專利名稱：銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法及應用。具體是基于Ag-Fe3O4納米復合材料構建的檢測多種抗生素的無標記型電化學免疫傳感器，屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術領域。
背景技術：
抗生素是抵抗致病微生物的藥物，是由微生物(包括細菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產物，能干擾其它生活細胞發育功能的化學物質。常用的抗生素有微生物培養液中提取物以及用化學方法合成或半合成的化合物，·分為以下幾類盧-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、氯霉素類、大環內酯類、抗真菌抗生素等。抗生素可作為促進畜禽生長的飼料添加劑，或作為預防和治療畜禽疾病的獸藥，在乳業中用于提高奶牛產奶量；在水產養殖業用于治療多種魚類疾病；在養蜂業用于預防蜜蜂的感染性疾病。但過量使用不可避免使母體、代謝產物等相關抗生素殘留于食源性動物的肌肉、奶、蛋、臟器組織中，通過食物鏈影響人類健康。鑒于抗生素的作用與危害并存，抗生素的殘留問題格外受到關注。目前對抗生素殘留量的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)及微生物法(MA)等，但是這些檢測方法存在如下不足。I.高效液相色譜法包括液-液分配色譜法、液-固色譜法以及離子交換色譜法等，此類檢測方法雖然分析效率高，靈敏度高，但液相色譜儀價格及日常維護費用貴，分析時間長。2.液相色譜-串聯質譜法檢測限低，定性定量準確，重現性好，但是儀器設備復雜、操作過程繁瑣，對檢驗人員的操作技能要求很高，且不適于現場檢測和快速檢測。3.微生物法手續繁多，分析速度慢且結果誤差較大。為了解決上述問題，本發明采用電化學免疫傳感器檢測抗生素，在傳感器的制備過程中材料的選擇極其重要。介孔材料作為一種功能材料，由于其獨特的物理化學性質，使其在物理、化學等方面表現出特殊用途。其中四氧化三鐵作為介孔材料的一種，由于其制備工藝簡單、價格低、性能穩定、比表面積大等，成為組裝電化學免疫傳感器的良好材料。銀納米粒子具有比表面積大、表面反應活性高、催化效率高、吸附能力強以及良好的生物相容性和穩定性等優點，可用于固載和標記生物分子。將四氧化三鐵介孔材料和銀納米粒子合成得到Ag-Fe3O4復合材料，既保留了兩者的優點，又體現出優異的協同增敏效果，同時提高了其電極表面的電子傳遞效率，從而增強了電化學免疫傳感器的檢測靈敏度。經對現有專利技術的檢索發現，CN201010210144. I公開了一種用于檢測食品中青霉素的電化學免疫傳感器，該發明線性范圍寬，檢測限為I ngiL—1 (即I ppb)。CN200410013741. X公開了一種用pH計檢測牛奶中青霉素的方法，該發明是依據溶液的酸度變化來檢測牛奶中是否含有抗生素，方法簡便快速，其檢測限為6 ppb。本發明對多種抗生素的檢測限在0.015 0.017 Wkg-1 (即0.015 0.017ppb)范圍。由此看出，將Ag-Fe3O4復合材料引入傳感器的制備中，顯著降低了傳感器的檢測限，對抗生素檢測的靈敏度均優于以上兩種方法。CN200610130646. 7和CN200810052119. 8公開了兩種基于表面等離子體共振檢測
抗生素的方法，該方法具有測定時間短、精密度高、特異性好等優點，但儀器設備昂貴。本發明采用Ag-Fe3O4復合材料制備了一種無標記型免疫傳感器，是一種低成本、·高靈敏、特異性好、快速檢測多種抗生素的技術，且制備過程簡單，完成一個檢測過程需要2-3分鐘，有效克服了目前抗生素檢測方法的不足。
發明內容
本發明的目的之一是避免傳統檢測方法的儀器設備復雜、操作過程繁瑣及對檢驗人員的高技能要求的缺點，提供一種低成本的抗生素電化學免疫傳感器的制備方法。本發明的目的之二是將該抗生素電化學免疫傳感器應用于抗生素的檢測。本發明的技術方案如下
I.本發明的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是包括以下步驟
(1)硫堇-石墨烯混合溶液的制備；
(2)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備；
(3)電化學免疫傳感器的制備。( I)中所述的硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將殼聚糖加入到體積分數為1%的醋酸中攪拌2h，制得質量分數0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將硫堇加入到質量分數為0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg ml/1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將石墨烯加入到質量分數為0.3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液II和溶液I按體積比I: I 5混合并超聲30 min。(2)中所述的Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合3 5 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應釜中加熱6 8 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2)Ag-Fe304復合材料的制備介孔Fe3O4和AgNO3按質量比I: 0. 5 I. 5加入到超純水中，震蕩20 30 h，然后加入新配制的50 mmol L—1 NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調節pH小于2，震蕩20 40 min，用超純水洗至pH等于7，磁力分離得到Ag-Fe3O4復合材料；
3)孵化溶液的配制將適量Ag-Fe3O4復合材料加入到超純水中，超聲20 40min，得到I 3 mg mL—1孵化溶液；
4)Ag-Fe304-抗生素抗體的制備在4V條件下,將I mL孵化溶液加入到400 y L體積分數2. 5%的戊二醛中，震蕩I 2 h，磁力分離去除上清液，加入10 UL 10 u g mr1抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩20 30 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)中所述的電化學免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處 理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在
—0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將6 8ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥；
3)滴涂6ML體積分數為2. 5%的戊二醛溶液，4 °C冰箱中濕潤條件下保存2 h，超純水清洗，晾干成膜；
4)滴涂6ML Ag-Fe3O4-抗生素抗體，4 V冰箱中保存至干燥；
5)滴涂3UL 100牛血清白蛋白，4 °C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，制得抗生素電化學免疫傳感器。2.本發明所述的制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，用于抗生素檢測，其特征是包括以下步驟
(1)工作曲線的繪制；
(2)抗生素的檢測。(I)中所述的工作曲線的繪制，步驟如下
1)將制備好的抗生素電化學免疫傳感器作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統，結合電化學工作站，在PH為6. 5 8. 5磷酸緩沖液中，用方波伏安法(SWV)在一 0.6 0.6 V電壓范圍內測定，記錄響應電流Z0 ;
2)用水沖洗步驟I)中的工作電極，將配制好的不同濃度的抗生素標準溶液分別滴涂到不同工作電極表面，4 V冰箱中保存至干燥；
3)分別將步驟2)修飾的工作電極執行步驟I)所述的測定過程，此時的響應電流記為
Ii ;
4)根據步驟I)和步驟3)所得的電流差值AJ=I0-Ii與抗生素標準溶液濃度之間的線性關系，繪制工作曲線。3.本發明所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，其特征是所述的抗生素是內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類或大環內酯類；
所述的內酰胺類選自下列之一青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、氨芐西林、雙氯青
霉素；
所述的氨基糖苷類選自下列之一鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、壯觀霉素、丁胺卡那霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素；
所述的四環素類選自下列之一四環素、土霉素、金霉素、強力霉素、二甲胺四環素、甲烯土霉素；
所述的大環內酯類選自下列之一紅霉素、螺旋霉素、林可霉素、克林霉素、竹桃霉素、吉它霉素、泰樂霉素。本發明的有益成果
(1)電化學免疫傳感器制備方法，利用納米材料的增效作用和兩種納米材料的協同增敏作用，使制得的傳感器具有更高的靈敏度；
(2)介孔Fe3O4制備工藝簡單，價格低，導電性好，高的磁飽和度可以放大信號，使制得的傳感器易于推廣；
(3)將表面層層修飾技術應用到電化學免疫傳感器的制備中，使納米介孔材料增效的抗生素電化學免疫傳感器的制備具有可控性，顯著提高了電化學免疫傳感器的靈敏度、穩定性和準確性；·
(4)電化學免疫傳感器檢測抗生素的方法，可以實現特異性、高靈敏和快速檢測。
圖I為銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素電化學免疫傳感器的制備過程。
具體實施例方式實施例I
銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，包括以下步驟。( I)硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將0.15 g殼聚糖加入到50 mL體積分數為1%的醋酸中攪拌2h，制得質量分數0. 3%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將12 mg硫堇加入到4 mL質量分數為0. 3%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 mg mL—1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將12mg石墨烯加入到4 mL質量分數為
0.3%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液I和溶液II按體積比2:1混合并超聲30 min。(2) Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
I)介孔Fe3O4的制備將I g FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合3 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應釜中加熱6 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2Mg-Fe3O4復合材料的制備20 mg介孔Fe3O4和10 mg AgNO3加入到20 mL超純水中，震蕩20 h，然后加入新配制的50 mmol ^r1NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調節pH小于2，震蕩20 min，用超純水洗至pH為7，磁力分離得到Ag-Fe3O4復合材料；
3)孵化溶液的配制將4 mg Ag-Fe3O4復合材料加入到4 mL超純水中,超聲20 min,得到I mg mL-1孵化溶液；4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備:在4 V條件下，將I mLl mg mL-1孵化溶液加入到400 UL體積分數2. 5%的戊二醛中，震蕩I h，磁力分離去除上清液，加入10 UL 10U g mL—1抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩20 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)根據圖I進行抗生素電化學免疫傳感器的制備，步驟如下 I)將直徑4 mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將6 ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯；
3)將6UL體積分數2. 5%的戊二醛滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯上，4 0C冰箱中濕潤狀態下保存2 h之后再在室溫下干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛；
4)將6UL Ag-Fe3O4-抗生素抗體滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛上，4 V冰箱中保存至干燥得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體；
5)將3u L 100 Mg mL—1牛血清白蛋白滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戍二醒/Ag-Fe3O4-抗生素抗體上，4 V冰箱中保存至干燥，用超純水清洗，晾干成膜得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體/牛血清白蛋白，制得抗生素電化學免疫傳感器。實施例2
銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，包括以下步驟。( I)硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將0.25 g殼聚糖加入到50 mL體積分數為1%的醋酸中攪拌2h，制得質量分數0. 5%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將8 mg硫堇加入到2 mL質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到4 mg mL—1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將8mg石墨烯加入到2 mL質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到4 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液I和溶液II按體積比3: I混合并超聲30 min。(2) Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合4 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應釜中加熱7 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2)Ag-Fe3O4復合材料的制備30 mg Fe3O4和30 mg AgNO3加入到30 mL超純水中，震蕩24 h，然后加入新配制的50 mmol -L^1 NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調節pH小于2,震蕩30 min,用超純水洗至pH等于7,磁力分離得到Ag-Fe3O4復合材料；
3)孵化溶液的配制將4mg Ag-Fe3O4復合材料加入到2 mL超純水中,超聲30 min,得到2 mg mL-1孵化溶液；
4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備在4 V條件下，將I mL2 mg mL4孵化溶液加入到400 UL體積分數2. 5%的戊二醛中，震蕩1.5 h，磁力分離去除上清液，加入10 UL10 ygmr1抗生素抗體，再加入I mL pH=7. 4磷酸緩沖液，震蕩24 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH=7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)根據圖I進行抗生素電化學免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將7ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯；· 3)將6UL體積分數2. 5%的戊二醛滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯上，4 0C冰箱中濕潤狀態下保存2 h之后再在室溫下干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛；
4)將6UL Ag-Fe3O4-抗生素抗體滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛上，4 V冰箱中保存至干燥得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體；
5)將3u L 100 Mg mL—1牛血清白蛋白滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戍二醒/Ag-Fe3O4-抗生素抗體上，4 V冰箱中保存至干燥，用超純水清洗，晾干成膜得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體/牛血清白蛋白，制得抗生素電化學免疫傳感器。實施例3
銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，包括以下步驟。( I)硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將0.35 g殼聚糖加入到50 mL體積分數為1%的醋酸中攪拌2h，制得質量分數0. 7%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制取15 mg硫堇加入到3 mL質量分數為0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到5 mg mL—1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制取15mg石墨烯加入到3 mL質量分數為
0.7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到5 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液I和溶液II按體積比5: I混合并超聲30 min。(2) Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合5 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應釜中加熱8 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2)Ag-Fe3O4復合材料的制備20 mg Fe3O4和30 mg AgNO3加入到30 mL超純水中，震蕩30 h，然后加入新配制的50 mmol ^r1NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調節pH小于2,震蕩40 min,用超純水洗至pH等于7,磁力分離得到Ag-Fe3O4復合材料；3)孵化溶液的配制將6mg Ag-Fe3O4復合材料加入到2 mL超純水中,超聲40 min,得到3 mg mL-1孵化溶液；
4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備在4 V條件下，將I mL3 mg mL4孵化溶液加入 到400 UL體積分數2. 5%的戊二醛中，震蕩2 h，磁力分離去除上清液，加入10 u L
10 Ug 抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩30 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)根據圖I進行抗生素電化學免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；· 2)將8ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯；
3)將6UL體積分數2. 5%的戊二醛滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯上，4 0C冰箱中濕潤狀態下保存2 h之后再在室溫下干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛；
4)將6UL Ag-Fe3O4-抗生素抗體滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛上，4 V冰箱中保存至干燥得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體；
5)將3u L 100 Mg mL—1牛血清白蛋白滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戍二醒/Ag-Fe3O4-抗生素抗體上，4 V冰箱中保存至干燥，用超純水清洗，晾干成膜得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體/牛血清白蛋白，制得抗生素電化學免疫傳感器。實施例4
實施例I 3制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，分別用于抗生素檢測，步驟如下。I)將制備好的抗生素電化學免疫傳感器作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統，結合電化學工作站，在PH為6.5 8.5磷酸緩沖液中，用方波伏安法(SWV)在一 0.6 0.6 V電壓范圍內測定，記錄響應電流To。2)用水沖洗步驟I)中的工作電極，將配制好的不同濃度的抗生素標準溶液分別滴涂到不同工作電極表面，4 V冰箱中保存至干燥。3)分別將步驟2)修飾的工作電極執行步驟I)所述的測定過程，此時的響應電流記為I1O4)根據步驟I)和步驟3)所得的電流差值AJ= I0-Ii與抗生素標準溶液濃度之間的線性關系，繪制工作曲線。5)將步驟2)中的標準溶液更換為被檢測的樣品溶液，重復步驟2)和步驟3)，根據滴涂樣品溶液前后響應電流的變化值△/和工作曲線，得到樣品溶液中某種抗生素的含量。實施例5(盧-內酰胺類青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、氨芐西林或雙氯青霉素) 一種內酰胺類抗生素電化學免疫傳感器的制備方法及應用，包括以下步驟。( I)選擇能特異性識別3 -內酰胺類抗生素的抗體，按照實施例I所述的步驟制備電化學免疫傳感器。
(2)按照實施例4所述的步驟進行檢測。3 -內酰胺類抗生素的檢測技術指標對比結果見表I。表I盧-內酰胺類抗生素的檢測技術指標對比結果
權利要求
1.銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是包括以下步驟 (1)硫堇-石墨烯混合溶液的制備； (2)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備； (3)電化學免疫傳感器的制備。
2.根據權利要求I所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是所述的硫堇-石墨烯混合溶液的制備，包括以下步驟 (1)殼聚糖溶液的配制將殼聚糖加入到體積分數為1%的醋酸中攪拌2h，制得質量分數0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液； (2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將硫堇加入到質量分數為0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg ml/1的溶液I ; (3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將石墨烯加入到質量分數為0.3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg mL—1的溶液II ； (4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液HI)的配制將溶液II和溶液I按體積比I: I 5混合并超聲30 min。
3.根據權利要求I所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是所述的Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，包括以下步驟 (1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 *6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合3 5 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應釜中加熱6 8 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ； (2)Ag-Fe3O4復合材料的制備介孔Fe3O4和AgNO3按質量比I : 0. 5 I. 5加入到超純水中，震蕩20 30 h，然后加入新配制的50 mmol ^IZ1NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調節pH小于2，震蕩20 40 min，用超純水洗至pH等于7，磁力分離得到Ag-Fe3O4復合材料； (3)孵化溶液的配制將適量Ag-Fe3O4復合材料加入到超純水中，超聲20 40min，得到I 3 mg mL—1孵化溶液； (4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備在4 V條件下,將I mL孵化溶液加入到400 u L體積分數2. 5%的戊二醛中，震蕩I 2 h，磁力分離去除上清液，加入10 UL 10 u g -mr1抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩20 30 h，然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。
4.根據權利要求I所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是 所述的電化學免疫傳感器的制備，包括以下步驟 (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ； (2)將6 8ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥； (3)滴涂6ML體積分數為2. 5%的戊二醛溶液，4 °C冰箱中潤濕條件下保存2 h，超純水清洗，晾干成膜；(4)滴涂6ML Ag-Fe3O4-抗生素抗體，4 V冰箱中保存至干燥； (5)滴涂3UL 100牛血清白蛋白，4 V冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，制得抗生素電化學免疫傳感器。
5.根據權利要求I 4所述的制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，其特征是用于抗生素的檢測，包括以下步驟 (1)工作曲線的繪制； (2)抗生素的檢測。
6.根據權利要求5所述的制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，用于抗生 素的檢測，其特征是所述工作曲線的繪制，包括以下步驟 (1)將制備好的抗生素電化學免疫傳感器作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統，結合電化學工作站，在PH為6. 5 8. 5磷酸緩沖液中，用方波伏安法(SWV)在一 0.6 0.6 V電壓范圍內測定，記錄響應電流Z0 ; (2)用水沖洗步驟(I)中的工作電極，將配制好的不同濃度的抗生素標準溶液分別滴涂到不同工作電極表面，4 V冰箱中保存至干燥； (3)分別將步驟(2)修飾的工作電極執行步驟(I)所述的測定過程，此時的響應電流記為Ij ； (4)根據步驟(I)和步驟(3)所得的電流差值AJ=A-Ji與抗生素標準溶液濃度之間的線性關系，繪制工作曲線。
7.根據權利要求I 6所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，其特征是所述的抗生素是內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類或大環內酯類； 所述的內酰胺類選自下列之一青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、氨芐西林、雙氯青霉素； 所述的氨基糖苷類選自下列之一鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、壯觀霉素、丁胺卡那霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素； 所述的四環素類選自下列之一四環素、土霉素、金霉素、強力霉素、二甲胺四環素、甲烯土霉素； 所述的大環內酯類選自下列之一紅霉素、螺旋霉素、林可霉素、克林霉素、竹桃霉素、吉它霉素、泰樂霉素。
全文摘要
本發明公開了銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法及應用。電化學免疫傳感器制備方法是在玻碳電極表面修飾硫堇-石墨烯混合溶液，通過戊二醛交聯Ag-Fe3O4介孔納米粒子孵化的抗生素抗體，并以牛血清白蛋白封閉非特異性活性位點，制備成一種抗生素電化學免疫傳感器。抗生素的檢測方法是將參比電極—飽和甘汞電極、對電極—鉑絲電極及工作電極正確連接在電化學工作站上，通過方波伏安法進行免疫檢測。本發明的抗生素電化學免疫傳感器具有較高的靈敏度和專一性，檢測方法簡單，完成一個檢測過程需要2-3分鐘，具有快速高效、特異性好、成本低、操作簡便等特點。
文檔編號G01N33/53GK102749442SQ201210261179
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者于海琴, 于淑君, 吳丹, 孫蒙, 張勇, 曹偉, 朱寶存, 李玉陽, 李賀, 杜斌, 王志玲, 羅川南, 閆良國, 馬洪敏, 魏琴 申請人:濟南大學