專利名稱：僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標的篩選方法
技術領域：
本發明涉及免疫學評價指標篩選領域，具體涉及一種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標的篩選方法。
背景技術：
卷煙煙氣是一種復雜的混合物，它含有6000多種化學物質，卷煙燃燒是一個非常復雜的物理化學過程，由于煙草組分的熱分解和燃燒等反應會生成大量化學物質，其中有CO、自由基、多環芳烴(PAHs)、雜環化合物、醌類、酚類、醛類、酮類、酸類、酯類、脂肪族化合物等有機成分，還包含有痕量的無機元素如Fe、Cu、Cr、Cd、Zn等。而高濃度的自由基以及可與其他物質反應而生成活性物質的化學成分如CO、醛類及多環芳烴類等活性物質可損傷細胞，攻擊DNA，形成共價的DNA加合物，引起DNA堿基錯配，DNA單鏈或雙鏈斷裂，導致DNA損傷，從而引起機體各種機能的變化。
因此吸煙是一個主要的健康風險因素，會增加包括呼吸道感染、慢性阻塞性肺炎、肺癌、心臟病等各種疾病的發病率(Talhout R, Schulz T, Florek E, et al. Hazardouscompounds in tobacco smoke. Int J Environ Res Public Health. 2011,8(2) :613-28.)。卷煙點燃時所釋放的焦油和一氧化碳等化學物質，可以刺激呼吸道，損傷血管內膜，降低紅血球輸氧能力，增加心腦血管疾病的發病率和死亡率，促進癌癥的發生。吸煙是一種損傷和促炎反應，及免疫抑制因素(Patel RR, Ryu JH, Vassallo R. Cigarette smoking anddiffuse lung disease. Drugs 2008 ；68 :1511-1527 ；Kim V, Rogers TJ, Criner GJ. Newconcepts in the pathobiology of chronic obstructive pulmonary disease. Proc AmThorac Soc 2008 ;5 :478-485.)，有證據顯示煙草煙霧會破壞呼吸道上皮的屏障功能，巨噬細胞功能被抑制，淋巴細胞凋亡增加，炎癥局部淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤增加，毒性T淋巴細胞比例增加(Tc)，炎性細胞因子分泌活躍(包括IL-6、IL-8、IL-1P、TNF-a)，最終影響機體的天然和獲得性免疫功能(Domagala-Kulawik J. Effects of cigarette smokeon the lung and systemic immunity. J Physiol Pharmacol. 2008,59Suppl6 :19-34.)。其中，IL-6是由激活的T(Th2)細胞、B細胞、單核-巨噬細胞、纖維母細胞、內皮細胞以及某些腫瘤細胞所分泌的致炎因子，在炎癥和急相性反應中起重要作用。這些免疫功能的改變與煙草中大量有害成分含量密切相關。焦油是卷煙煙氣中主要的有害物質，由多種烴及烴的氧化物、硫化物和氮化物等復雜化合物組成。焦油進入生物活體后，引起細胞中如DNA、RNA、蛋白質的損傷，從而干擾細胞正常機能。體外研究顯示焦油含量越高，對細胞的毒性作用也越強。體內研究中，高焦油和低焦油香煙對機體的免疫損傷是否存在差異，這種差異與哪些因素相關，目前尚不清楚，也沒有相應的報道。煙草對人體健康的不利影響已在全世界被廣泛報道，尋找穩定敏感的免疫監測指標對監測保護人群健康至關重要，監測有害物質含量與免疫功能變化的相關性對于減少和控制吸煙引起的相關疾病具有重要意義，但目前尚缺乏敏感穩定的免疫評價指標。因此，研究免疫功能評價指標，篩選出敏感穩定的免疫評價指標對科學降低卷煙的危害性具有重大的意義。
發明內容
本發明提供了一種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標的篩選方法，篩選結果比較科學全面。—種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標的篩選方法，包括以下步驟(I)以吸空氣大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液作為正常對照組，經鼻連續抽吸卷煙的大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清 液、腹腔巨噬細胞及血液作為吸煙組；(2)利用MTT增殖法檢測步驟(I)中各組脾淋巴細胞增殖能力，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄；(3)利用雞紅細胞吞噬實驗法檢測步驟(I)中各組腹腔巨噬細胞吞噬百分比(即吞噬百分率)和吞噬指數，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄；(4)利用ELISA法檢測步驟(I)中各組脾淋巴細胞培養上清液和血清中IL-6及TNF-a細胞因子濃度，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄；(5)檢測步驟(I)中各組血清中總免疫球蛋白(Ig)含量、IgG含量及IgE含量，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標,反之，放棄;(6)利用瑞氏染液染色法檢測步驟(I)中各組血液中白細胞分類計數，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄。步驟(2)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細胞
IX IO6個/ml加入培養板，每孔0. 1ml，再加入刺激細胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為IOy g/ml，作為加刺激細胞組，并設不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養箱，37°C培養68h，每孔加入10 ylMTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液，放回培養箱孵育后加入MTT溶媒100 iil/孔，在570nm波長處測OD值，淋巴細胞的增值能力以刺激指數表示，刺激指數=加刺激細胞組OD值/陰性對照組OD值，比較各組刺激指數，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該刺激指數作為評價指標，反之，放棄。步驟(3)具體步驟包括將步驟(I)中各組純化的腹腔巨噬細胞用RPMI-1640培養液配制成IO6個/ml，加入5 %的雞紅細胞懸液0. 04ml，其中雞紅細胞IO7個/ml，置于37°C水浴中孵育15-30min，離心，棄上清，將沉淀的雞紅細胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，顯微鏡下觀察100個巨噬細胞，計數吞噬百分比和吞噬指數，吞噬百分率=吞有雞紅細胞的巨噬細胞數X 100/100個巨噬細胞，吞噬指數=100個巨噬細胞中所吞噬的雞紅細胞數X 100/100個巨噬細胞，比較各組吞噬百分比和吞噬指數，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該吞噬百分比和吞噬指數作為評價指標，反之，放棄。
步驟(4)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細胞IXlO6個/ml加入培養板，每孔Iml,再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為10 ii g/ml,并設不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養箱，37°C培養68h，離心收集上清液即脾淋巴細胞培養上清液，收集的上清液與步驟(I)中各組大鼠血清中IL-6與TNF- a采用大鼠細胞因子檢測試劑盒進行ELISA法檢測，細胞因子濃度依照已知濃度的標準品繪制的標準曲線進行計算，比較各組細胞因子濃度，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該IL-6和/或TNF-a細胞因子作為評價指標，反之，放棄。步驟(5)具體步驟包括培養板每孔加入步驟(I)中各組大鼠血清稀釋液100 iil，復孔，血清樣本用磷酸鹽緩沖液進行稀釋，用HRP-羊抗大鼠Ig、HRP-羊抗大鼠IgG, HRP-羊抗大鼠IgE抗體作為二抗，四甲基聯苯胺作為底物，在450nm波長處測光吸收值；血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知濃度的標準品繪制的標準曲線進行計算；比較各組總Ig含量、IgG含量及IgE含量，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與 正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該總Ig、IgG、IgE中的一種或幾種作為評價指標，反之，放棄。步驟(6)具體步驟包括將步驟(I)中各組大鼠血液加入適量肝素鈉，制備血涂片，待血涂片干透后用瑞氏染液染色，自然溫度下染色10分鐘-15分鐘后用流水沖去染液，待干燥后鏡檢，記錄各類白細胞所占的百分數；比較各組各類白細胞所占的百分數，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該各類白細胞所占的百分數作為評價指標，反之，放棄。步驟(I)中，經鼻連續抽吸卷煙的時間為30天、60天、90天以及經鼻連續抽吸卷煙90天停止吸煙42天后的恢復期，如經鼻連續抽吸卷煙30天大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液，經鼻連續抽吸卷煙60天大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液，經鼻連續抽吸卷煙90天大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液，以及經鼻連續抽吸卷煙90天停止吸煙42天后的恢復期大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液。步驟(I)中，所述卷煙包括焦油含量為8mg/支的低焦油卷煙和/或焦油含量為12mg/支或13mg/支的普通卷煙。所述的大鼠為SD大鼠。本發明試劑均采用市售產品。本發明顯示,相比于細胞免疫反應,體液免疫更容易受到吸煙的損傷,也更容易恢復至正常水平；低焦油卷煙組在短期內免疫損傷不及普通卷煙，但長期吸食，對機體造成的免疫損傷和普通卷煙相似甚至更為嚴重。綜上，最終篩選出脾淋巴細胞增殖的刺激指數(SI)、脾淋巴細胞培養上清液中IL-6含量、血清中IgG含量、血清中IgE含量及血液中各類白細胞比例五個指標作為敏感穩定的評價指標反應吸煙大鼠免疫功能的變化。本發明具有如下優點本發明通過對經鼻連續抽吸卷煙大鼠血清、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液等體液免疫功能和細胞免疫功能的變化情況的分析，研究卷煙煙氣對機體免疫功能的影響，篩選出若干免疫監測指標。篩選出的指標敏感穩定好，可作為反應吸煙大鼠免疫功能的變化的評價指標，反映吸煙這一外來的理化刺激引起的機體免疫功能損傷。本發明進一步通過對不同吸煙時間(30、60、90天)大鼠脾淋巴細胞、腹腔巨噬細胞的功能測定，血清中總免疫球蛋白(Ig)含量、免疫球蛋白亞類IgG及IgE含量等測定，脾淋巴細胞培養上清液和血清中炎癥因子(IL-6、TNF- a )含量等測定以及血液中各種白細胞含量的測定，反映吸煙大鼠體液和細胞免疫功能的變化，及高低焦油量卷煙引起免疫損傷的差異，進行指標篩選，獲得簡便敏感的免疫功能評價指標。本發明篩選方法可重復操作多次，經多次重復操作，得出相同的篩選結果，表明本發明篩選方法準確性較好，所篩選出的評價指標可以全面科學的反應卷煙煙氣對免疫功能的影響。
具體實施方式
實施例I材料與方法I.材料I. I實驗動物，SD大鼠購自上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號碼SCXK (滬)2008-0016。No. I低焦油卷煙(焦油含量8mg/支)；No. 2普通卷煙(焦油含量13mg/支)由浙江中煙工業有限責任公司技術中心提供。I. 2 試劑Rat IL-6ELISA kit 和 Rat TNF- a ELISA kit 購自 R&D 公司，MTT 增殖檢測試劑盒購自SIGMA，Rat Ig ELISAkit購自藍基生物，一次性細胞計數板購自英俊公司，其他試劑為試劑級試劑。I. 3設備鼠經鼻暴露吸煙系統(參考美國西北毒理研究中心Battelle公司的CSES系統)，這個系統可直接與JJS-II型自動吸煙機連接。2.方法2. I動物實驗2. I. I實驗動物5周齡的健康Sprague-Dawley大鼠160只。隨機分為3組。A組,正常對照組,吸空氣，B組，吸No. I低焦油卷煙(焦油811^/支)，(組，吸如.2普通卷煙(焦油13mg/支)。實驗材料及煙氣產生按IS03308和國家標準。在JJS-II型自動吸煙機上，按常規擬人吸煙條件下，每分鐘抽吸I 口，每口抽吸2秒。吸煙機房間環境溫度22±2°C、濕度60±5%。每一孔道處氣流的測定風速值200±50mm/s。每次試驗前須檢查每一通道的抽吸容量必須調整至35±0. 30ml。B，C組大鼠以僅鼻吸煙方式每天吸煙20支連續90天，停止吸煙42天。依據衛生毒理學實驗方法，大鼠吸煙30天、60天和90天，相當于人吸煙3年、6年和9年。2. 2脾淋巴細胞功能檢測實驗動物中的動物分別于吸煙30天、60天、90天和恢復期(吸煙90天后停吸，自然恢復42天，convalescence)取三組大鼠共108只，麻醉后眼球采血，分離血清,分裝后-80°C保存。
大鼠斷頸處死后，置體積百分濃度為75%乙醇水溶液中浸泡l_2min,右臥位,無菌取脾臟，稱重。在35mm培養皿中放入5mlEZ-S印TMM0use I X淋巴細胞分離液，用注射器活塞輕輕研磨大鼠脾臟，使得分散的單細胞透過尼龍網進入淋巴細胞分離液中。把懸有脾臟細胞的分離液轉移到IOml離心管中，離心前再覆蓋200 ill的RPMI-1640培養基。800g離心30分鐘，吸出淋巴細胞層，再加入10mll640培養基，250g離心10分鐘，傾倒上清液，加A 3-5ml無血清培養基重懸,得到脾淋巴細胞,Invitrogen公司提供的countess細胞計數儀進行細胞計數。將IX IO6個/ml的脾淋巴細胞加入96孔培養板，每孔0. lml。再加入伴刀豆蛋白(concanavalin A, ConA),使其終濃度為10 y g/ml,并設不加ConA的陰性對照和不加脾淋巴細胞和ConA的空白對照組，每組設3個復孔。將細胞置于5% (體積百分比)CO2培養箱，37°C培養68h，加入MTT溶液(Sigma公司)，每孔10 U 1，將培養物放回培養箱孵育3_4小時，加入MTT溶媒(Sigma公司UOOiU/孔，在570nm波長處測光吸收值(0D值)，淋巴細胞的增殖能力以刺激指數(stimulating index, SI)表示，SI =加刺激細胞ConA孔OD值/不加刺激細胞ConA的陰性對照孔OD值。OD值大于等于2提示淋巴細胞具有增殖功能。
2. 3腹腔巨噬細胞功能測定實驗動物中的動物分別于吸煙30天，60天，90天，取大鼠12只(每組4只)，麻醉后眼球采血，分離血清，分裝后-80°C保存。大鼠斷頸處死后，置75% (質量百分比)乙醇水溶液中浸泡l_2min，剪開腹部皮毛，在腹腔左下角注入IOml冷生理鹽水，輕揉大鼠腹部3-5min，無菌剪開腹腔，吸取腹腔液至15ml離心管中，lOOOrpm，離心5min。將細胞置于5% CO2培養箱，37°C培養2h，去除淋巴細胞。將純化的巨噬細胞用RPMI-1640培養液配制成IO6個/ml，加入5% (體積百分比)的雞紅細胞懸液0.04ml (雞紅細胞IO7個/ml)，置于37°C水浴中孵育15_30min,期間每2_3min輕輕搖晃試管I次。500g離心5min,棄上清。將試管底部的雞紅細胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色。顯微鏡下(油鏡)觀察100個巨噬細胞，計數吞噬百分比和吞噬指數。吞噬百分率=吞有雞紅細胞的巨噬細胞數X 100/100個巨噬細胞；吞噬指數=100個巨噬細胞中所吞噬的雞紅細胞數X 100/100個巨噬細胞。2. 4ELISA檢測IL_6、TNF_a及免疫球蛋白(Ig)含量將實驗動物中的動物在不同時間點剖殺后取脾淋巴細胞，得到脾淋巴細胞，調整濃度至I X IO6個/ml加入24孔培養板，每孔lml。再加入ConA,使其終濃度為10 u g/ml，并設不加ConA的陰性對照，以及不加脾淋巴細胞和ConA的空白對照。將細胞置于5% CO2培養箱，37°C培養68h，14000rpm離心lOmin，收集上清液，_80°C凍存待檢。收集的上清液與血清中IL-6與TNF-a采用大鼠細胞因子檢測試劑盒(BD Biosciences, San Jose, CA)進行ELISA法檢測，細胞因子濃度依照已知濃度的標準品繪制的標準曲線進行計算。每孔加入吸煙大鼠及對照組大鼠血清稀釋液100 U 1，復孔。血清樣本用磷酸鹽緩沖液進行稀釋(PBS, pH7. 4)。HRP-羊抗大鼠 Ig 抗體(Bio-Rad, Hercules, CA)、HRP-羊抗大鼠 IgG 抗體(Bio-Rad, Hercules, CA)、HR-羊抗大鼠 IgE 抗體(Bio-Rad, Hercules, CA)作為二抗，四甲基聯苯胺作為底物，在450nm波長處測光吸收值。血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知濃度的標準品繪制的標準曲線進行計算。2. 5血涂片的檢測將實驗動物中的動物的血液加入肝素鈉少量，制備血涂片。待血涂片干透后，用蠟筆在兩端劃線，以防染色時染液外溢。血涂片用瑞氏染液進行染色，室溫染色10分鐘后用流水沖去染液，待干燥后鏡檢。記錄各類白細胞所占的百分數。2. 6統計方法統計方法采用SAS軟件的方差分析和t-檢驗分析數據，p < 0. 05認為有顯著性差異。3.結果3. I.脾臟淋巴細胞功能檢測淋巴細胞增殖及刺激指數見表I。 表I各組期淋巴細胞刺激指數(SI)
權利要求
1.一種擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)以吸空氣大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液作為正常對照組，經鼻連續抽吸卷煙的大鼠的血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液作為吸煙組； (2)利用MTT增殖法檢測步驟⑴中各組脾淋巴細胞增殖能力，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄； (3)利用雞紅細胞吞噬實驗法檢測步驟(I)中各組腹腔巨噬細胞吞噬百分比和吞噬指數，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄； (4)利用ELISA法檢測步驟(I)中各組脾淋巴細胞培養上清液和血清中IL-6及TNF-a細胞因子濃度，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄； (5)檢測步驟(I)中各組血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄； (6)利用瑞氏染液染色法檢測步驟(I)中各組血液中白細胞分類計數，比較各組檢測結果，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該指標作為評價指標，反之，放棄。
2.根據權利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細胞I X IO6個/ml加入培養板，每孔0. 1ml，再加入刺激細胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為10 U g/ml，作為加刺激細胞組，并設不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養箱，37°C培養68h，每孔加入10 u I MTT溶液，放回培養箱孵育后加入MTT溶媒100 U I/孔，在570nm波長處測OD值，淋巴細胞的增值能力以刺激指數表示，刺激指數=加刺激細胞組OD值/陰性對照組OD值，比較各組刺激指數，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該刺激指數作為評價指標，反之，放棄。
3.根據權利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(3)具體步驟包括將步驟(I)中各組純化的腹腔巨噬細胞用RPMI-1640培養液配制成IO6個/ml，加入5%的雞紅細胞懸液0. 04ml，其中雞紅細胞IO7個/ml，置于37°C水浴中孵育15_30min，離心，棄上清，將沉淀的雞紅細胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，顯微鏡下觀察100個巨噬細胞，計數吞噬百分比和吞噬指數，吞噬百分率=吞有雞紅細胞的巨噬細胞數X 100/100個巨噬細胞，吞噬指數=100個巨噬細胞中所吞噬的雞紅細胞數X 100/100個巨噬細胞，比較各組吞噬百分比和吞噬指數，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該吞噬百分比和吞噬指數作為評價指標，反之，放棄。
4.根據權利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(4)具體步驟包括將步驟(I)中各組脾淋巴細胞IX IO6個/ml加入培養板，每孔1ml，再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白終濃度為IOy g/ml，并設不加伴刀豆蛋白的陰性對照組和不加脾淋巴細胞和ConA的空白對照組，均置于5% CO2培養箱，37°C培養68h，離心收集上清液即脾淋巴細胞培養上清液，收集的上清液與步驟(I)中各組大鼠血清中IL-6與TNF-a采用大鼠細胞因子檢測試劑盒進行ELISA法檢測，細胞因子濃度依照已知濃度的標準品繪制的標準曲線進行計算，比較各組細胞因子濃度，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該IL-6和/或TNF-a細胞因子作為評價指標,反之,放棄。
5.根據權利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(5)具體步驟包括培養板每孔加入步驟(I)中各組大鼠血清稀釋液100 iil，復孔，血清樣本用磷酸鹽緩沖液進行稀釋，用HRP-羊抗大鼠Ig、HRP-羊抗大鼠IgG、HRP-羊抗大鼠IgE抗體作為二抗，四甲基聯苯胺作為底物，在450nm波長處測光吸收值；血清中總Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知濃度的標準品繪制的標準曲線進行計算；比較各組總Ig含量、IgG含量及IgE含量，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該Ig、IgG、IgE中的一種或幾種作為評價指標，反之，放棄。
6.根據權利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(6)具體步驟包括將步驟(I)中各組大鼠血液加入適量肝素鈉，制備血涂片，待血涂片干透后用瑞氏染液染色，自然溫度下染色10分鐘-15分鐘后用流水沖去染液，待干燥后鏡檢，記錄各類白細胞所占的百分數； 比較各組各類白細胞所占的百分數，分析相互的顯著性差異情況，若吸煙組與正常對照組相比有顯著性差異，篩選出該各類白細胞所占的百分數作為評價指標，反之，放棄。
7.根據權利要求I所述的篩選方法，其特征在于，步驟(I)中，經鼻連續抽吸卷煙的時間為30天、60天、90天以及經鼻連續抽吸卷煙90天停止吸煙42天后的恢復期。
8.根據權利要求I或7所述的篩選方法，其特征在于，步驟(I)中，所述卷煙包括焦油含量為8mg/支的低焦油卷煙和/或焦油含量為12mg/支或13mg/支的普通卷煙。
9.根據權利要求I所述的篩選方法，其特征在于，所述的大鼠為SD大鼠。
全文摘要
本發明公開了一種僅鼻擬人吸煙大鼠免疫功能評價指標的篩選方法，包括步驟以吸空氣大鼠血清、脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液作為正常對照組，經鼻連續抽吸卷煙大鼠血清脾淋巴細胞、脾淋巴細胞培養上清液、腹腔巨噬細胞及血液作為吸煙組；檢測各組淋巴細胞增殖能力、腹腔巨噬細胞吞噬情況、IL-6、TNF-α、Ig、IgG、IgE含量和白細胞分類計數；最終篩選出淋巴細胞增殖的刺激指數、IL-6、IgG、IgE含量、白細胞分類計數五個指標作為敏感穩定的評價指標反應吸煙大鼠免疫功能的變化。該方法科學全面，篩選出的評價指標具有良好的敏感穩定性。
文檔編號G01N33/00GK102735804SQ20121025486
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者儲國海, 周國俊, 王琴美, 胡瑗, 黃芳芳 申請人:浙江中煙工業有限責任公司