方法進行檢測，根據測定結果，計算出抑制率，代入標準曲線方程求出熒光增白劑CBS-X的含量，見下表I。表I紙制品中熒光增白劑CBS-X的遷移量。
權利要求
1.一種熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，其特征在于，主要包括 1)包被熒光增白劑CBS-X特異性抗原的酶標板所述酶標板的每個微孔內熒光增白劑CBS-X特異性抗原的濃度為1-3 u g/mL ； 2)熒光增白劑CBS-X特異性抗體溶液該熒光增白劑CBS-X特異性抗體的濃度為1-3u g/mL ； 所述熒光增白劑CBS-X特異性抗原與熒光增白劑CBS-X特異性抗體溶液的用量比為I :Io
2.根據權利要求I所述的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，其特征在于，還包括有酶標二抗，所述酶標二抗是濃度按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗。
3.根據權利要求I或2所述的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光增白劑CBS-X特異性抗原的濃度為2 u g/mL ;所述熒光增白劑CBS-X特異性抗體的濃度為2u g/mL。
4.根據權利要求I所述的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，其特征在于，還包括熒光增白劑CBS-X標準品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。
5.根據權利要求4所述的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光增白劑CBS-X特異性抗體是鼠源單克隆抗體；所述熒光增白劑CBS-X特異性抗原為熒光增白劑CBS-X與載體蛋白的偶聯物；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述熒光增白劑CBS-X標準品溶液濃度分別為IX 105y g/L、IXlO4U g/L、IXlO3U g/L、IXlO2U g/L、IXlO1U g/L、I X IO0 u g/L ;所述顯色劑由顯色劑 A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；所述終止液為l-2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有0. 05%-0. 5%吐溫-20的0.01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0. 1M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為.01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述酶標板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。
6.一種熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟 1)制備包被熒光增白劑CBS-X特異性抗原的酶標板將2-磺酸基苯甲醛、2-磺酸基-5羥基-苯甲醛和熒光增白劑CBS-X分散于干燥DMSO中，加入哌啶，微波加熱，反應結束倒入水中，抽濾固體，得到帶有酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物；將帶酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物和碳酸鉀分散于干燥DMF中，常溫攪拌，加入N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加熱回流，熒光增白劑CBS-X的酚羥基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；隨后將中間產物加入三氟乙酸中，回流攪拌，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的熒光增白劑CBS-X的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反應，與載體蛋白偶聯制備得到熒光增白劑CBS-X特異性抗原，將熒光增白劑CBS-X特異性抗原包被于酶標板中，所述酶標板的每個微孔內熒光增白劑CBS-X特異性抗原的濃度為1-3 ii g/mL ； 2)制備熒光增白劑CBS-X特異性抗體以步驟I)中合成的熒光增白劑CBS-X特異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫；免疫后，取血清效價高的小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株；并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑CBS-X單克隆抗體；所述熒光增白劑CBS-X特異性抗體的濃度為1-3 u g/mL。
7.根據權利要求6所述的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒制備方法，其特征在于，步驟1)中，制備熒光增白劑CBS-X特異性抗原的具體方法為將0.186g的2-磺酸基苯甲醛、0.20g的2-磺酸基-5羥基-苯甲醛和0. 40g的熒光增白劑CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加熱5min，反應結束倒入水中，抽濾固體，得到帶有酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物；將0. 53g的帶酚羥基的熒光增白劑CBS-X衍生物和I. Olg的碳酸鉀分散于80mL干燥DMF中，常溫攪拌30min,加入I. 2g的N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加熱回流5h，熒光增白劑CBS-X的酚羥基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；隨后將中間產物加入30倍的三氟乙酸中，回流攪拌lh，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的熒光增白劑CBS-X的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反應，與牛血清白蛋白偶聯制備得到熒光增白劑CBS-X特異性抗原。
8.根據權利要求6所述的熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒制備方法，其特征在于，步驟2)為 以步驟I)中合成的熒光增白劑CBS-X特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐劑與熒光增白劑CBS-X特異性抗原溶液乳化，抗原濃度為0. 5mg/mL，劑量為IOOy g/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與熒光增白劑CBS-X特異性抗原溶液乳化，劑量同初次免疫；初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次，共免疫8-10次，當抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐劑直接用熒光增白劑CBS-X特異性抗原水溶液直接腹腔注射，劑量同初次免疫；尾部取血檢測血清效價；取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細胞按6:1比例與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株；并Ba lb/C小鼠，于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為0. 5mL/只；將細胞濃度為I. 5萬/mL的雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為0. 5mL/只；接種雜交瘤細胞6-10天后，收集腹水，反復收集數次；存于4°C冰箱保存；經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的熒光增白劑CBS-X單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒，屬于添加劑檢測技術領域。該試劑盒包括每個微孔內包被濃度為1-3μg/mL熒光增白劑CBS-X特異性抗原的酶標板，濃度為1-3μg/mL的熒光增白劑CBS-X特異性抗體，且所述熒光增白劑CBS-X特異性抗原與熒光增白劑CBS-X特異性抗體溶液的用量比為11。本發明還公開了一種熒光增白劑CBS-X檢測試劑盒制備方法。本發明的試劑盒在檢測熒光增白劑CBS-X時可一次連續檢測多個樣品，具有便捷，快速，靈敏、成本低的特點。適合用于快速而準確得檢測大批量樣品中的熒光增白劑CBS-X。
文檔編號G01N33/543GK102798712SQ20121028173
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者冼燕萍, 郭新東, 羅海英, 侯向昶, 吳玉鑾, 鄧龍, 羅東輝, 柯振華 申請人:廣州市質量監督檢測研究院