專利名稱：作為用于生物傳感器的對照溶液的內部參考的可氧化的物質的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及醫療器械領域。
背景技術：
更具體地講，本發明涉及生物傳感器，它可用于測量體液中分析物的數量。光學方法通常被用于這種測量，不過，本發明涉及電化學生物傳感器的改良。盡管本文所披露的方法可用于測量其他分析物，包括膽固醇，尿素，肌酸酐，和肌酸，特別感興趣的是測量全血中的葡萄糖。盡管本說明書強調了用于測量葡萄糖的發明用途，但應當理解的是，本發明具有 更廣泛的用途。本發明涉及電化學儀器，其中，將電位施加在與生物樣品和試劑接觸的電極上。在所述分析物與所述試劑起反應時測量所產生的電流，然后與樣品中的分析物的數量相關聯。這種儀器被稱作測量電流的儀器，它與電量分析儀器不同，這種儀器測量的是通過綜合整個測量期間的電流由樣品的反應所產生的庫侖計的總電荷。所述測量電流的儀器的優點是，它們不太依賴于體積和時間。它們不需要等待整個體積的分析物發生反應，相反，只需要通過在預定的時間對反應速度進行采樣對分析物進行測量。現有技術中業已披露了用于所述生物傳感器的多種設計，例如，參見美國專利申請公開號2001/0042683。所述電極一般被稱為工作電極和反電極。所述電極與含有試劑的固體層接觸，所述試劑能氧化所述樣品中的分析物，如葡糖氧化酶以及介體，所述介體能再氧化所述還原的酶。還原的介體本身是在工作電極上氧化的，它能產生可測量的電流。該電流被用于計算被測試的樣品中的葡萄糖的數量，因為它是樣品中葡萄糖氧化的間接參數。所述反應可以通過以下步驟描述葡萄糖+E氧化一E還原+產物(葡糖酸，葡糖酸內酯)E還原+Med氧化—Med還原+E氧化Med 還原—Med 氧化+ne-其中，E氧化和E·是所述酶的氧化還原中心的氧化和還原形式，而Med氧化和Med還β是所述介體的氧化和還原形式。為了測量葡萄糖，所述酶可以是葡糖氧化酶，而所述介體是鐵氰化物。其他分析物的測量要使用合適的酶和介體。在表I中列舉了酶，介體和分析物的典型組合。表I選擇的底物，酶和介體系統
分析物酶介體 _
葡萄糖^ 葡糖氧化酶鐵氰化 葡萄糖葡糖脫氫酶鐵氰化物 膽固醇膽固醇氧化酶鐵氰化物 乳酸鹽乳酸鹽氧化f 鐵氰化物—
尿酸尿酸氧化酶鐵氰化物 醇醇氧化酶苯二胺—為了確保精確測量，將含有已知數量葡萄糖的對照溶液用于驗證所述儀器是正常工作的。對照溶液的配方業已成為多份專利和申請的主題。例如，美國專利號3，920，580 ;4，572，899 ;4，729，959 ;5，028，542 和 5，605，837 ；WO 93/21928 ；WO 95/13535 ；和TO95/13536。盡管含有血清的對照溶液業已被使用，但最近的專利一直致力于用不含血清的溶液取代基于血清的對照溶液，因為無血清溶液比含血清的溶液更一致和穩定。所述對照溶液應當在血清樣基質中含有已知濃度的葡萄糖，以便測定酶促生物傳感器和穩壓器的精確性。顯而易見的是，所述組合物在使用之前長時間儲存時必須是穩定的。對照溶液應當用于檢測所述葡萄糖監測系統的功能，不過，與此同時，它們應當識別并且區分實際血樣的讀數。這是因為所述對照溶液包含已知數量的葡萄糖，并且提供沒有治療目的的讀數。如果所述測試儀器不能識別所述對照溶液，并且區分它們的反應和血樣的反應，對照溶液的葡萄糖讀數就包含在葡萄糖測量的歷史中，這可能導致錯誤的理解
患者的糖尿病狀態。或者，如果對照溶液取代了血樣，它可能被醫生誤認為表明需要改變治療。因此，由于所述對照溶液的溫度反應與血樣的溫度反應不同，如果測試儀表不能區分血樣和對照溶液的話，在除了 25°C以外的溫度下進行測量的溫度補償不夠精確。因此，葡萄糖監測系統能自動檢測和識別對照溶液是高度理想的，以便區分對照溶液和血樣的葡萄糖讀數，并且為血樣和對照溶液分別提供溫度補償。有若干專利業已披露了通過各種機制鑒定對照溶液的方法。在美國專利號5，723，284中，披露了血液葡萄糖的電化學測量。，284號專利提出了修飾所述對照溶液，改變從由休止期隔開的兩個氧化時期采集的電流讀數的比例。所述儀器能識別被測量的對照溶液，并且采取適當的措施，以便避免所述結果包含在血樣結果中。,284號專利還披露了應當將所述對照溶液的PH緩沖到4. 8-7. 5的范圍，以便有效。確定測量的是對照溶液還是血樣的葡萄糖含量的另一種方法披露于美國申請公開號2002/0139692A1中。確定的一個指標將電流的下降與被測試的樣品的性質相關聯。美國專利號5，620, 579和5，653，863提出了這樣開始樣品的檢測提供短時間的起始正電位脈沖，以便再氧化任何過早還原的介體。所述起始脈沖被稱作"燃耗時間"。當電位施加在工作電極和反電極上并且將液體樣品導入所述傳感器時，用液體樣品使干燥試劑再水合并且電流開始流動，通常增加到峰值，然后經過"燃耗時間"而下降，該時間長度一般大約為10秒。在此期間，以前還原的介體被再氧化，以便降低出現不正確的高結果的偏差。如果不存在完整數量的樣品，可能導入附加誤差，因為所有試劑不能用于反應，或工作電極和反電極可能不能與樣品完全接觸，因此，減少了在"燃耗"期間的電流。在燃耗時間結束之后，以較低電位或零電位(開路)提供休止周期。在該休止周期期間，葡萄糖氧化反應繼續進行，并且還原介體。然后，再次在工作電極和反電極之間施加穩定電位，并且測量短時間的電流，通常為大約2-10秒。所述電流最初很高，不過隨著介體擴散開始得到控制會迅速下降。在預定時間，將測量的電流用于確定樣品的葡萄糖含量。添加內部參考化合物是分析化學的常見措施，以便提供定量參考信號。這種工作原理業已被用于最近公開的專利申請號W02005/078118中，其中，將內部參考添加到試劑系統中，以便實現某些配方用途。在WO 2004/040286A1中，提出了對照溶液包括選自下列一組的還原物質尿酸，膽紅素，抗壞血酸，亞甲藍，雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷，N, N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙烷磺酸，和醋氨酚，因此，改變在由休止周期隔開的兩個氧化周期中獲得的電流讀數的比例，并且能夠鑒定對照溶液。本發明人業已探詢了區分對照溶液和生物樣品的改良的方法。下面將詳細介紹它們的方法。發明概述本發明提供了在電化學儀工作期間通過數量指標區分對照溶液和生物樣品的方法。在一種實施方案中，本發明是對照溶液，它包括已知數量的葡萄糖，具有合適PH值的緩沖系統，和內部參考化合物。將所述內部參考化合物添加到對照溶液中，以便由葡萄糖監測系統識別對照溶液。本發明提供了檢測內部參考化合物存在，計算數量指標，并且確定對照溶液正在被測試的方法。在一種實施方案中，生物樣品中的分析物是全血中的葡萄糖，而所述介體是鐵氰 化鉀。所述內部參考化合物是在高于氧化所述介體所需電位的電位下可氧化的，所述電位被用于測量分析物的氧化。在所述對照溶液中，具有預定濃度的內部參考和預定濃度的葡萄糖。所述葡萄糖-相關的介體和內部參考在所述電極上通過不同的電位(低和高)被選擇性地氧化。當葡萄糖是分析物時，所述內部參考化合物可以在比用于再氧化還原的介體的電位高至少IOOmV的電位下氧化。用于測量對照溶液的葡萄糖的內部參考化合物包括在所述電極上在合適電位下可氧化的任何物質，如有機金屬化合物，配位化合物，和有機胺化合物。所使用的內部參考化合物的數量與所述對照溶液中的葡萄糖的數量相關。優選的是，選擇內部參考化合物的數量，以便當所述對照溶液中的葡萄糖是測量電化學葡萄糖儀所需最大數量時可以識別所述對照溶液。或者，內部參考化合物的數量可以與葡萄糖的數量成比例地變化。比較在低電位和高電位下的測量結果，提供了檢測內部參考化合物，并因此檢測所述對照溶液的方法。當所述測量方法采用由休止周期隔開的兩個周期時，所述高電壓和低電壓可應用在任一個周期或兩個周期。電位施加在業已接收了對照溶液的傳感器上。將在能氧化內部參考化合物的電位下產生的電流與只能氧化分析物(例如，葡萄糖)，但不能氧化內部參考化合物的電位下產生的電流進行比較。兩種測量電流之間的比例被定義為差異性指數(DI)，提供了用于區分對照溶液和缺少內部參考化合物的液體樣品的手段。 DI = i高電壓/i低電壓其中，i高電壓和i低電壓是在高電壓和低電壓下測量的電流。在較高電壓下，內部參考化合物和還原的介體被氧化，而在較低電壓下，只有介體被氧化。大約I的DI值表示樣品缺少內部參考化合物，并且推測它是生物樣品，而明顯大于I的DI值，優選至少大約I. 5，表明所述樣品是對照溶液。在另一種實施方案中，本發明是適合表明存在對照溶液的內部參考化合物，所述對照溶液被用于測試電化學生物傳感器/穩壓器系統的精確度。當分析物是全血中的葡萄糖時，內部參考化合物可以是可氧化的有機金屬化合物，配位化合物，或有機胺。本發明的一個結果是改善測量的電流的一致性，以及所得到的分析的精確度。如果在相同的氧化時間內施加高和低的電位，如用于葡萄糖氧化的燃耗和讀取時間，不太可能是外部因素，如樣品運動或環境溫度來影響所述差異性指數。在高電壓和/或低電壓下產生的電流的多個讀數可以改善所述結果的精度。另外，當業已確定存在對照溶液時，可以采用特別針對對照溶液的溫度校正算法。通過將不同的溫度算法用于對照溶液和生物樣品(例如，全血)，可以改善臨床結果，并且可以更嚴格地控制范圍值。附圖的簡要說明圖I是根據一種實施方案的生物傳感器的透視圖。圖2是圖I所示生物傳感器的裝配示意圖。圖3是電位與燃耗時間的曲線圖。圖4是按圖3所示施加的電位的電流-時間曲線圖。圖5是例I所示循環伏安圖。
0040]圖6是例2所示循環伏安圖。 圖7是例3所示循環伏安圖。圖8是例4所示循環伏安圖。圖9A-E表示例5所示電位順序。
圖10a-b是例6所示循環伏安圖。圖11是在例7中所獲得的電流-時間曲線圖。圖12是在例8中所獲得的電流-時間曲線圖。附圖的詳細說明優選實施方案的說明下面將以用于測量全血的葡萄糖含量的具有重要商業價值的方法為例描述本發明。不過，本發明的方法具有其他用途，其中，其他分析物，如膽固醇，尿素，肌酸酐，和肌酸存在于諸如尿液，唾液，和間隙液體的生物液體中，并且，其中，對照溶液被用于檢測電化學儀的精度。電化學生物傳感器本發明并不局限于現有技術中業已披露過的多種設計的特定的生物傳感器。可以使用的生物傳感器的一種例子披露于美國專利號6，531，040中，參見圖I和2。生物傳感器10在圖I中以分解示意圖的形式示出。它包括絕緣底板12，在它上面依次印刷有(通常通過絲網印刷術印刷)電導體圖案14，電極圖案(部分16和18)，絕緣(電介質)圖案20，和反應層22，并且最后是覆蓋層28。在覆蓋層28和試劑層22之間形成了毛細管30，構成了用于液體試樣的流動通道。在圖2中示出了所述生物傳感器，其中，底板上的所有元件在相同的平面上示出。反應層22的作用是與液體試樣中的葡萄糖，或其他分析物發生化學反應，并且產生電流，對產生的電流進行測量，并且使它與所存在的分析物相關聯。反應層22通常包括酶，和電子受體。所述酶與分析物起反應以便產生電子，通過電子受體將它們轉移到工作電極表面。所述電子受體又被稱作介體，它通過響應分析物和酶之間的反應被還原。所述反應層中的酶可以與親水聚合物，如聚氧化乙烯組合。可用于與葡萄糖起反應的一種酶是葡糖氧化酶，而所述介體可以是鐵氰化物，它與PH值保持在5-7的緩沖液一起使用。可以使用的另一種酶是葡糖脫氫酶，以及輔酶因子，如吡咯喹啉醌(PQQ)，與pH保持在6-8的緩沖液一起使用。電極圖案的兩個部分16，18提供了電化學測定分析物濃度所必需的各工作電極和反電極。所示出的設計特征是，工作電極和反電極是這樣設計的，使得反電極的主要部分位于工作電極16a的暴露部分的下游(沿流動通道的流體流動方向)。不過，反電極子元件18a位于工作電極上部元件16a的上游，以便當測試液體樣品(例如，全血樣品)的數量不能完全覆蓋工作電極時，進入毛細管空間，在反電極子元件18a和工作電極16a的暴露部分之間形成電連接，這是由于全血樣品的導電性。不過，反電極的用于接觸全血樣品的面積是如此之小，以至只有非常弱的電流能夠從所述電極之間通過，并因此通過檢流器。當接收到的信號低于某種預定水平時，所述傳感器裝置通知用戶進入傳感器間隙的血液量不足，并且應當進行另一次試驗，或者添加更多的血液。盡管電極的特定尺寸并不重要，但反電極子元件18a的面積通常小于工作電極面積的大約10%，更優選小于大約6%。 工作電極和反電極一般是使用電極油墨印刷的，它的厚度一般為大約14ym(0. 00055/ )，通常包括電化學活性炭。導電油墨的成分可以是碳和銀的混合物，選擇它是為了在電極和儀表之間提供低導電電阻，所述儀表通過與傳感器的魚尾端26的導電圖案接觸形成工作連接。反電極可以由銀/氯化銀組成，不過，優選使用碳。為了增強儀表讀數的可再現性，電介質圖案隔離了電極和液體試樣，靠近電極圖案24中央的部位除外。參見圖2，在這種類型的電化學測定中，特定部位是重要的，因為測量的電流不僅取決于分析物濃度和反應層22的面積，而且還取決于工作電極16a接觸含有分析物的試樣的面積。典型的電介質層20包括UV-固化的丙烯酸酯改性的單體，低聚體或聚合物，并且厚度為大約10 μ m(0. OOOf )。所述電介質層還可以是水可固化的或熱可固化的。蓋板或蓋子28適合與所述底板配合，以便形成容納液體試樣的空間，其中，安裝有反電極和工作電極。蓋子28提供了凹形空間30，并且通常是通過對可變形材料的扁平片材軋花形成的。在蓋子28上穿孔，以便提供排氣孔32，并且在密封作業中與底板12結合。可以通過超聲波焊接將所述蓋子和底板密封在一起，其中，首先底板12和蓋子28對齊，然后在震動熱密封部件或凹模和固定顎板之間將它們壓在一起。僅與所述蓋子的扁平的，非凸起的區域接觸。來自晶體或其他傳感器的超聲波能量是以熱量形式在聚合物結合部散失的，以便將熱塑性材料結合在一起。所述凸起的蓋子和底板還可以通過使用蓋子下面的黏性材料結合。蓋子和底板結合的方法更詳細地披露于美國專利號5，798，031中。用于絕緣底板12的合適的材料包括聚碳酸酯，聚對苯二甲酸乙二醇酯，尺寸穩定的乙烯基和丙烯酸聚合物，和共混聚合物如聚碳酸酯/聚對苯二甲酸乙二醇酯，和金屬箔結構(例如，尼龍/鋁/聚氯乙烯層壓制品)。所述蓋子通常是用可變形的聚合物片材制成的，如聚碳酸酯，或用可軋花等級的聚對苯二甲酸乙二醇酯，甘油改性的聚對苯二甲酸乙二醇酯，或金屬箔組合物制成(例如，鋁箔結構)。可以將其他電化學傳感器設計用在本發明中。可用于測量葡萄糖濃度的電化學傳感器是用于Bayer Healthcare' s AscensiaTM DBX 和ELI TE 系統上的傳感器。有關所述電化學傳感器的更多細節可以參見美國專利號5，120，420和美國專利號5，320，732。其他電化學傳感器可以從Matsushita Electric工業公司購買。可用于測量電流的監測系統上的電化學傳感器的其他例子參見美國專利號5，429，735。電化學傳感器可以位于裝有多個傳感器或測試元件的血液葡萄糖傳感器分配儀器中。裝在傳感器分配儀器中的傳感器包的一個例子披露于美國專利號5，660, 791中。
測量全血中的葡萄糖在用于測量全血葡萄糖含量的典型生物傳感器上，用一層試劑通過共同印刷或共同沉積對工作電極和反電極進行包衣。試劑層通常包括某些聚合物和反應成分，即能氧化血樣中的葡萄糖和介體的酶，即，氧化還原化合物，它能再氧化業已通過氧化葡萄糖還原了的酶。還原的介體將來自葡萄糖氧化的酶促反應的電子攜帶到工作電極，并且在電極表面上再氧化。兩個電極之間的電壓差，導致了介體將電子輸送到工作電極，產生與樣品中的葡萄糖的數量成比例的可測量的電流。所述生物傳感器還包括多個試劑層，或可以在每一個電極，工作電極和反電極上包括不同的單個或多個試劑層。正如前面所披露的，測量電流的傳感器在電極上施加固定電位，并且用預定的時間測量所產生的電流，所述時間可能相當短，例如，5-10秒，以便校正可能因為介體的提前還原而造成的偏壓，在優選系統中，用中間通過休止周期隔開的兩段時間施加電位。在圖3A中示出了第一或"燃耗時間"的電位與時間的典型曲線圖。圖4表示所產生的電流-時間的典型的曲線圖。當所述樣品再水合所述試劑層時，電流增加到峰值，使得氧化和還原反應能夠發生，然后隨著擴散的開始降低到對照水平。在這一短暫時間之后，取消所施加的 電位或至少在休止周期減弱，同時，葡萄糖氧化和介體還原繼續進行。然后，用第二段時間再次施加電位，并且在"讀取"時間(例如，10秒)測量電流。由于還原的介體是因為酶的伴隨氧化作用而產生的，所產生的電流最初很高，不過，隨后迅速下降，并且達到穩態擴散-控制狀態。在短的"讀取"時間結束時記錄的電流被用于測定血樣的葡萄糖含量，通過以前獲得的在讀取時間結束時的電流和具有已知濃度的試樣中所包含的葡萄糖之間的相關性進行測量。對照溶液正如前面討論過的，業已采取了各種措施，以便確保對照溶液能提供精確的讀數，并且可以區分生物樣品。本發明采用了可氧化的物質(即，內部參考)，它只能在比用于葡萄糖(或其他分析物)測量高的電壓下可以氧化。這意味著，在足以完全氧化葡萄糖-相關的介體，但不足以氧化內部參考化合物的低電位下，只能測量到葡萄糖。不過，當所述電位高到足以氧化所添加的內部參考化合物時，葡萄糖和內部參考化合物都會被氧化。盡管葡萄糖是在較高電位下氧化的，在較低電壓下進行的測量已經是擴散限制性的，并且不取決于由所述酶氧化的葡萄糖的總量。因此，可以將所述內部參考物質添加到對照溶液中，并且用它鑒定作為對照而不是生物樣品的溶液。在高電壓和低電壓下測量的電流之間的差可以進行比較，以便表明對照溶液的內部參考特征的存在。電流分量之后的差異性指數(DI)使葡萄糖和內部參考化合物相關DI = i高電壓/i低電壓=Q內部參考+i葡萄糖)/i葡萄糖=Ι+i內部參考/i葡萄糖其中，是在較高電壓下測量的電流，在較低電壓測量的電流。由此可見，如果不存在內部參考(如在血樣中應當為零，而應當大體上與相等。因此，DI值將接近I。當存在內部參考時，DI的值應當大于1，這取決于相對葡萄糖的數量的參考化合物的數量。如果添加到對照溶液中的內部參考的數量提供了類似于氧化葡萄糖-相關介體所產生的電流，所述DI值可能大約為2。內部參考應當包括在適用相當于高葡萄糖濃度的對照溶液的量內。通常使用相當于低，正常，和高葡萄糖濃度的若干種對照溶液，以便測試葡萄糖儀。例如，如果選擇內部參考的數量，以便使所述對照溶液中的最高葡萄糖濃度的DI值為I. 75或以上，來自內部參考的電流與最低葡萄糖對照溶液中的葡萄糖的電流相比較大。這樣，相同數量的內部參考用于具有低葡萄糖濃度的對照溶液甚至能提供更大的DI值。所述高DI值能在存在對照溶液，而不是生物樣品，如全血中提供更高的可信度。很明顯，諸如DI值的數量指標相對更定性的方法具有優點，正如在其他專利中所指出的，所述定性方法取決于燃耗或讀取時間中的電流-時間曲線的形狀。添加在較高電壓下氧化的內部參考，提供了不取決于酶促反應和對照溶液的組成的結果O在一種實施方案中，添加到對照溶液中的內部參考化合物的數量與存在的葡萄糖的數量相關。就是說，所述對照溶液中的內部參考的數量與葡萄糖濃度成比例，以便維持大體上穩定的DI值。一種方法是使用足夠的內部參考以便提供大約I. 5或以上的DI，此時使
用的最大數量的葡萄糖為大約300mg/dL，然后，減少內部參考的數量，以便含有較低濃度的葡萄糖的對照溶液將DI值保持為I. 5或以上。將內部參考添加到對照溶液中，使它能夠方便地區分對照溶液和生物樣品，并且提供改善了的分析精度。內部參考化合物可以是能夠在理想電位下電化學氧化的任何化合物。重要的是，要了解并非所有可化學氧化的化合物都是能夠在合適的電位或任何可氧化的電位下電化學氧化的。可化學氧化的物質(例如，存在于均勻溶液中)可以不是在合適電位下可電化學氧化的，因為在所述電極上的電子轉移動力學屏障必須克服。因此，還原劑的化學性質在所述電極上可能不是可電化學氧化的。根據試劑傳感器系統中介體的氧化還原電位，可能需要具有不同氧化還原電位的內部參考化合物。例如，如果所述試劑系統中的介體是釕六胺(Ru (NH3) 6+3)，可以將配位化合物亞鐵氰化鉀或有機金屬化合物二茂鐵及其衍生物用作所述對照溶液中的內部參考。另一方面，如果所述介體是所述試劑系統中的鐵氰化物，就可以將諸如Bis-Tris或4-氨基芐腈的其他化合物用作所述對照溶液中的內部參考。在任何情況下，所述內部參考化合物將具有至少比所述介體的氧化還原電位高IOOmV的氧化還原電位。內部參考化合物的例子包括，但不局限于，有機胺，如3-(N_嗎啉代)丙烷磺酸[MOPS]，N-(2-羥基乙基)哌嗪-N1-(2-乙烷磺酸)[HEPES]，2-[-羥基-1，1-雙(羥甲基)乙基氨基]乙烷磺酸[TES]，2-嗎啉代乙烷磺酸[MES]，雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷[Bis-Tris]，4-氨基芐腈，4-氨基苯甲酸，和4-碘代苯胺。在下面的實施例中，證實了Bis-Tris和若干種其他化合物是可用于含有葡萄糖的對照溶液的有用的內部參考。盡管可以將Bis-Tris用作內部參考，還可以將它用作緩沖液。所述對照溶液的pH是葡萄糖被酶，如葡糖氧化酶氧化的反應中的重要因素。為了測量葡萄糖，在使用葡糖氧化酶時，優選大約5-7的pH，在使用葡糖脫氫酶時，優選使用大約6-8的pH。通常提供緩沖液，以便確保葡萄糖氧化以預期的速度進行。本發明的優點是，參考化合物和緩沖液可以使分開的，可各自具有不同的功能，因此，能夠分別優化每一種功能(緩沖和內部參考)。所述緩沖液可以從與酶促試劑相容的物質中選擇。其例子包括，但不局限于檸檬酸緩沖液和磷酸緩沖液。用于模擬血液流體特性的聚合材料可以包括聚氧化乙烯，聚羥乙基甲基丙烯酸酯，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，黃原膠，其用量為大約12-20被％。存在于對照溶液中的葡萄糖的數量通常等于大約30-400mg/dL，該范圍跨越了血樣的預期的葡萄糖含量。
其他添加劑可以包括鹽，緩沖劑，染料，抗微生物制劑，聚合物，增稠劑和表面活性劑。對照溶液的工作模式顯而易見的是，導入可在比用于氧化葡萄糖-相關介體更高的電壓下氧化的內部參考材料，使得有必要在測量過程中的某些時間點施加較高電壓。在使用上述兩段時間時，即"燃耗"和"讀取"時，在燃耗和讀取時間內的電位步驟的各種組合可用于提供識別對照溶液的DI值和可以測定對照溶液的葡萄糖含量的電流。在最簡單的方法中，在燃耗時間內施加高電壓，而在讀取時間內施加低電壓.因此，所述差異性指數為DI = i燃耗/i讀取當存在內部參考時，在燃耗時間內測量的電流包括氧化內部參考所產生的電流加上氧化葡萄糖-相關介體所產生的電流。在讀取時間內測量的電流只是通過氧化葡萄糖所產生的，因為所述電壓太低，以至不能氧化內部參考。因此，燃耗電流與讀取電流的比例體 現了內部參考電流與葡萄糖測量電流的值。另外，在燃耗時間內可以施加高電壓和低電壓，以便檢測內部參考的存在，而在讀取時間內只使用低電壓。這種電位步驟的組合仍然能維持采用來自高電壓的電流與來自低電壓的電流比例的工作原理。當發生從低電壓到高電壓或從高電壓到低電壓的變化時，可以觀察到電流的明顯變化。所述"低"電壓不一定與用于測量葡萄糖的讀取時間的電壓相同。比較電壓只需要比氧化內部參考的電壓低。因為所述燃耗時間相當于樣品水合所述試劑的時間，所述電流可以在燃耗期間改變，正如在圖4所示一般性示意圖中所表明。因此，在高電壓和低電壓之間進行一次以上變換是有利的，以便確保DI值不受在燃耗時間內試劑可利用性變化的影響。在另一種方法中，在一部分讀取時間內使用高電壓(S卩，能氧化內部參考的電壓)。因此，所述DI可以通過僅測量在讀取時間內的高和低電流而在讀取時間內確定。該方法的優點是，可以避免在燃耗時間內出現的任何試劑可利用性的變化。同樣，使用低電壓和高電壓之間的一次以上的轉換可能是有利的。在本發明的另一種實施方案中，高電壓和低電壓之間的電位的經常性循環被用于影響在讀取時間內電流-時間的形狀，整體上參見圖4。所述曲線通常表現出由位于和接近電極表面的還原介體的消耗而導致的電流的迅速衰減。因此，總的葡萄糖含量是通過與擴散-限制電流的相關，而不是測量所述對照溶液中的總葡萄糖測定的。顯而易見的是，如果要獲得一致性的和精確的測量的話，選擇時間作為葡萄糖參數是重要的。一般，本發明的對照溶液包括能在比氧化葡萄糖所需電位更高的電位下電化學氧化的化合物。因為葡萄糖相關介體(例如，鐵氰化鉀)的氧化需要200mV的電位，此相對于鐵氰化物的反電極的電位，所述內部參考化合物的氧化電位相對相同的反電極應當至少為400mVo例如,使用Bis-Tris作為參考,所述氧化電位為大約600mV,如果反電極是通過還原鐵氰化物支持的話。其他例子包括4-氨基芐腈，4-氨基苯甲酸，4-碘代苯胺，它們還可以在+400至+600mV的電位范圍內氧化，該電位是相對通過還原鐵氰化物支持的反電極的電位而言的。檢查將內部參考添加到對照溶液中的作用的一種方法是使用循環伏安法。除了施力口固定電位之外，使用了可變電壓，相對所述反電極從負電壓向正電壓掃描。以下實施例說明了內部參考的概念和使用，以及它用于對照溶液的自動檢測的方法。例I含有50mM NaCl的水溶液與用作內部參考的含有50mM NaCl和50mM Bis-Tris的另一種溶液進行比較。試驗包括相同的組合物，不過包括350mg/dL葡萄糖的第二組樣品。其中不包含酶或介體，以便不能發生葡萄糖的氧化。圖5表示當電位差以25mV/秒的速度在-400 mV和+1200mV之間循環，以及銀/氯化銀參考電極使用CH儀器公司的電化學工作臺時的電流與電位。可以看出的是，在電位差達到+600mV之前電極之間的電流沒有開始流動。對于不含Bis-Tris的樣品來說，在整個電位范圍內的氧化電流大體上為零。另一方面，在使用Bis-Tris時，在+800mV下具有明顯的電流，從大約+600mV處開始。可以得出的結論是，當不存在酶和介體時，Bis-Tris的氧化與有和沒有葡萄糖時相同。通過比較圖5中有和沒有Bis-Tris的伏安圖之間在+800mV下的伏安電流，可以明確區分含有50mM Bis-Tris的溶液。
例2在本實施例中，重復了例I的試驗，參見圖6，所不同的是，用具有一層鐵氰化鉀的碳的反電極，而不是在例I所使用的Ag/AgCl2反電極。在不包含酶和介體時，Bis-Tris的氧化不受葡萄糖存在與否的影響。不過，在+400mV之后氧化電流開始上升，并且在+600mV時達到顯著水平。因此，與圖5中的伏安圖相比，在沒有內部參考的情況下，背景電流大體上保持為零。唯一的差別是，氧化電流在較低電位下升高。這種差別完全是由于不同的反電極造成的。顯而易見的是，在低于+400mV時沒有氧化電流。因此,可以看出Bis-Tris能明確區分葡萄糖氧化，葡萄糖是在略高于零電位的電位下開始氧化的，正如在下面的實施例中所表明的。例3在圖5和6中示出的例I和2表示在有或沒有葡萄糖的溶液中存在內部參考(Bis-Tris)，但是缺少檢測葡萄糖存在所需要的葡糖氧化酶和介體。在圖7所示例子中，使用了例I和2的溶液，不過添加了葡糖氧化酶和鐵氰化鉀(介體)，這樣，當存在葡萄糖時，它會被氧化，就像在電化學葡萄糖傳感器中那樣。比較圖7和圖6可以看出，在循環伏安圖中出現的伏安特征(電流與電位形式)明顯不同。在零伏電位周圍出現的氧化電流峰值表明葡萄糖被氧化。當不存在葡萄糖時，在所述電位升高到OmV以上時才因為有某些背景活性產生很少的電流。當存在350mg/dL的葡萄糖時，產生了大量的電流，所述特征性峰值高于或低于零伏。在大約+400mV的電位下達到了穩態狀態，可將它用于與所存在的葡萄糖的數量相關。在O和350mg/dL葡萄糖含量下，400mV之前的氧化電流與有否添加內部參考化合物的電流相同。當所述電位達到+600mV時，用含有Bis-Tris的溶液觀察到的電流比沒有Bis-Tris的溶液觀察到的電流高，無論葡萄糖濃度為O或350mg/dL。因此，可以鑒定含有內部參考化合物的對照溶液。例4在例1-3將Bis-Tris用作參考化合物。在本實施例中，示出了若干種其他內部參考化合物。圖8表示三種其他內部參考化合物，4-氨基苯甲酸，4-氨基芐腈和4-碘代苯胺的循環伏安圖。這三個循環伏安圖是從Ascens iaAUTuDISC (dex)的商業化葡萄糖傳感器條獲得的。這三種內部參考化合物分別添加到對照-等同溶液中，它含有20-24%PVP聚合物，在檸檬酸緩沖液中的pH為5-5. 5，但是不含葡萄糖。4-氨基苯甲酸，4-氨基芐腈，和4-碘代苯胺的濃度分別為50mM。從圖8中可以看出，盡管在零伏電位之后的第一個氧化峰大體上相同，但在+0. 3伏之后的電流依賴于所添加的內部參考化合物而不同。在圖8中，將O. 1V-0. 3V的電位視為低電位，它被用于僅僅通過氧化介體測量葡萄糖。始于+0. 4伏到+0. 8伏的電位被視為高電位，它負責氧化介體和內部參考。在+0. 3至+0. 8伏的電位區間，當存在內部參考時的所有電流比在對照溶液中不添加內部參考時的電流高。例5存在多種組合高電位和低電位以氧化并且測量內部參考，以便檢測對照溶液的存在同時測量葡萄糖濃度的方法。圖9A-E表示用于合并高電位和低電位的某些電位順序(波
形)。在每一種場合下，"燃耗"時間之后是等待時間，然后是"讀取"時間，正如前面業已披露的。圖9A表不在燃耗時間具有高電壓,在讀取時間具有低電壓的電位順序,它相當于簡單的燃耗-等待-讀取電位順序。圖9B在燃耗時間的前半程具有低電壓，隨后在相同的燃耗時間內具有高電壓的電位順序。在圖9C中，電位順序是在燃耗時間的前半程具有高電壓，隨后在相同的燃耗時間內具有低電壓。圖9D表示在讀取時間的前半程具有高電壓，之后在相同的讀取時間內具有低電壓的電位順序。在圖9E中示出了類似的電位順序，在讀取時間的前半程具有低電壓，在相同的讀取時間內具有高電壓。例6圖10a-b表示增加內部參考，在這里是Bis-Tris的濃度的作用。在圖IOa中，含有50mM NaCl的對照-等同的溶液(不含葡萄糖)表現出將內部參考的濃度從O增加到50mM以及增加到IOOmM的Bis-Tis (含有IOOmM NaCl)的作用。Bis-Tris的存在是明確可見的，并且增加它的濃度進一步加大了 +600mV下的電流。在圖IOb中，在具有相同配方的所述對照溶液中存在350mg/dL的葡萄糖，正如由OmV以上的明顯的峰所表明的。由于葡萄糖電流在大約+600mV的電壓下仍然可見，檢測Bis-Tris存在所需要的數量比不使用葡萄糖時大。因此，內部參考的濃度應當是這樣的，當對照溶液含有高葡萄糖濃度時可以檢測它的明確存在。這樣，當對照溶液含有較低葡萄糖濃度時，內部參考的存在將更為明顯。例7對本實施例來說，進行了比較添加和沒有添加Bis-Tris作為內部參考的對照溶液和全血樣品的試驗。在所有三種情況下，樣品都是Ascensia AUT0DISC 商業測試條。測試順序為施加+400mV的電位4秒，然后施加+600mV的電位4秒，在開路狀態(不對電極施加電位)靜止5秒，然后施加+200mV的電位5秒。在圖11中示出了三種類型的樣品電流曲線。計算兩種比較的差異性指數(DI)。情形I-a:在8秒燃耗時間的測量的電流與在4秒燃耗時間的電流進行比較。情形I_b :在8秒燃耗時間的測量的電流與在2秒讀取時間的電流進行比較。沒有向IOOmM NaCl和IOOmM Bis-Tris試液或向全血樣品中添加葡萄糖。情形I_a等同于圖9B的順序，而情形I-b等同于圖9A。這些試驗的DI值和DI值的相對變化如表2所示。在兩種情況下，含有內部參考Bis-Tris的對照溶液的DI值為不含內部參考的對照溶液和全血樣品的DI值的500%。以上結果表明，含有內部參考的對照溶液與缺少參考化合物的對照溶液或全血相比能夠方便地檢測。表2在O葡萄糖含量下的DI值和DI值的％ -變化
權利要求
1.在電化學傳感器工作期間區分對照溶液和液體樣品的方法，所述電化學傳感器測量在所述液體樣品中的分析物的濃度，該方法包括以下步驟 提供具有工作電極和反電極的電化學傳感器，所述電化學傳感器進一步包含含有內部參考化合物和預定數量的所述分析物的對照溶液，所述內部參考化合物具有比測量所述分析物的氧化所需電位更高的電位； 在第一電位期間向所述電化學傳感器施用第一電位，所述第一電位足以氧化所述分析物但不足以氧化所述內部參考化合物，并且測量所得到的第一電流； 在第一電位期間向所述電化學傳感器施用第二電位，所述第二電位足以氧化所述分析物和所述內部參考化合物，并且測量所得到的第二電流； 基于所述的第一電流和第二電流確定是否存在對照溶液。
2.根據權利要求I的方法，其中所述第二電位是在所述第一電位之后施用的。
3.權利要求I的方法，其進一步包括計算差異性指數(DI)，定義為DI= 電壓/i低電壓 其中是施用所述第一電位所產生的電流；和 i低電壓是施用所述第二電位所產生的電流， 其中確定是否存在對照溶液的行為是基于所述差異性指數。
4.權利要求3的方法，其進一步包括 當所述差異性指數大到足以超過1，便確定存在對照溶液；和 當所述差異性指數為大約I時，確定存在液體樣品。
5.權利要求I的方法，其中，所述在所述電化學測試傳感器中所述內部參考化合物的量與所述對照溶液中的所述分析物的數量成比例。
6.權利要求I的方法，其中，所述分析物是葡萄糖，而所述液體樣品是血液。
7.權利要求6的方法，其中葡萄糖是通過葡糖脫氫酶氧化的，且其中所述對照溶液包括能夠使PH保持在6-8之間的緩沖劑。
8.權利要求I的方法，其中所述內部參考化合物是可氧化的有機金屬化合物，配位化合物，或有機胺化合物。
9.權利要求I的方法，其中，所述內部參考化合物是3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸，N-(2-羥乙基)哌嗪-#-(2-乙烷磺酸)，2-[(2-羥基-I，I-雙(羥甲基)乙氨基)乙烷磺酸，2-嗎啉代乙烷磺酸，和雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷[Bis-Tris]，4-氨基芐腈，4-氨基苯甲酸，或4-碘代苯胺。
10.如權利要求8的方法，其中，所述內部參考化合物是Bis-Tris。
全文摘要
測試用于測量分析物在生物樣品中的存在，特別是葡萄糖在全血中的存在的電化學儀的性能，包括引入含有預定數量的分析物和預定數量的內部參考化合物的對照溶液。所述內部參考化合物是經過選擇的，以便它在比用于氧化所述分析物大的電位下氧化，從而使它能夠區分對照溶液和生物樣品。
文檔編號G01N27/26GK102778487SQ20121024054
公開日2012年11月14日 申請日期2006年4月7日 優先權日2005年4月8日
發明者G·P·比爾, 伍煥平 申請人:拜爾保健有限公司