專利名稱：莪術醇單克隆抗體在含莪術醇類中藥中的免疫分析應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及莪術醇單克隆抗體，及應用酶聯免疫吸附分析法(ELISA)對中藥中的莪術醇進行定性與定量分析。
背景技術：
單克隆抗體技術是現代生命科學研究的重要工具，在基因和蛋白質的結構和功能研究方面有著不可或缺的作用。在農業科學、食品科學、環境保護、生態學及法醫學等領域的應用也有很大的進展，亦可用于以單抗為彈頭的“生物導彈”藥物。單克隆抗體可用于分析抗原的細微結構及檢驗抗原抗體未知的結構關系；生產出針對復雜生物混合物中的特定分子的抗體，可用于分離、分析及純化該特定分子抗原；其試劑可用于臨床診斷和治療。隨著人們對單克隆抗體認識的深入，這一技術被逐漸應用到食品、轉基因動物和植物、植物病毒學等方面，但在天然藥物研究領域中的應用國內鮮有報道。以單克隆抗體為基礎的酶聯免疫分析法以其靈敏、精確、迅速和簡便等特點，可用于天然產物活性成分的檢識與含量測定，另外還可用于天然藥物有效成分的分離與純化、藥物代謝動力學研究、質量監控、新藥篩選以及擴大藥用植物資源，對于天然藥物的開發和利用、加速中醫藥現代化的進程有著重要的意義。目前日本、泰國、韓國已開展針對中藥活性成分的免疫分析技術研究，根據免疫分析靈敏、快速、特異、簡便等優點主要應用于大樣本量的快速及在線檢測；活性成分在植物體中含量低或前處理復雜樣本；毒性成分的檢出及分析；中藥藥代動力學研究等方面。且已制備出30多種單克隆抗體(如抗甘草酸、抗馬兜鈴酸I、抗人參皂苷Rgl、抗青蒿素、抗柴胡皂苷等的單克隆抗體)，日本已研制出商品化的甘草酸ELISA試劑盒。國內目前對于中藥活性成分單克隆抗體的制備及應用研究較少，有制備出海洋硫酸多糖類藥物(國家一類新藥)的單克隆抗體，并建立了 ELISA檢測方法，用于該藥物藥代動力學研究；薯蕷皂苷單克隆抗體制備，用于分析細胞培養獲取薯蕷皂苷的在線監測；對靈芝多糖GLPLl免疫原進行優化并制備出其相應的單克隆抗體；用ELISA法分析柴胡藥材的質量等幾例報道。此外均是多克隆抗體的研究與應用報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種莪術醇單克隆抗體，將該抗體做為一抗，建立了莪術醇的ELISA法，采用ELISA法分析中藥中莪術醇的有無與含量，為含有莪術醇類中藥的質量評價提供一種新的方法。實現本發明目的的技術方案是
一、用現有技術制備莪術醇單克隆抗體，具體方法步驟如下
(I)制備免疫原莪術醇為天然小分子化合物，相對分子量236. 35，與牛血清白蛋白偶聯成 Cur-BSA。(2)免疫本實驗根據莪術醇的性質及注射免疫后小鼠的反應設計第I及第2次免疫劑量為50μ g/只，之后每次的免疫劑量為ΙΟΟμ g/只。首次免疫采用皮下多點接近淋巴結注射，第2次免疫起采用腹腔注射，注射時要小心操作，針頭切勿刺破內臟，避免造成污染，每次免疫間隔2周，共免疫4次。(3)篩選每次免疫后4天眼球采血分離血清，用直接或競爭的酶聯免疫吸附法(ELISA)，檢測莪術醇血清抗體效價。若效價高于104，即可用于細胞融合。(4)骨髓瘤細胞的選擇選擇處于對數生長期、細胞形態佳和活性大于95%的細胞作為融合細胞。(5)細胞融合超強免疫后第4天，眼球采 血分離陽性血清，并處死小鼠，無菌取免疫鼠脾臟，分離脾細胞，與SP2 / O小鼠骨髓瘤細按5 :1數量融合。(6)陽性雜交瘤細胞的篩選及克隆融合細胞以HAT選擇培養系統培養，10天后，ELISA直接法檢測上清液抗體水平吸收值(OD)大于陰性對照組值2. I倍以上者；且以Cur-HSA和HSA包被96孔酶標板，兩者相互對照，Cur-HSA包被板為陽性、HSA包被板的相應孔為陰性者，為陽性孔。對陽性孔用有限稀釋法作單克隆化，多次克隆后檢測值都為高陽性且鏡下觀察細胞克隆狀態良好者，即為篩選出的單克隆株。(7)腹水制備抗體及純化BAL B/C小鼠體內誘生腹水，用Protein-G蛋白分離柱收集純化腹水。(8)將收集的腹水，用I mol的Tris溶液將腹水的PH值調至7. 0，然后通過蛋白分離柱，用10 mmol (PH 7. O)的磷酸鹽緩沖液清洗柱子，被吸附的抗體用100 mmol (PH3. 0)的檸檬酸鹽緩沖液洗脫下來，再用IM的Tris溶液中和，以PH7. 4的PBS對沖透析三次，最后凍干即成。二、應用莪術醇單克隆抗體，采取ELISA法分析中藥中莪術醇，包括如下步驟
(I)供試品的制備采用揮發油提取器提取揮發油，所得揮發油以無水硫酸鈉除去水
分，以乙醚定容，做供試品。(2)標準曲線的繪制莪術醇標準品用20%甲醇做系列濃度稀釋，以莪術醇單克隆抗體為一抗，進行競爭ELISA反應，405nm測定OD值，以莪術醇標準品濃度-A4tl5 做標準曲線。(3) ELISA法用pH 9.6的PBS將Cur-HSA配制為濃度為I μ g/ml的溶液，以100 μ I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脫脂奶粉的PBS溶液于37°C封閉2h:加入I 6400倍稀釋的莪術醇單抗(用PBS稀釋)100 μ I/孔，再加入供試品100μ I/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶標抗體(I 1000稀釋)100 μ I/孔，37°C孵育I h，加ABTS顯色液，100 μ I/孔，于37°C反應15 min，用酶標儀讀出各孔在波長405 nm處的吸光度值(A4tl5J。空白對照為PBS，每一濃度的供試品設置3個平行孔。本發明的優點是制備出的單克隆抗體可用于莪術醇的定性與定量分析，另外還可用于莪術醇活性成分的分離與純化、藥物代謝動力學研究、質量監控、新藥篩選以及擴大藥用植物資源，對于莪術類藥材的開發和利用、加速中醫藥現代化的進程有著重要的意義。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步的闡述，但不是對本發明內容的限定。實施例I.材料 BALB/C純系小鼠，雌性，4周齡(由桂林醫學院動物實驗中心提供)。SP2/O骨髓瘤細胞株(購自中科院上海細胞庫)、RPMI1640培養基、新生牛血清、次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)、次黃嘌呤-胸腺嘧啶(HT)、聚乙二醇(PEG4000)(全部購自SIGMA公司)，人工抗原(cur-BSA)是有本實驗室自行合成的，該技術已經獲得國家專利(專利號200910114452. I),鼠二抗購自上海博奧森生物技術公司，預染的蛋白質Marker (購自碧云天生物技術公司)。試劑的配制① PBS (稱取 Nacl:8g，Na2HPO4:1. 15g, KH2PO4:0. 24g, Kcl :0. 2g,加入1000ml去離子水即得)②PH9. 6的碳酸鹽緩沖液O. ImoI/L(Na2CO3 · IOH2O 8. 58g，NaHCO3 5. 8g,溶于去離子水中至1000ml)③O. 05%的T-PBS (2000mlPBS,加入Iml的吐溫，磁珠攪拌混勻)
④5%的脫脂奶粉(IOOml的PBS加入5g的脫脂奶粉)⑤檸檬酸鹽緩沖液的配制含過氧化氫(檸檬酸三鈉25. 8g,檸檬酸一水合物21. 0g，溶于500ml去離子水中，過氧化氫IOOul)⑥ABTS原液(120mgABTS加入20ml去離子水，即為6mg/ml)⑦ABTS染色劑的配制(ABTS原液O. 5ml,含過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液5ml，去離子水4. 5ml)
3方法步驟
3. I莪術醇單克隆抗體的制備
3.1.1免疫原制備以莪術醇為原料，利用丁二酸酐與莪術醇反應生成莪術醇琥珀酸單酯(Cur-HS)，得到人工半抗原，用MS質譜和13C-NMR譜測定半抗原的結構；將莪術醇的半抗原制備成吡啶水溶液，然后使之與牛血清蛋白結合，制備莪術醇的人工抗原即Cur-HS-BSA，用MALDI-TOF-MS鑒定莪術醇人工抗原(具體操作詳見發明專利“一種莪術醇半抗原和人工抗原及其制備方法”，專利號200910114452. I)
3. I. 2免疫本實驗根據莪術醇的性質及注射免疫后小鼠的反應設計第I及第2次免疫劑量為50μ g/只，之后每次的免疫劑量為ΙΟΟμ g/只。首次免疫采用皮下多點接近淋巴結注射，第2次免疫起采用腹腔注射，注射時要小心操作，針頭切勿刺破內臟，避免造成污染。篩選分別用HSA-cur和HAS包被酶標板(濃度均為lug/ml )，各包被一半的酶標板上的孔，每孔lOOul，37°C孵育lh，棄掉包被液，用T-PBS洗三遍，用5%的脫脂奶粉包被酶標板，每孔300ul，37°C孵育lh，棄掉脫脂奶粉，用T-PBS洗三遍，加入包被孔稀釋小鼠血清或雜交瘤細胞培養上清lOOul，37°C孵育lh，棄掉稀釋血清或上清，用T-PBS洗三遍，加入用T-PBS稀釋的1000:1的鼠二抗，37°C孵育lh，棄掉鼠二抗，加入ABTS染色劑，37°C孵育25min,以T-PBS或骨髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照。骨髓瘤細胞的選擇采用骨髓瘤細胞株SP2/0，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，且生長及融合效率均佳。細胞的最高生長刻度為9X105/mL，倍增時間通常為10 15h。處于相似分裂期的兩個親代細胞易于融合，所以選擇處于對數生長期(細胞數為IO4 106，此時細胞渾圓透亮、大小均一、邊緣清晰、排列整齊、呈半致密分布)、細胞形態佳和活性大于95%的細胞作為融合細胞。在準備融合前的兩周開始復蘇SP2/0，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3-6月應用8-AG(8-氮-鳥嘌呤)篩選一次，防止細胞的突變。在細胞融合的前一天用新鮮培養基調細胞濃度為9X105/mL，次日一般即為對數生長期細胞。細胞融合融合過程均在無菌條件下進行。最佳的融合效果應是最低程度的細胞損傷而又產生最高頻率的融合。聚乙二醇(PEG100(T4000)是目前最常用的細胞融合劑，其溶液在PH6. O時細胞融合率最高。本實驗融合時所用PEG2000濃度為50% (W/V)，此濃度能夠產生最多的雜交細胞。實驗過程中時注意控制滴加PGE的時間(Imin)及方式，利于細胞在質膜之間形成分子橋，使細胞質膜發生粘連進而促使質膜的融合。陽性雜交瘤細胞的篩選與克隆在小鼠免疫中，應選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇，小鼠在受抗原刺激后產生的免疫應答，實質是眾多B細胞群的抗體分泌。而針對目標抗原表位的B細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程，在已融合的細胞中，有相當比例的非目的細胞的融合體，需篩選除去。篩選過程一般分為融合細胞的抗體篩選和特異性抗體篩選兩步進行。將融合的細胞充分稀釋，使分配到細胞培養板的每一孔中的細胞數在O至數個細胞之間，培養后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細胞這一過程常被習慣地稱作克隆化。本實驗應用特異性抗原(Cur-HAS)包被的ELISA找出針對目標抗原(Cur)的抗體陽性細胞株，將這些陽性細胞重復克隆3次后，細胞培養板中陽性率為100%，且細胞生長良好，穩定分泌特異性抗體，符合建株要求。
腹水制備抗體及純化雜交瘤腹腔注射前一周給8周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射石蠟油，每只O. 5 mL，誘導產生腹水。10 d后收集腹水，離心得到小鼠腹水。腹水用Protein-G蛋白分離柱純化，將收集的腹水，用I mol的Tris溶液將腹水的PH值調至7. 0，然后通過蛋白分離柱，用10 mmol (PH 7. O)的磷酸鹽緩沖液清洗柱子，被吸附的抗體用100mmol (PH3. O)的檸檬酸鹽緩沖液洗脫下來，再用IM的Tris溶液中和，以PH7. 4的PBS對沖透析三次，最后凍干。應用ELISA法分析中藥中莪術醇
3. 2. I供試品的制備精密稱取藥材50. 00g，置1000ml圓底燒瓶中，加水400ml及數粒玻璃珠，均勻，浸泡2 h，連接揮發油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發油測定器的刻度部分并溢流入燒瓶為止，置加熱套中，設定加熱溫度為130-140°C，緩緩加熱至微沸7 h，冷卻2 h，開啟揮發油測定器下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達刻度O線上面5 mm處為止。所得揮發油用無水硫酸鈉除去水分，以乙醚定容至100ml，取0.1ml定容至IOmL容量瓶中，做供試品。標準曲線的繪制莪術醇標準品用20%甲醇做系列濃度稀釋，以莪術醇單克隆抗體為一抗，進行競爭ELISA反應，405nm測定OD值，以莪術醇標準品濃度-A4tl5 做標準曲線。其回歸方程為 Y= — I. 1754 1ηΧ+1. 7581，R2=O. 9619。法用pH 9. 6的PBS將Cur-HSA配制為濃度為I μ g/ml的溶液，以100 μ I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脫脂奶粉的PBS溶液于37°C封閉2 h:加入I : 6400倍稀釋的莪術醇單抗(用PBS稀釋)100μ I/孔，再加入供試品100μ I/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶標抗體(I 1000稀釋)100 μ I/孔，37°C孵育I h，加ABTS顯色液，100 μ I/孔，于37°C反應15 min，用酶標儀讀出各孔在波長405 nm處的吸光度值(A4tl5 J。空白對照為PBS，每一濃度的供試品設置3個平行孔。莪術醇ELISA法的方法學考察
方法學考察顯示該方法的重現性(9. 02%)、精密度(< 9%)、加樣回收率(10. 01%)、板間 10%)板內(< 10%)差異程度符合免疫分析要求，最低檢測限為78ng/mL。以該法測定廣西莪術、溫莪術、含莪術醇的生物樣本，其檢測結果如表I，與氣相色譜分析結果無顯著差巳表I ELISA法與GC-MS法的結果比較
權利要求
1.莪術醇單克隆抗體在含莪術醇類中藥中的免疫分析應用，其特征是以莪術醇單克隆抗體為一抗，采用酶聯免疫吸附分析法對莪術醇進行的定性與定量分析，具體包括如下步驟 (1)供試品的制備采用揮發油提取器提取揮發油，所得揮發油以無水硫酸鈉除去水分，以乙醚定容，做供試品； (2)標準曲線的繪制莪術醇標準品用20%甲醇做系列濃度稀釋，以莪術醇單克隆抗體為一抗，進行競爭ELISA反應，405nm測定OD值，以莪術醇標準品濃度-A4tl5 做標準曲線； (3)ELISA法用pH9. 6的PBS將Cur-HSA配制為濃度為I y g/ml的溶液，以100 U I/孔包被96孔免疫板，37°C孵育Ih;用含5%脫脂奶粉的PBS溶液于37°C封閉2 h :加入I 6400倍稀釋的莪術醇單抗(用PBS稀釋)100 iil/孔，再加入供試品100 iil/孔，37°C孵育I h，加入羊抗鼠酶標抗體(I 1000稀釋UOOiU/孔，37°C孵育I h，加ABTS顯色液，100 u I/孔，于37V反應15 min，用酶標儀讀出各孔在波長405 nm處的吸光度值(A4M J，空白對照為PBS，每一濃度的供試品設置3個平行孔。
全文摘要
本發明涉及一種莪術醇單克隆抗體在含莪術醇類中藥中的免疫分析應用，其方法為應用雜交瘤技術制備出天然小分子化合物莪術醇的單克隆抗體，再以莪術醇單克隆抗體為一抗，采用酶聯免疫吸附分析法(ELISA法)對莪術醇進行的定性與定量分析。本發明的優點是靈敏度高、特異性好、樣本前處理簡單、檢驗批次大、操作簡便，適于大批量檢驗及在線監測。
文檔編號G01N21/31GK102759625SQ201210260609
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月26日 優先權日2012年7月26日
發明者付明磊, 刁珂, 曾建紅, 王娟, 陳旭, 黃鳳香 申請人:桂林醫學院