專利名稱：雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法及其應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
雞毒支原體是家禽最常見的病原菌之一。該病在規模化雞場中經常緩慢流行，給養雞業造成的主要損失是發病雞群的死淘率明顯上升；肉雞和生長雞的發育受阻、飼料報酬降低；產蛋雞的產蛋下降；隨著我國養雞業集約化程度的提高，雞毒支原體的流行勢頭愈加猛烈，繼發感染其他疾病，近年來常有呼吸道疾病混合感染為主的疾病致使大量雞死亡，且抗生素的頻繁使用，使得耐藥性增強，給本病的防治帶來很大的困難，因此對該病的預防也越來越重要。目前在生產中廣泛應用滅活疫苗免疫是控制雞毒支原體的有效辦法。檢驗疫苗效力的方法是免疫攻毒保護試驗，判斷氣囊病變積分情況。上述實驗評價結果時常因主觀因素偏差造成檢驗結果常有誤差，并且強毒攻擊也存在生物安全隱患，易散毒。本發明可用血清學測抗體效價的方法替代本動物攻毒試驗，結果客觀、準確、重復性強、操作簡單，安全可靠，具有普遍推廣的意義。
發明內容
有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法，包括如下步驟:I)用雞毒支原體滅活疫苗免疫雞后25-35天后采血并分離血清；2)用血清學方法(ELISA方法或HI方法)測定血清的抗體效價替代免疫攻毒保護。優選地，本發明所述雞毒支原體滅活疫苗免疫方法為皮下注射或肌肉注射。優選地,本發明所述免疫劑量為I羽份，每羽份的量為0.2ml 0.6ml。更優選地，本發明所述MG抗體ELISA(ELISA，MG Ab)試劑盒為美國IDEXX公司生產(試劑包括:包被的微量反應板、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶標二抗、底物溶液和終止液)，購自北京愛德士世紀元亨有限公司。ELISA檢測方法按IDEXX MG抗體ELISA(ELISA,MG Ab)試劑盒方法進行。優選地，本發明所述血凝抑制效價的測定方法，包括如下步驟:I)雞毒支原體血球凝集試驗:HA抗原二倍系列稀釋。將30 μ I雞紅細胞懸液加入含有30μ I稀釋抗原的反應孔內，充分振蕩，在室溫靜置30min，判定結果時將反應板傾斜與水平呈45°C角，對照孔內和HA陰性孔的紅細胞完全沉淀到孔底中心，呈淚珠樣流淌；HA陽性孔的紅細胞均勻分布在孔底或呈鋸齒樣凝集，使紅細胞凝集的最大稀釋倍數為該抗原的HA效價；2)雞毒支原體血凝抑制試驗:在96孔V型微量反應板，每行第I孔開始，每孔加入30μ I稀釋液至12孔，分別在1、11孔加入待檢血清30 μ 1，從第一孔開始倍比稀釋血清至第10孔，棄去30 μ 1，向I 11孔加入4ΗΑ單位抗原30 μ 1，充分振蕩，37°C溫箱靜置15min，每孔加入1% V/V雞紅細胞懸液30 μ 1，輕輕混勻，室溫靜置30min，判定結果時將反應板傾斜45°C角，紅細胞完全沉淀到孔底中心呈淚珠樣流淌為HI陽性，紅細胞均勻分布在孔底不流動者為HI陰性，完全抑制紅細胞凝集的最高稀釋倍數為待檢血清的HI抗體效價。優選地，本發明所述免疫后的血清ELISA抗體水平，S/P值> 0.6時，疫苗判為合格。優選地，本發明所述免疫后的血清HI抗體水平，HI值> 4Log2時，疫苗判為合格。更優選地，本發明所述免疫后的血清HI抗體水平、ELISA抗體水平和免疫攻毒保護率二者相互之間均呈正相關。優選地，本發明所述方法不但在雞毒支原體滅活疫苗單苗中使用，而且在雞毒支原體滅活疫苗所有聯苗中也可使用。本發明的另一方面在于本發明所述雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法在雞毒支原體滅活疫苗的質量控制中的應用。優選地,本發明所述疫苗的質量控制包括免疫攻毒保護率、疫苗質量標準的確定、免疫期限的測定和臨床監測。技術效果首先，本發明采用了血清學的方法替代免疫攻毒保護的方法來評價疫苗的免疫效力。該方法減少免后攻毒看氣囊病變積分的主觀性及避免散毒，結果準確、重復性強、批間差異小。其次，本發明檢測方法不但在雞毒支原體滅活疫苗單苗中使用，而且在雞毒支原體滅活疫苗所有聯苗中也可使用。該方法的建立為雞毒支原體滅活疫苗聯苗的研制開辟了綠色通道。最后，本發明首次公開了血清學方法測定雞毒支原體滅活疫苗抗體效價跟免疫攻毒保護之間存在相關性。該方法為本病的免疫攻毒保護、疫苗質量標準的確定、免疫期限的測定和臨床監測等提供了強有力的科學依據，對現實生產有重要的指導意義。
具體實施例方式實施例1雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法一、疫苗免疫用40日齡SPF雞20只，其中10只頸背部皮下或大腿部肌肉注射免疫I羽份，另10只不免疫作對照。30天后采血，分離血清，測定ELISA抗體水平或HI抗體效價。二、雞毒支原體酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和血凝抑制(HI)試驗1、雞毒支原體ELISA試驗購買MG抗體ELISA (ELISA，MG Ab)試劑盒:美國IDEXX公司生產(試劑包括:包被的微量反應板、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶標二抗、底物溶液和終止液)，北京愛德士世紀元亨有限公司。ELISA檢測方法按IDEXX MG抗體ELISA (ELISA，MG Ab)試劑盒方法進行。2、雞毒支原體血凝抑制(HI)試驗:I)、雞毒支原體HI抗原血球凝集價測定(I)吸取30 μ I濃度為0.0ImoI/LpH為7.2的PBS,加到V型微量反應板各孔；
(2)取30 μ I μ μ雞毒支原體抗原加入反應板第一孔中，并做4孔重復；(3)將30 μ I抗原在反應板上橫向作2倍倍比稀釋；(4)各孔加入30 μ I的1% (V/V)雞紅細胞；(5)用微量振蕩器混勻，室溫靜置30min。直到紅細胞對照孔完全沉淀為止。以使100%紅細胞凝集的抗原最高稀釋倍數作為判定終點，表示一個血球凝集單位(1HA單位)。2)、4HA單位抗原的配制根據測定的抗原血球凝集(HA)效價，用PBS配制4HA單位抗原:(I)將配置好的4HA單位抗原用PBS稀釋，使4HA單位抗原的稀釋度為1: 2、1: 3、1: 4、1: 5、1: 6、1: 7 ;(2)在每一稀釋度的30 μ I抗原中加30 μ IPBS ；(3)再加入30 μ I的I % (V/V)雞紅細胞，混勻，室溫靜置30min后判定結果；(4)結果判定如果1: 4稀釋為100%紅細胞凝集終點，表明配制的是4HA單位抗原；如果100%紅細胞凝集終點是1: 5或1: 6則表明配制的4HA單位抗原實際上是高于4個單位；如果100%紅細胞凝集終點是1: 2或1: 3則表明配制的4HA單位抗原實際上是低于4個單位。應當適當的調整使抗原工作液為4HA單位。3)、血凝抑制試驗(I)取96孔V型微量反應板，每孔加入30 μ IPBS ；(2)分別吸取30 μ I待檢血清，加至每塊板的第一排各相應孔內，并在每塊板上設標準陽性血清和陰性血清對照，然后2倍系列稀釋；(3)分別向各孔中加入含4ΗΑ單位的抗原30 μ 1，充分振蕩，37°C溫箱靜置15min ；(4)每孔加入I %雞紅細胞懸液30 μ 1，輕輕混勻，室溫靜置30min ；(5)結果判定將反應板傾斜45°C角，凡血清反應孔與紅細胞對照孔中紅細胞以同樣速度從孔底流淌者判為血球凝集抑制。當陰性血清HI效價≤ 2Log2、陽性血清HI效價與規定效價相比誤差< lLog2時，實驗方可成立。三、疫苗評價1、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)結果S/P值≥0.6時，疫苗判為合格；2、血凝抑制試驗HI抗體水平，HI值≥4Log2時，疫苗判為合格。實施例2雞毒支原體滅活疫苗免疫試驗動物的血清抗體效價與攻毒保護率之間的平行關系用3批疫苗，每批將60只40日齡的SPF雞分為6組，每組10只，其中50只按照20 μ 1、50μ 1、200μ 1、300μ 1、500μ I進行頸背部皮下或大腿部肌肉注射免疫，另10只不免疫作對照。30天后采血，分離血清，測定ELISA抗體水平或HI抗體水平。同時連同對照雞10只，在2 3m3的密室(室內溫度為15°C 30°C，相對濕度為50% 70% )內噴霧攻擊雞毒支原體R株培養物500 600mL (每1.0ml含活菌數108 9CXU顏色變化單位)，噴霧持續時間應不少于5分鐘，霧滴在2.0ym左右，觀察14日，剖檢，觀察氣囊病變，并進行病變記分。對照組應至少有4只雞的氣囊出現2分以上的病變，免疫雞的平均氣囊保護率應在60%以上，計算攻毒保護率。結果如下表I。
表I雞毒支原體滅活疫苗不同免疫劑量免疫抗體與攻毒保護率相關性
權利要求
1.種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法及其應用，其特征在于:包括如下步驟: 1)用雞毒支原體滅活疫苗免疫雞后25 35天后采血并分離血清； 2)用血清學方法(ELISA方法或HI方法)測定血清的抗體效價替代免疫攻毒保護。
2.據權利要求1所述方法，其特征在于，所述雞毒支原體滅活疫苗免疫方法為皮下注射或肌肉注射。
3.據權利要求1所述方法，其特征在于，所述免疫劑量為I羽份，每羽份的量為0.2ml 0.6ml。
4.據權利要求1所述方法，其特征在于，所述MG抗體ELISA(ELISA，MGAb)試劑盒為美國IDEXX公司生產(試劑包括:包被的微量反應板、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶標二抗、底物溶液和終止液)，購自北京愛德士世紀元亨有限公司。ELISA檢測方法按IDEXXMG抗體ELISA(ELISA，MGAb)試劑盒方法進行。
5.據權利要求1所述方法，其特征在于，所述血凝抑制效價的測定方法，包括如下步驟: I)雞毒支原體血球凝集試驗:HA抗原二倍系列稀釋。將30ul雞紅細胞懸液加入含有30ul稀釋抗原的反應孔內，充分振蕩，在室溫靜置30min，判定結果時將反應板傾斜與水平呈45°C角，對照孔內和HA陰性孔的紅細胞完全沉淀到孔底中心，呈淚珠樣流淌；HA陽性孔的紅細胞均勻分布在孔底或呈鋸齒樣凝集，使紅細胞凝集的最大稀釋倍數為該抗原的HA效價；2)雞毒支原體血凝抑制試驗:在96孔V型微量反應板，每行第I孔開始，每孔加入30ul稀釋液至12孔，分別在1、11孔加入待檢血清30ul，從第一孔開始倍比稀釋血清至第10孔，棄去30ul，向I 11孔加入4HA單位抗原30ul，充分振蕩，37°C溫箱靜置15min，每孔加入1% V/V雞紅細胞懸液30ul，輕輕混勻，室溫靜置30min，判定結果時將反應板傾斜45°C角，紅細胞完全沉淀到孔底中心呈淚珠樣流淌為HI陽性，紅細胞均勻分布在孔底不流動者為HI陰性，完全抑制紅細胞凝集的最高稀釋倍數為待檢血清的HI抗體效價。
6.據權利要求1所述的雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法，其特征在于，免疫后的血清ELISA抗體水平，S/P值≥0.6時，疫苗判為合格。
7.據權利要求1所述的雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法，其特征在于，免疫后的血清HI抗體水平，HI值> 4Log2時，疫苗判為合格。
8.據權利要求1所述的雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法，其特征在于，免疫后的血清HI抗體水平、ELISA抗體水平和免疫攻毒保護率三者相互之間均呈正相關。
9.據權利要求1所述方法，其特征在于，所述方法不但在雞毒支原體滅活疫苗單苗中使用，而且在雞毒支原體滅活疫苗所有聯苗中也可使用。
10.據權利要求1所述方法，其特征在于，所述方法在雞毒支原體滅活疫苗的質量控制中的應用。
11.據權利要求10所述方法，其特征在于，所述疫苗的質量控制包括免疫攻毒保護率、疫苗質量標準的確定、免疫期限的測定和臨床監測。
全文摘要
本發明涉及獸用生物制品技術領域。公開了一種雞毒支原體滅活疫苗的效力檢驗方法，同時本發明還可應用于疫苗的質量控制，具體包括免疫攻毒保護率、疫苗質量標準的確定、免疫期限的測定和臨床監測。實驗證實發明使用血清學檢測方法(包括ELISA和HI)替代本動物攻毒試驗，方法簡便、快速、結果準確、重復性強、特異性強，該方法的建立減少免后攻毒看氣囊病變積分的主觀性及避免散毒，也為建立合理的免疫程序提供依據，具有普遍推廣的意義。
文檔編號G01N33/543GK103091484SQ201210279128
公開日2013年5月8日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者丁美娟, 王偉, 尹秀鳳, 黃顯明, 許秀梅, 孫*, 汪愛芬, 吳娟, 張海濤, 徐延偉, 薛家賓, 張小飛 申請人:南京天邦生物科技有限公司