專利名稱：一種肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗體檢測試劑盒及其制備方法，具體涉及一種肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
肺炎衣原體是人類呼吸道疾病的重要病原體，可引起急慢性呼吸道疾病，調查顯示，社區獲得的肺炎、支氣管炎和鼻竇炎5-10%由肺炎衣原體引起。經常引起成人及青少年的非典范肺炎，亦可引起支氣管炎、咽炎及扁桃體炎等急性呼吸道傳染。肺炎衣原體呼吸道感染的臨床表現不典型，通常以咽痛和音啞起病，幾日至一周后出現咳嗽，與其他呼吸道疾病相比，自起病至就醫的時間以肺炎衣原體感染為最長，因此病初時的低熱，檢查時多已降至正常，異常呼吸音和鼻竇區壓痛為最常見的特征，白細胞計數大多正常，血沉增速，X線胸片常顯示單側節段性肺炎，類似非典型性肺炎，嚴重者病變較廣泛，甚至波及雙肺，也可 伴有胸膜炎或胸腔積水。熱帶國度地區高于北部發財國度，有的地區5 14歲年齡組發病率高于成年人。據統計在引起肺炎的病因中，是繼肺炎球菌、流感嗜血桿菌之后引起社區獲得性肺炎的第三位緊張病原體。美國報告每年發病約30萬例，而鸚鵡熱衣原體引起的肺炎僅約150例。香港亦有雷同報告，在呼吸系統傳染的患者中，檢測血清肺炎衣原體抗體陽性率為54. 8%，緊張傳染者為24. 8%，抗體效價多I : 256，而鸚鵡熱衣原體抗體之陽性率僅為
0.9%，且多為非近期傳染。亦發覺肺炎衣原體傳染與冠芥蒂、心肌梗死及膨脹型心肌病等心血管疾病及腦血管疾病等的產生明顯相干。本病埋伏期10 65天。貧乏特異性臨床表現，無癥狀傳染和輕癥患者常見。I.急性呼吸系傳染是其緊張表現，如咽炎、喉炎、鼻竇炎、中耳炎、支氣管炎及肺炎，以肺炎最常見占50%以上，支氣管炎次之。老年人以肺炎常見，20歲以下的青少年，則多為支氣管炎及上呼吸道傳染。常以發燒、滿身不適、咽痛及聲音撕啞起病，數日后呈現咳嗽，此時體溫多已平常。亦可引起支氣管炎、支氣管哮喘，原有支氣管哮喘的患者傳染肺炎衣原體后，可加重病情。還可引起咽炎、鼻竇炎及中耳炎，此多與肺炎及支氣管炎同時存在。病變平常均較輕，但盡管應用抗生素治療，病情規復較慢，咳嗽及滿身不適等癥狀可連續數禮拜至數月。病情緊張者可因原根本疾病加重或因產生并發癥如細菌傳染而死亡。2.傷寒型少數患者表現為高熱、頭痛、相對緩脈及肝脾年夜，易并發心肌炎、心內膜炎和腦膜炎，重癥患者呈現昏倒及急性腎枯竭，表現雷同重型傷寒。3.肺炎衣原體傳染與動脈硬化、冠芥蒂及急性心肌梗死之發病的相干性據統計50%的慢性冠芥蒂及68%急性心肌梗死患者血清中，可檢出抗肺炎衣原體抗體(IgG和IgA)，比較組僅17%。 用肺炎衣原體單克隆抗體免疫組化染色或用PCR法，在冠狀動脈或自動脈的硬化斑中，可檢出肺炎衣原體抗原或其DNA，證實在病灶內存在病原體，而在平常動脈構造中未檢出。Gloria等報告用 單克隆抗體免疫熒光法，別離在自動脈和冠狀動脈硬化的標本中檢出肺炎衣原體抗原，陽性率別離為13%和79%，平常自動脈為4%。故覺得肺炎衣原體傳染與動脈硬化的產生相關，是產生冠芥蒂的危機身分，對冠芥蒂患者應注意除外肺炎衣原體傳染，并覺得防治肺炎衣原體傳染有年夜略裁減冠芥蒂的產生。據報告，動脈粥樣硬化、冠芥蒂及外周動脈栓塞等心血管病患者，常歸并肺炎衣原體傳染，用羅紅霉素等年夜環內酯類抗生素治療，并經過議定2 7年的隨訪，可明顯低落心血管病的進展。同時發覺有腎枯竭的冠芥蒂患者，其肺炎衣原體的傳染率更高，且更易促進心血管病的進展。4.其他可引起虹膜炎、肝炎、心內膜炎、腦膜炎及結節性紅斑等。通常情況下的診斷方法有
因為本病貧乏特異性臨床表現，故對有肺炎或上述臨床表現的患者，如疑及本病，可做病原學或免疫學檢測確診。實行室檢測
I.血象血白細胞計數多平常，重癥患者可升高。血沉多增快。2.病原學查抄是確診本病的靠得住方法。臨床診斷不常用。(I)直接涂片涂片后用Giemsa或免疫熒光單克隆抗體染色，檢測肺炎衣原體包涵體及原體，方法輕巧，但陽性率低。(2)構造培養法雞胚卵黃囊接種因檢出陽性率低已罕用。可用細胞培養法，取咽拭子或收集下呼吸道標本，用ffiP-2細胞(喉癌細胞)或Hela229細胞培養24 h，再用肺炎衣原體特異性單克隆抗體染色，檢測特異性包涵體。 方法較繁雜，且較其他衣原體檢出率低。3.免疫學檢測是常用的診斷方法。(I)直接免疫熒光法用肺炎衣原體單克隆抗體染色，直接免疫熒光法檢測肺炎衣原體抗原，方法特異靈活且急劇輕巧。(2)微量免疫熒光(MIF)法檢測肺炎衣原體抗體，特異性IgM滴度彡I : 16和(或)IgG彡I 512或雙份血清滴度4倍以上升高者，均可診斷急性傳染。如IgM彡I 16或IgG彡I 512，則為既往傳染。本方法特異性靈活性均較高，且可用于區分原發傳染和再傳染，是如今最常用且最靈活的血清學方法。但要清除血輪回中類風濕因子的感化。(3)補體聯合抗體檢測滴度彡I 64和(或)雙份血清滴度4倍以上升高者，均可診斷急性傳染，但不能用于早期診斷，亦不能區分為哪種衣原體傳染。4. PCR法檢測肺炎衣原體DNA，靈活性更高，且可和其他種衣原體區分，其特異性靈活性高于其他方法。據統計，PCR法檢出率為50% 55%，而直接免疫熒光法及涂片法別離為24% 27%和6% 10%。用連接聚合酶鏈反響(LCR)檢測，可進一步進步伶俐性及檢出率，但尚未在臨床應用。據報告，PCR-EIA法是一種急劇、輕巧的酶免疫測定法，能進步PCR對肺炎衣原體DNA的擴增檢測效果，優于PCR法，更優于培養法。
發明內容
本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種可以快速定性檢測血清樣本中的肺炎衣原體IgM抗體的肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒。為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為一種肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒，包括硝酸纖維素膜檢測線上包被的重組肺炎衣原體抗原、質控線上包被的羊抗鼠IgG抗體和金標墊上包被的膠體金標記的鼠抗人IgM單抗，所述肺炎衣原體抗原濃度為l-2mg/ml，用SDS-PAGE測定；所述羊抗鼠IgG抗體濃度為l_3mg/ml ;所述鼠抗人IgM單抗濃度為5-30 Mg /mL，用SDS-PAGE測定。本發明的第二個目的是提供了一種肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟
(1)反應膜的制備用磷酸鹽緩沖液將重組Cpn-Ag稀釋到包被濃度為I. Omg/ml，將羊抗鼠IgG抗體稀釋成濃度為2. Omg/ml，將兩種包被液分別劃到硝酸纖維素膜上，將已包被的硝酸纖維素膜干燥后保存；
(2)鼠抗人IgM單抗金結合物墊的制備將標記濃度為5-30iig/ml的鼠抗人IgM單抗與膠體金進行偶聯制得膠體金標記鼠抗人IgM單抗溶液，以轉速為12000r/min離心40min,棄上清，加入膠體金結合物稀釋液至原體積的1/2，然后用混合液浸泡金標墊，制備成Cpn — IgM金結合物墊,將Cpn — IgM金結合物墊干燥保存；
(3)切割裝配在反應膜所在膠板的上部揭去I.5cm寬的不干膠紙，粘貼上粗纖維濾紙，使紙的下部壓住反應膜，揭去反應膜下部的0. 9cm的不干膠紙，貼上Cpn — IgM金結合物墊，并且金結合物墊的上部壓住反應膜1mm，再揭去金結合物墊下部的的不干膠紙，貼上樣品墊，樣品墊的上部壓住金結合物墊的下部1_，制成反應板，再用切條機切成4_試紙條，進行裝卡后，裝入鋁箔袋內制成產品。進一步的，所述肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備方法中，所述步驟(I)和(2 )的干燥條件為37 °C干燥3小時。進一步的，所述肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備方法中，其特征在于所述步驟(2)的鼠抗人IgM單抗的標記濃度為15y g/ml。本發明的有益效果為肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒具有快速、簡便、準確和靈敏度高的特點，整個操作時間僅需幾十分鐘就可以判讀結果。膠體金快速檢測試紙條，以多表位的重組抗原為原料，具有操作更加簡便，成本低廉，特異性好，靈敏度高的特點，可單份檢測，易于普及，對于肺炎衣原體IgM的檢測和控制效果明顯。
圖I為本發明提供的一種肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備工藝流程不意圖。
具體實施方式
、
一、生產工藝條件的確定
1.膠體金顆粒的選擇
1.1原理根據煮沸條件下氯金酸與檸檬酸三鈉發生氧化還原反應制備膠體金。可以通過調節氯金酸和檸檬酸三鈉的加入比例來改變和控制膠體金的顆粒大小。操作在IOOmL純化水中加入0. ImL 10%氯金酸煮沸、在攪拌條件下加入不同體積的1%檸檬酸三鈉溶液，煮沸5分鐘，制備不同條件的膠體金顆粒，待其自然冷卻回復至原體積。用鼠抗人IgM單抗標記不同顆粒的膠體金，然后再用企業參考品進行檢測。其結果如表I :
表I :1%檸檬酸三鈉用量的選擇實驗(粒徑選擇)
液體加入順序單位1234 純化水毫升 ICO100100100
1% 氯金酸微升 1000100010001000
1%抒樣酸三鈉毫升I1.41.82.0
'膠體金外觀:顏色:紫色清亮紫紅清亮鮮紅清亮:橙紅清亮'
波峰范圍—L nm548535 —丨―525518
用制備的四種膠體金標記鼠抗人IgM單抗與重組Cpn-Ag包被的反應膜配比，再用企業參考品血清進行檢測。如表2:
表2不同膠體金標記鼠抗人IgM單抗與重組Cpn-Ag膜配對檢測結果
、.檢測結果
膠體金編號.III
Pl P2 P3 NI i N2 NS
IIill"
I_ I _I__++ I_+++++士_j___
2[ + J ++ — +++ 士 — I _
3+++ +++— I ——
............................4 ' ± . + — ++ - I —二.......................
結果分析由表2結果可知，3號制金條件制的膠體金，顏色鮮紅、清亮，無混濁及漂浮物，標記后的膠體金其特異性、敏感性較好。故選擇制金條件為1/萬氯金酸100ml+l. 8ml1%檸檬酸三鈉
2.膠體金標記鼠抗人IgM單抗條件的優化
2.1原理根據膠體金標記技術特性，將膠體金中細微的金顆粒與純化的鼠抗人IgM單抗穩定結合，形成紅色的膠體金鼠抗人IgM單抗結合物。膠體金標記最適pH值的選擇采用目測法。取若干個I. 5mL試管,分別加入I mL膠體金；用0. IM K2CO3或511鹽酸將pH分別調為3，4，5，6，7，8，9，10 ;取96孔酶標板，按pH從低到高分別將上述膠體金分別取100 M L加入孔中，重復三次；每孔分別加入3 M L濃度為I mg/mL的鼠抗人IgM單抗,混合,室溫下放置40 min ;每孔分別加入20 M L濃度為10%NaCl溶液，混勻，室溫下放置2小時；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低PH(X)。調整pH為X-1. 0、X-0. 5、X、X+0. 5、X+1. 0，重復以上步驟，保持紅色的最低pH值即為標記的最佳pH值。結果如表3 :
表3膠體金標記鼠抗人IgM單抗最適PH值的選擇實驗結果
權利要求
1.一種肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒，包括硝酸纖維素膜檢測線上包被的重組肺炎衣原體抗原、質控線上包被的羊抗鼠IgG抗體和金標墊上包被的膠體金標記的鼠抗人IgM單抗,其特征在于 所述肺炎衣原體抗原濃度為l_2mg/ml，用SDS-PAGE測定； 所述羊抗鼠IgG抗體濃度為l-3mg/ml ； 所述 鼠抗 人 IgM 單抗 濃度 為 5-30Mg /mL，用 SDS-PAGE 測定。
2.根據權利要求I所述的肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)反應膜的制備用磷酸鹽緩沖液將重組Cpn-Ag稀釋到包被濃度為1.0mg/ml，將羊抗鼠IgG抗體稀釋成濃度為2. Omg/ml，將兩種包被液分別劃到硝酸纖維素膜上，將已包被的硝酸纖維素膜干燥后保存； (2)鼠抗人IgM單抗金結合物墊的制備將標記濃度為5-30iig/ml的鼠抗人IgM單抗與膠體金進行偶聯制得膠體金標記鼠抗人IgM單抗溶液，以轉速為12000r/min離心40min，棄上清，加入膠體金結合物稀釋液至原體積的1/2，然后用混合液浸泡金標墊，制備成Cpn — IgM金結合物墊,將Cpn — IgM金結合物墊干燥保存； (3)切割裝配在反應膜所在膠板的上部揭去I.5cm寬的不干膠紙，粘貼上粗纖維濾紙，使紙的下部壓住反應膜，揭去反應膜下部的0. 9cm的不干膠紙，貼上Cpn — IgM金結合物墊，并且金結合物墊的上部壓住反應膜1mm，再揭去金結合物墊下部的的不干膠紙，貼上樣品墊，樣品墊的上部壓住金結合物墊的下部1_，制成反應板，再用切條機切成4_試紙條，進行裝卡后，裝入鋁箔袋內制成產品。
3.根據權利要求2所述的肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟(I)和(2)的干燥條件為37°C干燥3小時。
4.根據權利要求2所述的肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的鼠抗人IgM單抗的標記濃度為15ii g/ml。
全文摘要
本發明公開了一種肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒，包括硝酸纖維素膜檢測線上包被的重組肺炎衣原體抗原、質控線上包被的羊抗鼠IgG抗體和金標墊上包被的膠體金標記的鼠抗人IgM單抗，肺炎衣原體抗原濃度為1-2mg/ml，用SDS-PAGE測定；羊抗鼠IgG抗體濃度為1-3mg/ml；鼠抗人IgM單抗濃度為5-30g/mL，用SDS-PAGE測定。本發明的有益效果為肺炎衣原體IgM抗體膠體金法檢測試劑盒具有快速、簡便、準確和靈敏度高的特點，整個操作時間僅需幾十分鐘就可以判讀結果。膠體金快速檢測試紙條，以多表位的重組抗原為原料，具有操作更加簡便，成本低廉，特異性好，靈敏度高的特點，可單份檢測，易于普及，對于肺炎衣原體IgM的檢測和控制效果明顯。
文檔編號G01N33/531GK102749446SQ201210252950
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月21日 優先權日2012年7月21日
發明者李習榮 申請人:北京中檢安泰診斷科技有限公司