微流體裝置的制作方法

專利名稱：微流體裝置的制作方法
微流體裝置 本申請是中國專利申請號200580035911. 7的分案申請，原案申請的申請日為2005年9月15日，其對應于國際申請號PCT/US2005/033347。A.相關申請的交叉參考根據35U. S. C. § 119(e)，本申請要求2004年9月15日提交的美國臨時專利申請序列號60/609，970的優先權，將其全部公開內容納入本文作參考。B.關于聯邦政府資助的研究或開發的聲明在國防部授予的項目號W911SR-04-P-0047、NIH授予的資助號5R01HG003583-01、HSARPA授予的合同號NBCHC050133、HSARPA授予的順序號TTA-1_0014(協議號W81XWH-04-9-0012)中一個或多個的政府支持下進行本發明的各個方面。政府享有本發明的某些權利。 C.背景在過去的10-20年中，開發了各種不同且常常不相容的微流體裝置設計，通常其目的是減小生物分析方法中的樣品體積需求。在不存在控制外部尺寸形狀因子、上游和下游外部接口的特性、以及內部微流體通路的長度、橫截面幾何形狀和直徑的標準的情況下，這種微流體裝置常常互不相容，并且與現有的上游純化和下游分析裝置不相容。盡管微型制造取得的進步使得可能在微升、甚至納升或皮升級進行分析，但首次獲得的許多生物和環境樣品的體積比現有微流體分析裝置的量級大得多并與其不相容。因此，本領域需要一種模塊化微流體組件，它可用作集成流體系統的組件，可將具有不同外部尺寸形狀因子、外部接口和/或內部流體幾何形狀的微流體組件連接成有效的流體連接，并可連接微流體制備和/或分析組件和在較大量級上操作的制備模塊或方法。D.發明概述本發明解決了本領域的這些和其它需求。E.附圖簡要說明本領域技術人員將理解，下述附圖僅僅為了說明目的，而不旨在以任何方式限制本發明的范圍。圖I說明了樣品捕獲和純化模塊(SCPM)和生物處理器模塊(BPM)工作流程的一種實施方式。圖2說明了毒素試驗工作流程的一種實施方式。圖3說明了集成生物處理器模塊(BPM)的樣品捕獲和純化模塊(SCPM)的一種實施方式。圖4說明了芯片外流過筒(off-chip flow-through cartridge)的一種實施方式。圖5 說明了行波流過式珠攬拌器(traveling wave flowthrough bead beater)的一種實施方式。圖6說明了流過式(flowthrough)超聲的一種實施方式,其中將探針直接插入收集器流出物。
圖7說明了核酸純化模塊的一種實施方式。圖8說明了納米生物處理器模塊化系統的一種實施方式，包括空氣取樣器、樣品濃縮模塊以及微流體樣品擴增和分析模塊，可用于生物防衛應用。圖9說明了 MOV 閥的一種實施方式。

圖10說明了顯微制造泵的一種實施方式。圖11說明了顯微制造路由選擇器的一種實施方式。圖12說明了提供樣品凈化基質的三維連接工作通道的橫截面的一種實施方式。圖13說明了將一種或多種反應物加入反應室的流體線路的一種實施方式。圖14說明了循環測序模塊(CSM)重復單元的一種實施方式。
圖15說明了一個生物處理器單元的一種實施方式。圖16說明了米用外部傳動的MOV閥和泵的微芯片筒的一種實施方式。圖17說明了 12單元生物處理器筒的一種實施方式。圖18說明了非生物處理器單元和微芯片設計的一種實施方式。圖19說明了微芯片實施方式MBI-11。圖A顯示蒙板(mask)設計，其中流體層顯示為藍色，傳動層顯示為紅色。圖B顯示其中一個組件，其具有兩組輸入和輸出儲存室、反應室和存儲室以及三向路由選擇器。該閥門的8條氣動控制線終止于與氣動裝置相連的標準連接器。圖C顯示出蝕刻的微流體晶片。圖D顯示出組裝的MBI-Il三層微芯片，用實驗室記號筆標出了比例尺。圖20說明了微芯片實施方式MBI-12，其裝有集成樣品制備的顯微毛細管電泳(μ CAE)所用的納米流體結構。用藍色表示流體通道，用紅色表示MOV傳動通道。圖21說明了具有雙分析通道的雙成對-末端讀出親和捕獲樣品凈化的一種實施方式。深色層是微流體，灰線是工作層。閥傳動層未顯示。虛線框確定了 DNA分析重復單
J Li ο圖22說明了集成的樣品、制備、凈化和分析MINDS微芯片重復單元的一種實施方式。圖23說明了 16-通道200nL循環測序模塊微芯片的一種實施方式。圖24說明了加入微珠的集成的樣品、制備、凈化和分析MINDS微芯片重復單元的一種實施方式。顯示出25nL樣品制備室具有兩條親和捕獲和分離通道。圖25說明了設計為包括板載試劑、核酸純化和毒素模塊的一次性筒的微芯片的一種實施方式。圖26說明了微芯片接口裝置的儀器控制的一種實施方式。圖27說明了 MiniPrep設備中裝配有管道的微芯片真空吸盤的一種實施方式。圖28說明了操縱MiniPr印設備內的生物處理器微芯片的連接硬件的一種實施方式。圖29說明了路徑長度增加的RT-PCR室的一種實施方式。圖30說明了旋轉掃描器的一種實施方式。圖31說明了可用于核酸分析(RT-PCR和μ CAE)的生物處理器模塊的蒙板設計的
一種實施方式。圖32說明了生物處理器微芯片的晶片級設計的一種實施方式，其中在6"晶片上有48個單元，各單元具有RT-PCR和μ CAE能力。圖33說明了多重生物處理器線路的一種實施方式。MOV路由選擇器將樣品分為三個多重RT-PCR反應，產生法醫(forensics)樣品和再測試樣品，并可選擇樣品進行μ CAE驗證。圖34說明了用8"晶片模擬12"晶片。圖35顯示出用珠在一定濃度范圍內捕獲大腸桿菌(E. coli)。圖36顯示出在大腸桿菌的免疫捕獲中偶聯于DYNAL 珠的單克隆抗體的滴定。圖37顯示出臘樣芽孢桿菌(B. cereus)對大腸桿菌的免疫捕獲的影響。
圖38顯示出用免疫捕獲從摻入(spike)空氣取樣器液體中回收大腸桿菌。圖39顯示出圖38的特定滴度104CFU/ml的數據組。圖40顯示對通過IOOmg 二氧化娃提取物_清潔(Extract-Clean) SPE介質床的各種樣品組分中高滴度大腸桿菌進行濃縮的結果。圖41顯示出通過IOOmg 二氧化硅提取物-清潔SPE介質床的各種組分中存在的高濃度大腸桿菌樣品的總細菌百分數。圖42顯示出用二氧化硅珠(左)和大珠(右)回收β -半乳糖苷酶。圖43顯示出用大珠回收大腸桿菌。圖44顯示出將凈化樣品直接注射入分離通道的直接注射方案的一種實施方式。F.發明詳述應理解，上述總說明，包括附圖以及以下詳述僅為示范性和解釋性，不限制本公開。在本公開中，采用單數形式時包括復數，除非另有特別說明。同時，采用“或者”指“和/或”，除非另有說明。相似地，“包括”、“包含”不旨在限制。術語如“元件”或“部件”包括包含一個單元的元件和部件，以及包含一個以上單元的元件或部件，除非另有特別說明。本文所用的章節標題僅為組織目的，不旨在限制所述主題。本文特別將引用的所有參考文獻和參考文獻的部分，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍和論文的全文納入本文作參考，用于所有目的。在一個或多個摻入的參考文獻與本申請矛盾的情況下，本申請居于控制地位。本公開提供了集成的模塊化系統，它具有制備和分析各種樣品的靶分析物的補充功能。本文所述系統可用于制備和分析各種靶分析物，包括但不限于分子(如毒素、藥物)、生物分子(如核酸、多肽、脂質)、細胞(如真核和原核細胞(如芽孢桿菌、埃希菌))、芽孢(spore)(如炭疽桿菌(B. anthracis))、病毒(如流感、天花)和其它材料，可根據實施人的判斷進行選擇。在各種示范性實施方式中，可用一個或多個系統模塊進行樣品制備和分析，如下所述。在一些實施方式中，本文所述系統包括用于樣品捕獲或純化(SCPM)的前端模塊，在典型的實施方式中，它還能將捕獲和/或純化的樣品引入生物處理器模塊(BPM)，該模塊可包括一個或多個微流體裝置(如微米級、納米級或皮米級裝置)，用于進一步制備和/或分析。因此，本文公開的是用于捕獲、濃縮或純化樣品中的靶分析物，然后將該靶分析物引入一個或多個微流體裝置的模塊化系統和方法。在一些實施方式中，微流體裝置可向芯片外平臺供料。在各種示范性實施方式中，SCPM可通過各種方法，如通過裂解、乳化、超聲、離心、層析、固相提取(SPE)、免疫捕獲(如免疫磁性分離(IMS))、基于珠的捕獲及其組合捕獲、純化或濃縮靶分析物。在一些實施方式中，SCPM可將大規模樣品溶液減少到小規模體積(例如通過將毫升濃縮至微升或更小的體積)以引入一種或多種微流體裝置。這些SCPM實施方式能夠用作模塊化規模接口，允許將微米級和/或納米級裝置集成到包括在較大規模上操作的操作模塊的流體系統中。這些SCPM實施方式可允許具有不同尺寸形狀因子的模塊集成到流體相連的系統中。在一些實施方式中，SCPM可通過去除可能存在于粗樣品中的一種或多種物質以及作為下游加工或分析的抑制劑的一種或多種物質而純化樣品。與常規方法相比，通過捕獲、純化或濃縮樣品中的靶分析物，SCPM可提高本文所述系統的靈敏度。BPM 一般包括一個或多個微流體裝置。本文所用“微流體裝置”指適合操作、儲存、加工或分析毫升以下量，如微升(UL)、納升(nL)和/或皮升(pL)體積的流體的裝置。在各種示范性實施方式中，微流體裝置可包括一個或多個微芯片(如微米級、納米級或皮米級裝置)、毛細管及其組合。可通過本領域已知的顯微制造技術生產本文所述微芯片，該芯片可包括閥、泵、室、通道、儲存庫等，可能適合加工或分析一種或多種靶分析物。在各種示范性實施方式中，微流體裝置可以是基于微芯片的筒(cartridge)，可以是不可替換/不可 重復使用的或一次性的。本文所述微芯片可具有任何形狀或尺寸。例如，微芯片可以是具有一個或多個輻射狀樣品制備或分析單元的圓筒，可與操作微芯片的設備一起使用。在一些實施方式中，微流體裝置可以是自動化裝置。例如，可將微芯片儲存在“CD換片裝置”中并自動插入、操作來進行一項或多項功能，如果需要，由可編程設備儲存。因此，設備可提供微芯片處理、外部氣動操作、溫度控制、試劑溶液等，以同時或連續操作一個或多個微芯片。在一些實施方式中，SCPM能夠將可包含一種或多種附于其上的祀分析物的懸液、膠體(如乳劑)或捕獲珠引入BPM，在各種這樣的實施方式中，將其引入BPM的一個或多個微流體裝置中。在這種實施方式中，BPM的一個或多個微流體裝置適合移動一種或多種所述固體如珠使其通過該裝置的微流體通路而不堵塞。珠或其它固體從SCPM進入BPM可用于實現含分析物的樣品體積的下調，從而使大規模模塊與小規模裝置接口連接(interface)。因此，這種SCPM和BPM實施方式能夠使規模和/或尺寸形狀因子不同的裝置模塊化地接口連接，允許將微米級和/或納米級裝置集成到包括在較大規模上操作的操作模塊的流體系統中。在適合基于珠的微流體裝置加工的各種示范性實施方式中，可通過流體線路內插入閘板或其它物理阻礙物、磁場、珠的親和捕獲、電捕獲或其它機制將珠可逆地固定在微流體通道或線路的各點上。在各種實施方式中，可使珠通過流體通道或線路，并可對其進行物理或化學加工。隨后，可將粘附、附著或吸附或連接于珠的分析物移動到下游反應室中，在芯片上(即在微流體裝置內)進行進一步加工或分析。在一些實施方式中，如果需要，可洗脫掉珠上的物質，如靶分析物。在一些實施方式中，具有不同親和力的珠系列可連接成具有高特異性和靈敏度的較復雜的生物分子工藝，如一個步驟可將細胞結合到珠上，下一步驟可將特定DNA序列固定在珠上，以在反應前凈化，第三種珠可用于結合反應產物，以在引入質譜等之前進行純化。在一些實施方式中，根據本領域技術人員的判斷選擇的各種步驟中也可采用含有親和捕獲試劑的凝膠。在一些實施方式中，BPM可用作獨立的樣品制備系統。因此，在各種示范性實施方式中，BPM可連接于各種上游樣品收集裝置(如氣溶膠取樣器)或給下游分析平臺或方法(如質譜(MS)、核磁共振(NMR)、毛細管陣列電泳(CAE)、逆轉錄-PCR(RT-PCR)、單分子檢測系統等)供料。然而，在一些實施方式中，可在微芯片的通道、儲存庫、反應室等或其組合中進行一種或多種分析方法。本文所述系統可廣泛應用于生物防衛監測、傳染病診斷、法醫學、基因組學、蛋白質組學和其它領域。在生物防衛中，該技術提供了裝配緊密的部件，可用作(例如)建筑物、飛機或機場的野外病原體監測裝置，或用于實驗室以解決日益增長的測試需求。該系統可制備和分析來自空氣、生物液體、農產品或其它來源的樣品，以檢測目標病原體。低消費成本與自動化制備和分析的組合對分子診斷有顯著影響。在臨床診斷中，可使該技術適合產生采用無縫集成的一次性裝置(目的是產生所需的額外分析)的PCR診斷設備。本文所述系統也可應用于藥物遺傳學、人類藥物遺傳學、生物醫藥研究、動物和植物分型以及人類鑒定。所述系統的其它應用包括分子診斷，如檢測微生物、生物體基因型分析、測序和法醫學；產生用于各種方法(如RT-PCR、再測序和蛋白質分析)的樣品的制備和分析平臺；產生用于大多數分析平臺，如質譜、毛細管陣列電泳、差別展示和單分子檢測的樣品制備臺；以及用于生物防衛應用。本文所述系統可(例如)通過采用機器人整體或部分自動化，它的大小可縮放，從手持式裝置至野外檢測器至實驗室設備。I.靶分析物的濃縮在一些實施方式中，在引入微流體裝置進行進一步加工或分析之前可濃縮樣品中的靶分析物。在一些實施方式中，可用可容納大規模體積(如毫升至升)并將一種或多種靶分析物濃縮到小表面(例如微珠)上的一種或多種芯片外流過裝置濃縮一種或多種靶分析物。在一些實施方式中，可采用可由容納大規模體積的芯片外儲存庫供料的芯片上的流過裝置濃縮一種或多種靶分析物。在一些實施方式中，芯片上和芯片外的裝置可組合使用。在一些實施方式中，捕獲的靶分析物可選擇性洗脫到適合下游加工或分析的體積中。如圖I所示，SCPM I可包括以下模塊免疫捕獲模塊2、裂解模塊3、核酸純化模塊4，并可與納米生物處理器5集成。在一些實施方式中，可免疫捕獲分子如毒素，并將其直接供給納米生物 處理器5(圖2)。適合將靶分析物捕獲到表面上的材料包括各種類型的提取基質材料，可由珠、整體料(monolith)、改性聚合物等組成。在一些實施方式中，提取基質材料可包含各種連接的官能團(如C4、C18、羧基和氨基)，各種珠或化學物質的混合床，或親和捕獲部分(如抗體、凝集素、半抗原、配體(如生物素)、受體、核酸等)。在一些實施方式中，可用羧化珠，如SPRI或未改性的二氧化硅珠捕獲核酸，并洗脫入合適體積的極性溶劑如水中。在一些實施方式中，可采用納米級的捕獲方法，其采用二氧化硅毛細管，其中離液劑如硫氰酸鹽將核酸壓到毛細管表面上，洗滌后，可將濃縮和純化的核酸洗脫入緩沖液中用于進一步加工或分析(參見美國專利號6，489，112)。各種靶分析物的其它固相捕獲方法參見例如，Weimer等，200IAppI. Environ. Microbiology, 67 :1300-1307。a)芯片外流過式(off-chip flowthrough)裝置在一些實施方式中，可用芯片外流過裝置130濃縮靶分析物，該裝置通過濃縮基質140連通大規模樣品體積(圖4)。在一些實施方式中，濃縮基質保留了靶分析物，而本體溶液和干擾化合物通過該裝置。在一些實施方式中，干擾化合物或不需要的化合物保留在基質140上，而靶分析物通過該裝置。根據樣品形式(表面、水、土壤、氣溶膠、生物物質)，可采用粗過濾(ca. 20 μ m)去除本體污染物和顆粒。在一些實施方式中，芯片外流過裝置的底板上可包括燒結的開口 150，其中加載基質，該裝置還可包括用于洗脫的鉆孔Imm)(圖4)。濃縮基質可采用非親和介質或親和捕獲介質，如本文所述。與BPM微流體裝置集成的芯片外流過裝置的例子見圖3。i)非親和捕獲本文所用“非親和捕獲”指通過疏水、親水或離子相互作用在介質上非特異性捕獲革巴分析物。在一些實施方式中，靶分析物的非親和捕獲可采用Extract-Clean 固相抽提(SPE)試劑盒(Alltech)，該試劑盒包括I. 5mL (或4mL)柱，該柱中預先填充有含有20 μ m聚乙烯熔塊的一種SPE介質。該介質可捕獲靶分析物用于進一步洗脫，或可允許靶分析物通過而不需要的物質保留在該介質上。例如，范圍分別為約l_104CFU/mL、約IO2-IO3PFU/ mL和O. l-102ng/mL的細胞、病毒或細胞裂解物中的蛋白質可施加于介質。可手工或通過機器人加載樣品，如果需要，用真空使介質流通。在一些實施方式中，靶分析物結合于可洗滌的填充材料，可通過從介質中洗脫來濃縮靶分析物。在各種示范性實施方式中，可采用3mL注射器筒體SPEC(ANSYS Technologies)，其裝有二氧化硅微纖維盤，以防止流動特性和保留特征的溝通(to prevent channeling for flow properties and retentioncharateristics),或可采用大珠(Big Beads)。也可采用標準或特殊色譜介質濃縮或純化所需材料。在任何所選介質中，本領域普通技術人員可優化床體積、不同介質制備、洗滌和洗脫條件，實現最大保留以提高靈敏度。可用各種方法監測流過該裝置的樣品，這些方法有，如采用(例如)Avalanche熒光掃描儀(GE)的免疫標記(immunotagging)和熒光檢測、采用(例如)MegaBACElOOO (GE)的毛細管電泳、細胞生長試驗或本領域技術人員熟知的其它方法。ii)親和捕獲本文所用“親和捕獲”指用介質捕獲靶分析物，介質含有對靶分析物基本特異的分子(如抗體、配體、受體、凝集素、半抗原、表位、寡核苷酸等)。在一些實施方式中，可將用靶分析物(如細胞、生物體、芽孢或毒素)表面表位的單克隆抗體修飾的磁珠加入樣品。在一些實施方式中，根據實施者的判斷，可連續地或以各種組合將用特定生物體、細胞類型、亞型、種類、核酸、蛋白質等的抗體包被的珠的混合物或組施加于樣品。抗體包被的珠結合靶分析物，從而從溶液中捕獲它們。可通過磁性收集珠，可通過洗滌去除不需要的污染物和可能的抑制劑。在各種示范性實施方式中，可重懸收集、洗滌的珠，以在流過裝置或另一裝置中進一步加工，或移動到BPM的微芯片上。如本文所述，在涉及生物防衛應用的實施方式中，收集并洗漆的珠可重懸于10 μ L緩沖液中,插入小超聲桿。在一些實施方式中，可利用米用如圖6所述裝置的流過超聲。超聲后，可使超聲后的材料通過濾膜，流到BPM微流體裝置上。b)芯片上的流過式(on-chip flowthrough)裝置在一些實施方式中，可用BMP微流體裝置濃縮靶分析物。在一些實施方式中，靶分析物的芯片上濃縮可有利于在同一小室中進行模塊集成、應用顯微制造技術并能夠進行各種方法如PCR。在一些實施方式中，這可能需要采用直徑相對較大的通道，以產生合適的流速。在一些實施方式中，免疫親和捕獲提供了快速而特異地濃縮和純化樣品中的病原微生物或病毒、蛋白質或其它靶分析物的方法。例如，為了濃縮靶分析物，基于珠的樣品制備可適合成批方法至芯片上的方法。例如，可用電動珠床填充和閘板珠捕獲法(Oleschuk等，2000. Analytical Chemistry 72:585-5909)將抗體包被的珠放置在集成的顯微制造捕獲室中。在一些實施方式中，流過模式的填充床中的羧化珠可用于顯微制造的玻璃裝置，以便后加工多核苷酸，如DNA測序混合物。可用Borofloat玻璃顯微制造裝有捕獲珠用的擋板的玻璃芯片。可設計擋板頂端和相對通道之間的擋板缺口，使其適合羧化珠或其它類型的珠，如二氧化硅珠，能用抗體、凝集素或核酸等親和捕獲的珠。 首先可用HF蝕刻深通道，然后第二層淺蝕刻可確定擋板高度為O. 5 μ m或更多，這取決于特定的珠和應用。在一些實施方式中，可通過壓力填充珠，用真空吸引去除珠。在一些實施方式中，可將免疫官能化的或其它磁珠加入沒有閘板的小室中。垂直于小室平面施加小磁場后，珠自身組裝成準規則的一系列豎柱，間距約 5-mm(Doyle 等，2002. Science 295 :2237)。在各種示范性實施方式中，可采用基質如色譜介質、附著有抗體或其它親和捕獲材料的凝膠、含有或不含化學修飾的凝膠、固相提取介質、整體料或者本領域技術人員熟知的其它分離或結合基質。2.裂解模塊在一些實施方式中，可在芯片上或芯片外破壞和裂解靶分析物。可被破壞或裂解的靶分析物的非限制性例子是(如原核、真核、古細菌)、芽孢(如細菌(如炭疽桿菌、梭狀芽孢桿菌(Clostridium))或真菌(如粗球孢子菌(C. immitis))、細胞器(如線粒體、核等)、核酸、染色體、質粒、核糖體、蛋白體、病毒(如天花病毒、流感病毒、西尼羅河病毒、脊髓灰質炎病毒、肝炎病毒和逆轉錄病毒)。在一些實施方式中，可通過超聲破壞或裂解靶分析物。在一些實施方式中，可超聲處理捕獲到珠上的靶分析物，然后將其引入微芯片。可采用浸入含有粗靶分析物溶液或已捕獲到珠上、濃縮和純化的靶分析物的溶液中的桿進行超聲破壞。超聲器也可以是裝有可直接插入收集器流出物的探頭的流過式超聲裝置(圖6)。也可設計該室，使其含有或捕獲氣溶膠，并可如本文所述地自動化。在一些實施方式中，可通過珠摩擦(bead beating)實現破壞或裂解。該珠可與本文所述捕獲珠相同或不同。在一些實施方式中，用于裂解和/或捕獲的珠的不同特性，如磁性與非磁性、不同密度等可用于分離各種類型的珠，以簡化下游加工或分析。在一些實施方式中，可采用流過、行波、珠摩擦裝置10(圖5)。例如，如圖5所示，當極片被旋轉時，旋轉的磁性極片20產生磁波下(magnetic wave down)流過管30。該旋轉可以高達約100Hz,并可使珠產生足夠的加速通過相鄰的管，以破碎流過該管的芽孢和其它類型的靶分析物。在一些實施方式中，珠具有多種形狀以有利于裂解。為了評價破壞或裂解，可用活力損失與時間確定所需的動力設定、接觸時間、體積和幾何形狀；本領域技術人員能夠設定這些參數。在一些實施方式中，可用所選樣品測試TaqMan測定中DNA或RNA的釋放。可針對芽孢和正在剪切的大分子來優化破壞，以降低其粘度和截面積，而不使它們不適合下游加工或分析。在一些實施方式中，可使裂解物通過孔徑大小至少約為10 μ m,甚至至少約為20 μ m、30 μ m或更大的濾膜，以去除可能堵塞微流體裝置的微通道的凝塊。在一些實施方式中，破壞或裂解的材料可用作芯片上或芯片外進一步純化的給料。例如，為了測定核酸，在具有選擇性寡核苷酸的珠上進行核酸雜交這一純化步驟可純化背景中的靶序列。對蛋白質而言，捕獲到固體表面如疏水性、羧化或其它化學物質上可非特異性純化一類蛋白質，而親和捕獲可在需要時提供增強的特異性。相似地，可進行多步驟純化，其中采用芯片上和芯片外的混合和匹配，以及基于珠的基質和其它基質(如果需要)。在一些實施方式中，可在引入微芯片后進行裂解。在這種實施方式中，微芯片接受含有待裂解細胞的樣品。
3.核酸純化模塊在一些實施方式中，本發明系統可包括核酸純化模塊(NAPM)。可設計NAPM，使其接受其它物理形式的溶液或樣品，如一種或多種珠、膠體、多相(非均相或異相)溶液或其它組合物。在一些實施方式中，可設計NAP，使其接受裂解模塊的輸入。NAPM接受的體積范圍可以從毫升至皮升以下。在一些實施方式中，NAP輸出物可輸送至BPM微芯片或其它微流體裝置，進行進一步加工或分析。可使各種化學物質適合NAPM使用。在各種示范性實施方式中，可設計NAPM，以用各種方法進行總核酸純化，如用離液劑通過表面吸附/解吸純化；通過(例如)電泳捕獲到含有寡核苷酸的凝膠上進行選擇性核酸純化；或通過雜交到含有寡核苷酸的珠上進行選擇性核酸純化。NAPM的一個例子見圖7。a)總核酸純化可采用非特異性捕獲法純化樣品中的總核酸，該方法采用離液劑將溶液中的核酸壓到表面上。例如，美國專利號6，489，112描述了定量納米級“模板捕獲”法，它采用離液劑如硫氰酸鹽或胍鹽將核酸壓到二氧化硅毛細管的表面上。洗滌后，將濃縮和純化的核酸洗脫到緩沖液中，進行納米級樣品加工或分析，如循環測序。也可用該方法純化裂解物中的核酸。在一些實施方式中，可在玻璃珠或其它合適表面，如通道壁的存在下將輸入樣品與離液劑混合。離液劑使核酸離開溶液，使它們吸附于玻璃珠或其它表面。離液劑也使樣品中可能存在的核酸酶失活，從而基本抑制核酸降解。孵育期后，可通過(例如)真空吸引去除離液劑中溶解的細胞碎片、變性蛋白質和其它組分，并將它們丟棄到廢液流中。可進一步洗滌純化的樣品，以去除其它污染物，可將核酸洗脫到緩沖液中進行回收并引入微芯片或其它流體系統。在一些實施方式中，核酸純化條件包括5M硫氰酸鈉，95°C 90秒變性，30°C 5分鐘結合于表面(如玻璃珠)，80% EtOH 2秒。在一些實施方式中，可用幾種不同的離液劑和洗脫回收化學物質將核酸純化到改性珠，如SPRI羧化珠上。b)選擇性核酸純化在一些實施方式中，可通過芯片外雜交于寡核苷酸捕獲序列選擇性純化靶核酸。在一些實施方式中，可通過電泳、動水壓力、離心或其它力將樣品移動到固定或可移動的基質上，所述基質包括未改性珠、改性珠、可更換的親和捕獲凝膠、整體料、膠體、兩相溶液和其它材料。在各種示范性實施方式中，基質可以是未改性的，并根據材料的表面特性結合于靶核酸，可改性基質以增加或阻滯樣品組分的結合，或者基質可附著有與靶序列互補的寡核苷酸序列、結合抗體或其它親和捕獲材料。在一些實施方式中，寡核苷酸上的生物素標記可與靶DNA雜交。珠上的鏈霉抗生素蛋白部分可結合于生物素，以純化所需的靶核酸。例如，可將包含靶核酸的樣品施加于結合有與靶核酸互補的寡核苷酸序列的珠。可用低離子強度的緩沖液洗滌結合的靶核酸以去除鹽、污染物和錯配片段，可通過加熱和電壓洗脫納升體積的靶核酸。在一些實施方式中，親和捕獲可以是一種快速((7分鐘)和高效率(循環測序產物>90%)的方法。可調節該方法的規模，使其適應芯片外構造。輸出體積可約為IOnL-ImL,這取決于物理構造。在一些實施方式中，也可用上述組合物和方法去除可測定蛋白質、脂質、糖或非關聯核酸的樣品中的核酸。4.將珠或溶液引入微芯片可直接或在(例如)本文所述的捕獲和核酸純化加工后將樣品引入各種微流體裝 置或其它流體系統。在一些實施方式中，可將小體積，如微升或納升體積的來自親和捕獲步驟的珠引入微芯片。可用(如)注射器泵或移液裝置將珠泵入微芯片上的儲存庫，可用微芯片上的泵將珠移動到微芯片的一個部分中，在該部分可捕獲或保留珠。在一些實施方式中，單個珠可在微芯片上移動，以進行加工或分析，如DNA測序、單分子分析、蛋白質的MS分析，包括基質輔助激光解吸/電離(MALDI)掃描和肽指紋分析。在微芯片上可用(例如)流式細胞技術將單個珠導向單獨小室。或者，可用隨機分配法將單個珠放入小室，在這種方法中，平均來說，預計每個小室僅有一個珠到達。在一些實施方式中，可在各種類型的流體系統(如分批模式)或流過系統，或其組合中進一步加工樣品。系統可基于微芯片、毛細管、管道、孔或其它容器和微流體裝置。可通過生化方法或化學方法加工引入的樣品以分離組分、標記組分，或在微芯片上進行分析，或準備用于下游分析。5. BPMBPM 一般包括可由下述設備和可編程軟件任選地操作的一個或多個微流體裝置。在一些實施方式中，微流體裝置可以是筒中裝配的微芯片、納米芯片或皮米芯片，該裝置能輸入SCPM的樣品、指導流體線路和反應室之間的液體路由、加入試劑和進行各種靶分析物(如核酸和毒素)的測定。在一些實施方式中，各種類型的芯片可在單獨的生物處理器模塊中加工樣品，其中采用MOV閥、泵和路由選擇器作為系統控制零件，從而控制反應時間和順序。在一些實施方式中，本文所述芯片可與SCPM集成。a)微型機器人控制的芯片上的閥和泵(MOV )技術MOV微型閥、微型泵和微型路由選擇器組合了兩個玻璃微流體層、可形變的膜層和氣動層，可形變的膜層如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，它能打開和關閉閥，氣動層能使膜變形并起動該閥。上層玻璃層中蝕刻的流體通道(圖9)不連續，產生用作閥座的通孔。PDMS膜40安置在閥座上，通常關閉兩個通孔之間的流體通路。在PDMS膜40反面，蝕刻形成的氣動移位室連接于全尺寸(full scale)真空或壓力源。通過控制小型化的芯片外電磁閥，可將真空或壓力(約半個大氣壓)施加于PDMS膜40，以通過彈性膜的簡單變形打開50或關閉60該閥。可通過協調三個閥70、80、90的操作制備自吸性MOV泵(圖10)，它可產生雙向流動。可通過安排操作順序、橫隔板大小、改變通道寬度或其它芯片上的尺寸實現各種流速。可用這些閥和泵類似地形成路由選擇器(圖11)。可用三個或多個閥形成路由選擇器，這些閥各自位于連接于中央橫隔板閥100的分離通道110、120。通過啟動合適的閥組合，可將通道之一的液體抽入中央橫隔板閥并排入不同通道，從而指導液體的路由。也可產生總線(bus)結構。可在一種制造方法中用一層PDMS膜同時產生MOV閥和泵，即在芯片上產生5個MOV泵的成本與產生500個的成本相同。因此，本文所述內容提供了在芯片上產生復雜的微米、納米、皮米流體線路的方法，并且，事實上能夠在芯片上進行任何反應或測定。通常，此技術可能至少對溶液離子強度和表面污染的變化基本不敏感，并且不需要施加電場。b)微流體裝置圖31顯示了可用于核酸分析的一個生物處理器模塊的例子。在這個設計中，可將結合有來自頂S和核酸純化的純化核酸的捕獲珠輸入下方通道350。芯片上的MOV泵351將該珠移動到閘板352，在此處可通過局部加熱釋放核酸并將核酸泵入μ RT-PCR室353作為實時PCR試劑，可通過試劑輸入加入內標。環繞該室的閥關閉以進行熱循環。圖32顯示了采用圖31的設計在6”微芯片上設計48個單元的例子。在一些實施方式中，可將96個或更多單元輻射狀地布置在6 ”芯片上。在一些實施方式中，可將384個分離通道布置在8”芯片上。如果通道僅重復使用約3次，那么96通道微芯片可操作約30天。在一些實施方式中，可將240個單元輻射狀地布置在12”微芯片上，這取決于最終規格的要求、所測試的靶分析物的數量和多路程度。在一些實施方式中，各種芯片可包括鉆出的通孔，這些通孔形成的閥室就是可用于(例如)RT-PCR的反應室(圖29)。采用厚3mm的鉆孔晶片和300 μ m直徑的(dia)鉆孔機，可產生212nL小室，沿長軸(而非橫穿通道)的檢測通路長度為3_。在一些實施方式中，這些小室可具有出色的表面積體積比。在一些實施方式中，較大體積可具有較好的表面積體積比和較長的通路長度。通常，可以橫穿通道在芯片上進行檢測，其通路長度等于通道深度，約為30 μ m ;相似地，在毛細管系統中，通路長度約為50-200 μ m。通過這種簡單設計，出色的體積表面積比和約長100倍的通路長度分別有利于樣品制備生物化學(通過較高的體積表面積比)和熒光檢測。相同的檢測設計可用于檢測毒素。在一些實施方式中，各種芯片可采用MOV路由選擇器并加入試劑如含有內標的PCR主混合物(master mix)將輸入樣品分為合適數量的反應(取決于所實現的多路程度)。如圖33所示，可用輸入MOV路由選擇器將法醫儲存和再測試樣品分成等份，然后可選擇來自陽性實時PCR反應的樣品進行yCAE。圖33說明在一些實施方式中，各生物處理器單元或反應中不需要UCAE通道。在一些實施方式中，整個6”微芯片上可采用2-4條yCAE通道，因為它們可用于驗證并可深度嵌套以連接幾十個實時PCR小室和其它類型的試驗小室(如毒素試驗小室)。圖25說明用于生物防衛應用的微芯片的例子，它設計為一次性筒和操作該微芯片進行病原體的樣品制備的平臺。該芯片包括MOV閥、泵和反應室，注射試劑的樣品端口，以及與上游濃縮模塊和下游分析模塊接口相連的進口和出口。圖17說明采用圓形基材的微芯片，該圓形基材上輻射狀布置了 12個生物處理器單元。在一些實施方式中，一次可使用一個單元，在各使用之間可旋轉該微芯片。或者，可采用基材幾何形狀不同并且流體設計不同的實施方式。含有流體系統的生物處理器模塊(在本實施例中在微芯片上)可接受上游SCPM的樣品，產生用于儲存和再測試的等份，在芯片上裂解樣品，制備和標記樣品，以及將它們輸出至檢測器進行分析。在本實施例中，BPM包括含有流體系統的微芯片筒和操作筒的設備。該筒可以是“⑶”形式，每個筒的扇區中具有12個生物處理器單元，各單元用于一種樣品或多種樣品(圖17)。例如，該筒可加工一種樣品，然后旋轉以接受下一個樣品。該筒可適合于不同取樣方案并按需改變。在一些實施方式中，可將筒組儲存于類似于⑶交換器的小圓盤傳送帶中。該設備可提供某些機構來儲存、加載試劑、運行和換筒，以及控制該過程。在一些實施方式中，可采用納米生物處理器筒，設計該筒的目的是用筒上裝配的MOV閥和泵作為控制元件的納米流體系統加工樣品。MOV閥通常是關閉的、高低不平的(rugged)、容易制造的、可在密集陣列中操作的并具有低死體積。可按照Grover等(2003),Sensors and Actuators B89 :315-323的設計,通過組合玻璃層與作為可變形膜的聚二甲基硅烷(PDMS)層來制備閥。 在一些實施方式中，可通過組合圖9所示閥中的三種閥制備自吸泵(圖10)。中央橫隔板閥可大于用于控制流向的側閥。此外，中央閥可用作反應室或混合器PDMS的變形可高達2mm,產生可容納多至幾百微升或少至幾十納升的反應室(Grover等(2003),Sensors and Actuators B89 :315-323)。這些小室可動態擴展和收縮。在本發明中，MOV閥和泵可組合為處理器，以制備和加工微升和納升級的樣品。在本發明中，可改變通孔大小，以在通孔中產生反應室。通過組合通孔寬度和通孔通過的晶片厚度的變化，可形成各種范圍的小室。除了用作反應室以外，通孔也可用于增加用于光學檢測和其它檢測的通路長度。例如，圖29顯示了微芯片230，其中通孔231用于進行實時PCR并用作檢測室。也可用內反射物質涂覆通孔或晶片基材以增強檢測。6.應用、設備和軟件在一些實施方式中，微芯片可裝在真空吸盤的固定位置中。微芯片接口裝置可連接于微芯片，以提供外部控制元件，包括外部氣動元件、熱循環溫度控制元件、溫度控制和試劑引入線。圖16顯示了設計用外部操縱的MOV閥和泵控制流動的微芯片筒的實施方式，其中較大的中央橫隔板閥也用作反應室。該筒含有三條進行生物處理的主通道160-162、儲存區170和儲存庫180。這些通道之一可用于加工基于DNA的分析所用的樣品，第二條和第三條通道分別用于加工免疫測定分析所用的毒素和顆粒。圖16所示設計是許多可能設計之一，該設計與用于生物防衛應用的下游單分子檢測器接口相連。在一些實施方式中，該筒可如下所述地運行。加入內標后，芯片外樣品濃縮器將100 μ I樣品遞送至筒上的輸入儲存庫190。用標為“Α”的路由選擇器200將7份未處理的10 μ I等份從儲存庫泵入筒上的儲存室(保持4°C )。這些等份中三份用于再測試180，如果分析樣品測試為陽性，可進行驗證；如果再測試確認了初始陽性檢測結果，那么將另外4等份170用于進行后續補救(retrieval)和法醫學分析。通過外部冷卻器如TEC Peltier冷卻器將所有等份冷卻儲存在筒上；如果需要，可干燥儲存于這些儲存庫中。筒使用后，將使用過的筒儲存于冷藏的小圓盤傳送帶中。然后，形成和加工立即加工的等份。通過路由選擇器A200將IOyL試驗等份移動到生物處理通道2161-室D 163，進行免疫標記以檢測毒素，如下所述。通過路由選擇器A120將第二個10 μ L試驗等份移動到生物處理通道3160-室Ε164，進行免疫標記以檢測完整的細菌或病毒顆粒，如下所述。然后，從上面蓋上輸入儲存庫，用通過筒底部偶聯的外部超聲器桿超聲處理其余樣品。產生的超聲波能破壞植物細胞、芽孢和病毒，并剪切DNA，從而降低粘度以改進雜交動力學和流動特性。通過路由選擇器A 200將裂解的樣品移動到生物處理通道1162-室C165，與標記探針雜交以進行DNA分析。三條通道的生物處理可同時進行。可能需要能降解RNA、蛋白質和脂質的樣品消化步驟來降低基于DNA的單分子檢測樣品的背景，并降低下游檢測器的需要。如果進行這種加工(如單分子檢測中)，那么在DNA分析樣品中可加入緩沖液配制的RNA酶、蛋白酶和脂酶的混合物，以降解非DNA物質。可通過將儲存庫B的物質泵入含有樣品的小室C實現加入。如果需要，可將樣品和消化試劑在相鄰小室之間來回抽吸以混合。可標記小室C中的等份，以通過與儲存庫F的DNA探針雜交進行DNA分析。可將雜交探針或抗體探針冷藏在試劑筒中，并在使用單個生物處理器單元之前才用外部泵加入筒。可用筒上的泵將探針 泵入小室，以混合試劑。再一次，如果需要，可將樣品和試劑在探針室和反應室C之間來回抽吸以進一步混合。該設備的小室下面可裝有加熱元件。在雜交中，可以關閉側閥，將小室加熱到95°C以使DNA變性，然后冷卻到雜交優化條件以使DNA探針與存在的任何目標物雜交。這些閥的密封足以使得能夠在這些小室中進行PCR，因此，可基本上避免蒸發。上述BPM可應用于任何基于PCR的測定，如單一或多重PCR、可變數量的串聯重復(VNTR)、多基因座VNTR分析(MLVA)或其它測定。可用合適的PCR引物和外部熱源循環取代雜交探針。可用限制性消化取代消化步驟，以實現擴增片段長度多態性(AFLP)。在毒素檢測中，小室D中的等份可與儲存庫G的毒素的抗體探針混合，而在顆粒檢測中，小室E中的等份可與儲存庫H的微生物表面被膜(coat)的抗體探針混合，樣品維持于37°C。標記后，可將生物處理過的樣品泵入三個外部儲存庫中，在儲存庫中可通過吸出獲得這些樣品用于檢測器分析。或者，可用變化形式的微芯片進行毛細管電泳或光學檢測。如果檢測器僅檢測到內標，那么可旋轉該筒并準備下一個生物處理器單元。如果樣品測試為陽性，則不旋轉生物處理器單元，取而代之的是由再測試沖洗庫沖洗并加載新鮮試劑。可通過路由選擇器將儲存用于再測試的三種樣品泵回，一種直接泵入小室D進行毒性檢測，第二種泵入小室C進行顆粒檢測，第三種泵入輸入儲存庫進行超聲處理和DNA分析。可如上所述加工再測試樣品，并輸出至檢測器，作為可能的假定陽性檢測事件進行驗證。作為外部設備的微芯片接口裝置可包括操作微芯片的設備。可開發一種微芯片，其中微芯片筒裝在真空吸盤頂端，微芯片接口裝置與微芯片連接，其具有氣動部件、加熱部件和冷卻部件、以及注射器泵以將試劑移動到儲存室中。計算機控制的微芯片接口裝置可控制電磁閥，以開放和關閉外部全部的(full scale)閥，從而控制微芯片閥并通過泵吸移動微芯片上的樣品。微芯片接口裝置可包括加熱器，例如電阻加熱器，如鎳鉻合金、Peltier加熱器、基于空氣的加熱器、紅外加熱器或本領域技術人員熟知的其它實施方式，還可包括熱電偶或其它溫度測定裝置，以及相連的控制電路和軟件，以控制微芯片的某個區域的溫度和加熱及冷卻速率。冷卻可以是輻射冷卻、風扇主動冷卻、Peltier冷卻、水冷或本領域技術人員熟知的其它方法。也可通過加熱真空吸盤設定整個芯片的溫度。可控制注射器泵以將試劑遞送至安裝的微芯片上的儲存庫，或者含有試劑的加壓室可具有打開以允許試劑流過小管進入微芯片上的儲存庫的閥。在一些實施方式中，可采用重力流。在一些實施方式中，利用電力移動試劑、利用磁力遞送附著于珠或顆粒的試劑也屬于本發明范圍。可用Laboratory Rapid Automation Toolkit軟件或其它軟件控制所有上述硬件和NanoPrep軟件。Laboratory Rapid Automation Toolkit (LabRA )軟件平臺 500 (圖 26)是設備軟件開發包，它能夠快速產生強大的商業級軟件平臺來驅動設備和使工藝自動化。LabRAT定義了一組通信和控制協議501-503，它具有標準化的自動化體系結構和架構，它比任何現有的商業軟件平臺更簡單、更靈活、更有效率。LabRAT架構基于一組可跨越多種操作系統、開發語言和通信媒介504的核心技術。LabRAT自動化體系結構的心臟是基于XML-RPC(可擴展置標語言-遠程過程調 用)的設備通信和控制接口協議，它是SOAP(簡單對象訪問協議)標準的核心。XML-RPC是進程間通信的出色機制它簡單、快速、強大、幾乎在每一種現有軟件開發系統中都有廣泛應用性、在TCP/IP和HTTP上操作、并且易于實現。XML-RPC作為非常高水平的“中間機制(meta-mechanism) ”操作，并可將不同部件連接在一起成為緊密排列的設備系統。除了核心通信和命令協議以外，也定義和實現一組適合實驗室設備的接口，以在部件之間交換“實驗室服務”。已經使LabRAT或類似軟件適合控制微芯片接口裝置。一旦單個部件的驅動程序被覆蓋(wrapped),現有的LabRAT軟件為所有層提供功能。控制局部熱循環的NanoPrep熱循環儀軟件已經合并到LabRAT中。氣動電磁閥、注射器泵和其它元件(包括檢測器)也可由LabRAT軟件控制。此外，可通過LabRAT腳本命令協調不同硬件部件的相互作用。在一些實施方式中，可控制以下三種硬件裝置1)加熱和熱循環，2)芯片上的閥和泵(氣動操作)，和3)用于遞送試劑的注射器泵。可用直接位于反應室下并由現有的NanoPrep軟件和硬件控制的鎳鉻合金加熱線圈實現熱循環。MiniPrep Cartesian機器人(Tecan)可用于驅動“智能1/0”板(Tecan)，以操作控制芯片上微型機器人控制的閥和泵的多達32ttl的輸出線，以及用于在微芯片上加載或卸載樣品的全部(full scale)機器人；LabRAT CAN接口也可操作高精度注射器泵，以將流體分配到芯片中。智能1/0板可驅動Crydom固態繼電器模塊(每條線一個，M0DC-5SSR模塊(DigiKey#CC1226-ND)和 MS-44-Pos 安裝板(DigiKey #CC1230-ND)),它進而可操作 24VDC電磁閥(AR0，P251SS-024-0)。這些閥是三通的直接驅動單元，一個是通用端口，另外兩個端口通常一個開放一個關閉(分別連接于真空和加壓空氣線)。該電磁閥控制所有(full-scale)8條真空和壓力線，它們將通過8條多支管(微芯片上的M1-M8)進行操作。控制軟件可連續操作這些電磁閥，以產生驅動芯片上通道內的流體的泵吸作用。機器人控制軟件可以是LabRAT軟件控制下的Express腳本引擎(Tecan)執行的ASCII編碼腳本形式。現有LabRAT軟件提供了用先進的基于XML-RPC的架構操作設備的完整功能。可將操作微芯片的硬件開發為獨立的設備或與現有設備組合。例如，可用TecanMiniPrep設備按需在芯片上或芯片外吸取溶液,用Tecan智能1/0卡控制硬件,進而控制MOV閥和泵。
圖27顯示了將MiniPrep機器人和微芯片聯用的系統的正視圖。該平臺的前景(foreground)(右)是鋁合金真空吸盤。該吸盤具有電阻加熱元件，它嵌入能夠全局加熱該芯片的“三明治型”結構中。在最左端黑色圖片的頂部可見溫度控制器。從該吸盤的左偵牝驅動芯片上的閥和泵的8條真空線通過管道連接于安裝在Tecan面板之一的背面的真空支管(此照片中不可見)。該平臺的左側是用于將“儲存庫”試劑分配到芯片上的注射器泵(連接有注射器)。圖28顯示了含有許多安裝部件的Mini Prep的內側(去除背面板之后)，所述安裝部件包括溫度控制器、8個24V DC電磁閥和繼電器。空氣泵和智能I/O板也安裝在MiniPrep內側，但不可見。可設計本文所述生物處理器筒使其用微流體筒上閥和泵作為控制元件加工樣品。可設計該筒，以用這些外部驅動的閥和泵控制流動，較大的中央橫隔板閥也用作反應室。圖15顯示了筒上12個相同的生物處理器單元200中的一個。各單元輸入樣品并制備三種經生物處理的輸出樣品201-203 1)用DNA雜交標記進行DNA分析，2)用免疫標記進行毒素分析，和3)用免疫標記進行顆粒分析。此外，各單元可具有用于試劑加入204、混合和反應205以及儲存再測試樣品206的區域。在一些實施方式中，加入內標后，可用空氣取樣器將ImL樣品遞送入筒上的輸入儲存庫207。輸入儲存庫可帶有粗濾器，加入它的目的是去除可能阻塞通道的“大顆粒”。可將未處理的700 μ L等份從輸入儲存庫泵入標為“Α”的小室208中，然后進入維持在4°C的筒上儲存室206。儲存樣品可用于1)再測試，以及如果分析樣品測試為陽性，可能用于驗證和2)如果再測試確認了初始陽性檢測結果，則用于后續補救和法醫學分析。可用外部冷卻器如TEC Peltier冷卻器冷藏筒上的儲存樣品；如果需要，可將穩定試劑干燥儲存于這些儲存庫中。筒使用后，將使用過的筒儲存于冷藏的小圓盤傳送帶中。在一些實施方式中，可形成和加工用于立即加工的3等份DNA、毒素和顆粒。首先，可將用于毒素標記的100 μ L試驗等份泵入小室A 208，并可泵入用于免疫標記和檢測毒素的試劑。如果需要,可將樣品來回泵吸至小室B 209以混合樣品和試劑。可將樣品泵入輸出儲存庫201-203，進行孵育并轉移至檢測器。可將第二個100 μ L試驗等份移入小室A 208，進行免疫標記以檢測完整的細菌或病毒顆粒。可將微生物或病毒表面被膜的抗體探針泵入小室A 208，可將樣品維持在37°C。抗體探針可以是隨后可用檢測器區分的抗體的復雜混合物。標記后，可將生物處理的顆粒樣品泵入儲存庫，以通過吸引將樣品引入毛細管進行檢測器分析。在DNA樣品制備中，為毒素和顆粒檢測加工這些等份和樣品后，可從上面蓋上輸入儲存庫，用通過筒底部偶聯的外部超聲器桿超聲處理其余樣品。產生的超聲波能破壞植物細胞、芽孢和病毒，并剪切DNA，從而降低粘度以改進雜交動力學和流動特性。可將裂解樣品從試劑輸入204移動到小室A 208中與標記探針雜交，以進行DNA分析。為了雜交，該設備的小室A 208下面可裝有加熱元件。可關閉側閥，將小室加熱到95°C以變性DNA，然后冷卻到最優溫度以使DNA探針與存在的任何目標物雜交。這些閥的密封足以使得能夠在這些小室中進行PCR，因此，可基本上避免蒸發。可能需要降解RNA、蛋白質和脂質的樣品消化步驟來降低基于DNA的檢測樣品的背景和降低下游檢測器的需要。如果需要這種加工，那么從試劑輸入208加入的DNA分析樣品的緩沖液中可含有RNA酶、蛋白酶和脂酶的混合物，以降解非DNA物質。可通過將材料泵入含有樣品的小室A 208實現加入。如果需要，可將樣品和消化試劑在相鄰小室A 208和B 209之間來回抽吸以混合。如果需要消化，可標記小室A 208中消化的等份通過以與本文所述DNA探針雜交進行DNA分析。雜交探針或抗體探針可冷藏于試劑筒中，并在單個生物處理器單元臨用前用外部泵加入筒中。可用筒上的泵將該探針泵入小室以與試劑混合。再一次，如果需要，可將樣品和試劑在小室A和B之間來回抽吸以進一步混合。未來的設備可含有預加載到生物處理器筒中的試劑。在一些實施方式中，如果檢測器僅檢測到加入的內標，那么可旋轉該筒并準備下一個生物處理器單元。如果樣品測試為陽性，則不旋轉該生物處理器單元，取而代之的是用來自試劑輸入(裝置)的緩沖液沖洗。可將100 μ L儲存樣品泵回到小室A中從測試陽性 的方法開始進行再測試。可如上所述加工再測試樣品，并輸出至檢測器作為可能的假定陽性檢測事件進行驗證。LabRAT 軟件可用于控制注射器泵、小室A的熱循環加熱元件和用于操作芯片上閥的所有(full scale)電磁閥。可根據全體積或宏觀體積結果單獨優化雜交和抗體結合的化學。根據筒形式和在采用摻入(spiked)空氣樣品的重組實驗中測試的一系列輸入微生物的影響再優化反應物濃度、反應事件和溫度。本領域技術人員能夠確定試劑的貯存條件。所有試劑可儲存于4°C的試劑筒中；可加入其它穩定劑如滲透壓保護劑(osmoprotectant)(海藻糖、甘氨酸甜菜堿)或其它物質以延長保存期限。在一些實施方式中，進行混合的方案可以是，布置兩條液流使其在通道中混合，其中薄層蝕刻面上，一條在另一條的上方。液流之間的短路徑增強了混合。另選的混合方案可利用珠(如磁珠)存在于反應室或加入它們以通過磁性操作該珠破壞層流。在一些實施方式中，這可將一條液流中的靶分析物壓入“另一”液流，可用于啟動處理或分析反應。在一些實施方式中，如果需要可用閘板捕獲珠。在一些實施方式中，在使用后可沖洗出珠使其進入廢液。試劑穩定可能是所述系統的各種實施方式如野外裝置的主要問題。因此，在一些實施方式中，試劑儲存庫可用Peltiers冷卻至4°C進行溫度控制。在一些實施方式中，可用Ready-To-Go 化學方法或采用滲透壓保護劑如海藻糖或甘氨酸甜菜堿的其它凍干方法穩定試劑，然后在用前再水化。再水化構思可以是每天或每周取出密封可破壞的安瓿中穩定試劑的等份。可將水或緩沖液泵入該設備中的安瓿以將穩定的試劑水化提供每天或每周的工作母液。可將工作母液移動入注射器泵或直接加載到生物處理器中，這取決于穩定性。a)微珠集成DNA測序(MINDS)系統。在一些實施方式中，MINDS系統可通過自動化、無人操作地制備和分析Sanger樣品而超低成本制備和分析測序樣品。可在珠上從剪切的染色體或BAC DNA開始用大量乳劑PCR反應制備測序模板，各珠攜帶衍生自一種DNA片段的DNA。分選去除無片段的珠后，可將單個珠遞送至整合到帶凈化和μ CAE分析的400通道微芯片上的小體積(如25nL)循環測序反應室中。在一些實施方式中，可通過閘板捕獲珠，可進行正向和逆向成對末端閱讀的循環測序，將產物電泳入雙樣品凈化室，其中含有親和凝膠捕獲基質以進行正向或反向閱讀。可洗滌親和凝膠以去除離子和未結合的核苷酸。可通過提高溫度來洗脫親和凝膠中純化的循環測序片段，然后注射入折疊的CE通道進行電泳分析。此方法可使試劑體積和成本降低幾個數量級，部分因為它可以接近分子數量的基本限制的規模進行測序。在一些實施方式中，集成的MINDS系統可使鳥槍測序、定向測序和再測序的所有過程自動化和小型化。MINDS系統可產生基于微珠的熒光DNAy CAE測序儀，其運行成本比維持現有測序設備的成本低100倍或更多。各系統可進行無人操作的完全自動化的測序長達一周，用小型機器人控制的微流體裝置取代大型(full-scale)機器人。MINDS系統可以分模塊執行,然后集成在一起。在一些實施方式中，可米用基于200nL循環測序微芯片的模塊。將基于先進的旋轉LIF掃描器的DNA分析模塊構建為用于MINDS系統的平臺模塊，其中裝有μ CAE微芯片，該芯片可在注射入采用先進基質的電泳通道對之前用雙親和捕獲室凈化成對末端閱讀樣品。可通過MOV閥和泵操作這5層微芯片，“實現”(servicing)微流體操作。循環測序模塊可組合在芯片上，產生整合IOOnL循環測序、樣品凈化和分離的核心MINDS芯片。在一些實施方式中，制備25nL樣品的完整MINDS芯片可輸入微珠庫，并獲得輸出序列信息。
b)循環測序模塊微流體循環測序模塊(CSM)可用作MINDS系統中的獨立功能，也可用作基于微芯片的樣品制備的模塊。CSM可包括1)含有樣品制備微流體裝置的微芯片，芯片上裝有閥和泵以控制流動，和2)外部接口，以通過芯片上的閥和泵操作微芯片。樣品制備CSM可以是循環測序體積為200nL的16條通道，用毛細管(CAE)和微芯片(μ CAE)進行芯片外分析。在一些實施方式中，可將具有外部流體接口、加熱和氣動裝置的微芯片接口裝置(MID)的規模改變到400條或更多條通道。在一些實施方式中，可采用芯片上裝有閥和泵的16通道的200nL循環測序樣品制備微芯片裝置。圖14中示意性地顯示了簡化的微芯片筒的兩條通道。標為“輸入”260和“輸出”261的儲存庫主要是可連接于微流體通道的微芯片262的上層中的孔洞。該裝置可接納微量滴定板上的輸入DNA樣品(PCR、質粒或其它模板)，以200nL體積進行循環測序，并將熒光標記的循環測序產物輸出到準備用于樣品凈化和注射到CAE設備或μ CAE分析的微量滴定板中。可通過微芯片接口裝置操作微芯片，該接口裝置是由LabRAT 軟件驅動的。CSM微芯片接口裝置可為以下過程提供機械力1)開放和關閉芯片上的閥，2)操作芯片上的泵，3)測定從儲存(裝置轉移)到微芯片上的循環測序試劑，4)控制加熱和冷卻以進行循環測序，和5)用緩沖液和洗滌溶液再生芯片。微芯片和MID可安裝在可進行流體轉移的Tecan MiniPrep流體處理機器人的平板上。在一些實施方式中，可如下操作200nL CSM微芯片。可用Tecan MiniPr印機器人將樣品從微量滴定板加載到輸入260儲存庫的孔中。通過驅動芯片上泵的真空/壓力線的外部傳動控制泵吸，從而將MOV芯片上的泵264可將等份移動到反應室中，如圖9-10所述。可通過芯片上的泵泵吸循環測序混合物265 (CS混合物，圖14)，以將染料終止物循環測序主混合物分配到反應室263中。在計算機控制下，MID密封了環繞各反應室263的三個閥，并對反應混合物進行熱循環。完成后，可通過筒上的泵將200nL樣品泵入含有5 μ L水的輸出儲存庫261。可用Tecan將稀釋的樣品移動到微量滴定板中的35 μ L醇中，以進行隨后的芯片外后處理和分析。在一些實施方式中，可將樣品移動到雙親和捕獲室進行凈化和分析。可用緩沖液沖洗CSM筒，以去除殘留的DNA模板，再加載新樣品，再次開始該過程。循環測序可耐受的來自前一反應的模板污染大于5% :因此沖洗該反應室可再生微芯片。在一些實施方式中，各微芯片可重復用于幾百個反應。c) CSM 設備。操作CSM的設備的特征可包括1)使芯片上的微型機器人的外部傳動的自動化，該機器人能控制基于CSM微芯片的筒中的液體移動，2)控制外部加熱和冷卻以進行熱循環，3)驅動注射器泵以將循環測序試劑遞送至芯片和4)控制Tecan MiniPr印機器人以將樣品從微量滴定板移動到輸入儲存庫中，并從微芯片輸出儲存庫取出制備的循環測序樣品放入微量滴定板中。可通過LabRAT軟件控制所有這四個元件。
熱循環可采用外部來源進行加熱和冷卻以簡化微芯片制造，并降低操作成本。一些實施方式采用一組電阻加熱線圈，并用風扇冷卻。在一些實施方式中，例如采用置于微芯片頂端的裝有熱電偶傳感器的鎳鉻合金加熱器，其加熱速率可達到30°C /秒以上。在一些實施方式中，可在400條通道的水平可重復和可靠地操作加熱器，無需監測每條通道。在一些實施方式中，當將樣品制備和分析集成在一起時，可封閉冷卻空氣以防止其改變微芯片其它部分的溫度。在一些實施方式中，可使用條狀高效Peltier效果熱泵以快速循環反應室的溫度。這些各種方法可采用LabRAT 控制下的現有NanoPr印熱循環軟件。由Peltier熱泵保持冷卻的注射器泵可用于將循環測序試劑遞送至微芯片上的CS儲存庫通道，用芯片上的泵分配試劑來補充該儲存庫。類似地，可遞送和控制水或緩沖液以再生微芯片。在一些實施方式中，注射器泵的全步(full step)長可以是InL，它可由LabRAT 軟件控制。在一些實施方式中，可能采用根據簡單重力流動的溶液來補充儲存庫；在軟件控制下的小閥可調節流動。在一些實施方式中，可以在Tecan MiniPrep的平板上實施CSM。Tecan可將樣品從微量滴定板移動到輸入儲存庫中，并從輸出儲存庫獲得最終樣品，并將它們移動到微量滴定板。Tecan能夠操作單個注射器泵，其尖頭安裝在機器人上，X_Y_Z運動在CAN控制下。如上所述，LabRAT軟件可用Microsoft WSH控制器控制CAN裝置。將液體移動到微量滴定板或從微量滴定板移動液體的腳本很簡單。采用Tecan代替手工移液能夠允許CSM以完全自動化的模式操作。在一些實施方式中，CSM可包括芯片上的取樣循環順序以及芯片外MegaBACE CAE和μ CAE微芯片系統的分析。可基本按照生產商的詳細說明書用DYEnamic ET終止物測序試劑盒(Amersham)進行染料-終止物測序反應。在一些實施方式中，可對試劑進行30個下述循環95°C 25秒，50°C 10秒和60°C 2分鐘。熱循環后，可將樣品移動到微芯片輸出儲存庫中，并用氣壓轉移到微量滴定板中40yL80%乙醇(室溫)中。在乙醇后處理中，可以約2，800RCF離心樣品45分鐘，通過以50RCF反向離心30秒去除醇。可將樣品懸浮于10 μ L雙蒸水。對照可包括在微量滴定板中制備的全體積樣品以及在毛細管中制備的500nL和200nL NanoPrep樣品。可用10kV、15秒注射將樣品注射入96-毛細管MegaBACE設備，用120V/cm電場強度分離。可用序列分析儀堿基調用(base-calling)軟件包處理四色電泳圖譜，該軟件包中含有Cimarron 3. 12喊基調用程序(Amersham Biosciences)和Phred喊基調用和所述質量評分產生應用。可將所有閱讀長度報道為Phred20窗口，它的準確率為99%。
如果需要，可單獨優化擴增循環數、反應時間、循環特征以及不同反應物，S卩引物、聚合酶、dNTP、ddNTP等的濃度,這屬于本領域技術人員能力范圍內。例如，可測定耐受的DNA濃度范圍，并測定一系列DNA-與-引物濃度的效能矩陣。起初，樣品可以是純化的PCR產物。為PCR產物優化CSM時，可測試代表非刺激和刺激序列的一系列實際樣品(CAE和μ CAE分析)，并與具有CAE分析結果的全體積樣品制備相比較。接受標準可以是與全體積樣品制備結果相比的等價數據質量、閱讀長度和成功率。對照包括全體積反應和NanoPrep (500nL 和 200nL 體積)反應。可通過加熱器和冷卻器設計以及通過改變微芯片設計實現一致結構。可通過添加劑如BSA或PVA抑制表面相互作用。可用改性的LPA、PEG或其它涂層抑制反應室的表面化學。對玻璃而言，另選方法可以是將聚合物如聚醚和氧化多糖與許多表面位點同時多點共價連接，從而延長表面固定的壽命，因為必須水解許多位點來釋放聚合物。d)集成的MINDS系統 在一些實施方式中，完整的MINDS系統可包括三個模塊_珠文庫模塊、循環測序模塊和DNA分析模塊。在一些實施方式中，完整的MINDS系統可分析400條通道MINDS微芯片上的基于珠的文庫，該微芯片在具有超轉角(hyperturn)的折疊微通道上集成了 25nL成對閱讀循環測序、成對親和捕獲凈化和μ CAE分離。MINDS系統可以是用于鳥槍測序或再測序的完全自動化的系統，這取決于珠文庫構建。在一些實施方式中，可集成循環測序模塊和DNA分析模塊，制備的樣品如PCR或純化的質粒可用作輸入樣品。在一些實施方式中，可在微芯片上進行PCR或其它擴增。DNA分析模塊可包括旋轉掃描器(圖30)，并可在微芯片上進行成對末端閱讀樣品凈化，然后將樣品注射到兩條單獨的μ CAE通道中分離和檢測正反向測序反應。檢測器可以是能夠進行488nm激發和四色檢測的旋轉LIF掃描器。為了產生核心MINDS系統，可將循環測序模塊與DNA分析模塊設備集成。這種核心系統可集成IOOnL循環測序、成對親和捕獲凈化和相同微芯片上的分離。可將含有由FACS設備分選的PCR片段的珠遞送到微芯片中，可將單個珠導入25nL循環測序室。i) DNA分析模塊DNA分析模塊可進行成對末端閱讀的樣品凈化和μ CAE以分離和檢測各成對末端閱讀中的標記DNA片段。循環測序可采用各自含有獨特的親和捕獲序列的正向和反向引物，插入載體。可將來自全體積、納米級制備或CSM的成對循環測序樣品加載到輻射狀設計的分析微芯片的儲存庫中。可通過電動學方法將樣品移動到兩個樣品凈化室中，其中含有用于正向或反向閱讀的親和捕獲寡核苷酸。可將循環測序樣品濃縮到約20nL的體積，離子、未摻入的染料、模板、核苷酸和酶通過后進入廢液。可通過提高溫度釋放濃縮和清潔的樣品，并將其注射入雙T注射器，以在充滿分離基質的微通道中分離。輻射通道會聚在圓形檢測區域上，可在該區域掃描和檢測微通道。模塊硬件部件包括1)LIF旋轉掃描器，它可容納許多不同的微芯片尺寸和設計，2)微芯片，3)電泳控制，4)溫度控制，和5)微芯片再生。DNA分析模塊可能是完全集成和自動化的MINDS系統的一部分。一些實施方式產生了極其靈敏的掃描系統，與現有旋轉掃描器相比，其檢測性能提高了多達10倍。可通過掃描器、微芯片設計和染料化學的小幅提高(I. 5-3倍)相乘，獲得此10倍提高。對掃描器而言，最佳質量PMT、二向色元件和鏡可提高光效率，并可與裝有高數值孔鏡的大功率(200mW)小型激光器偶聯。可用采用花青供體的較亮的染料提高染料化學。微芯片的檢測區可具有非常深的蝕刻，以用額外通路長度來提高檢測和提高銳化條帶的分辨率。微芯片夾心結構和小光學元件的反射表面可增強光收集。最后下述直接注射法能夠將全部循環測序樣品加載到分離的通道中。通過仔細優化各元件，與現有研究方法相比可顯著提高檢測限值，因為同時降低了強大測序所需的標記片段的用量。旋轉掃描器和設備。在一些實施方式中，可采用倒置(up-looking)旋轉共聚焦激光誘導的熒光掃描器來檢測(interrogate)輻射狀μ CAE裝置。旋轉掃描器包括旋轉物鏡頭，該鏡頭偶聯于四色共聚焦檢測單元。旋轉掃描的基本優點是提供了高掃描速率，以及高位置準確性和速度一致性。旋轉掃描可能與具有少至I條-384條以上通道的10-、30-cm或更大直徑的晶片上的任何輻射狀晶片裝置相容。因此，可使芯片設計適合各種應用，如從頭測序中的長通道和再測序中的短通道。旋轉掃描器的一個例子的示意圖見圖30。用雙色分束器和鏡通過步進電動機的空心軸反射 200mW、488nm 激光(Sapphire OPSL, Coherent, Santa Clara)。在空心軸上方， 菱形棱鏡將光束從旋轉軸處移開1cm，高數值孔(> O. 7)物鏡使其通過微芯片的底層聚焦于通道。通過物鏡收集熒光，并通過光學系統將熒光傳回，經光譜和空間過濾后，用模塊化共聚焦四PMT單元檢測，其中Microstar IDSC板裝有8條DA通道。步進電動機以5Hz運轉，每旋轉一圈產生5120個數據點，空間分辨率為12微米，一般是100微米通道上8個數據點。第五條通道由光電二極管供料，該光電二極管由連接于掃描器軸的盤片上的槽觸發；在另外四條通道中開始數據獲取參照第五條通道中產生的電壓。掃描率一般為5Hz時，此設計對幾PM的熒光素檢測限敏感。在一些實施方式中，可用市售堿基調用程序預先處理和分析這些數據。在一些實施方式中，DNA分析模塊設備也可具有微芯片接口裝置，以控制電泳和微芯片再生。用校準工具定位后，可用加熱的真空吸盤將微芯片保持在位置上。在一些實施方式中，微芯片可具有約600輪壽命。該吸盤可具有三點以調節芯片的提升，相對于共聚焦檢測器平面保持平面。在微芯片周長上電極環可匹配儲存庫；可通過四個高電壓電源(Stanford Research Systems, 3101型)控制電極。可用中央定位的“臍帶”原位進行下述微芯片再生，以沖洗用過的基質并進行再填充，而儲存庫清潔和補充可來自管中管設計，內管去除材料而外管流動緩沖液或其它溶液。微芯片和操作。在一些實施方式中，微芯片可在四層裝置中整合親和樣品凈化和分離通道。用寡核苷酸捕獲序列進行親和捕獲凈化可能是樣品凈化和濃縮的強大解決方案。與可在注射時濃縮稀釋的樣品的電動學注射相反，沒有芯片上的濃縮步驟，雙T注射器在加載時進行預分離，然后進行“心臟切開”注射，這些方法都針對稀釋樣品的檢測。在分離微芯片上包括親和捕獲可使200nL CSM樣品在加載前稀釋到微升體積，因為親和捕獲可再濃縮稀釋的樣品，同時去除未摻入的終止物、離子和模板。因此，可分別設計CSM和DNA分析模塊，然后集成。在一些實施方式中，MINDS系統可采用具有輻射狀設計290 (圖34)、超轉角和中心來源291的12"晶片。在一些實施方式中，可采用8"晶片292的部分輻射狀設計，它們與可具有400條通道且分離長度長達45cm的12"設計的通道密度和長度相同(通過折疊通道實現)，這取決于應用。8"晶片可具有約108個分離通道293。圖21說明了 8"晶片的一個實施方式。在各種示范性實施方式中，此8"晶片可具有用于短閱讀的筆直14cm分離通道或用于長閱讀的長達約45cm的折疊通道。可將樣品吸入連接于兩個親和捕獲室的一個加載儲存庫，進而各自注入分離通道。加載樣品后，可降低具有電極的電極環，將各循環測序樣品電泳到兩個親和捕獲樣品凈化室上，各自具有基質以捕獲和濃縮正向或反向閱讀，同時去除循環測序反應混合物的不良組分。可通過將小室加熱到>65°C釋放正向和反向閱讀，將各閱讀分別電泳到雙T注射器中進行分析。因此，各加載儲存庫服務于兩條分離通道。分離后，可替換分離基質。可通過中心“臍帶”將基質泵入，所述“臍帶”含有基質管道和沖洗溶液，以及用于中心共用陽極緩沖液儲存庫的電連接。許多幾何形狀和設計均可用于400條通道的MINDS微芯片。可在許多CAE基質中進行分離。在一些實施方式中，可將微芯片安置在Peltier加熱器的真空吸盤上，以按需控 制最優分離條件和基質操作的溫度。分離后，可通過臍帶用緩沖液沖洗，以替代用過的基質。微芯片接口裝置中的手動管中管真空吸引單元A可去除儲存庫中用過的緩沖液和基質。可通過中央室加入新鮮基質；可加入基質感受器來提供反饋信號以最大程度降低基質浪費。在一些實施方式中，可用精確泵吸控制基質的替換，使其僅替換稍多于柱長度的基質。這兩種方法都能使基質用量降低高達10倍。可通過管中管的外管將緩沖液補充到儲存庫中，通過內管吸除基質。也可用工作線按需替換親和樣品凈化基質，如本文所述。在一些實施方式中，對潔凈的樣品來說，微芯片可持續600個循環。可通過軟件監測微芯片性能，并由LabRAT通過e-mail、尋呼或屏顯警告操作者性能降低。操作者可手工更換微芯片。在一些實施方式中，去除用過的微芯片可能需要拔掉芯片上閥和泵的臍帶、電極環和傳動束，然后釋放微芯片。可用校準工具幫助安裝新的微芯片，以使微芯片合適地定位。可通過用軟件輔助以手動方式或完全自動化地檢測校準標記并使光學元件聚焦來驗證校準。微芯片制造。在各種示范性實施方式中，顯微制造方法如下所述Liu等，2000.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10) :5369-5374 和 Anderson 等，2000, Nucleic AcidsRes. 28 :e60。通常,可用濃HF預蝕刻硼浮法(Borofloat)玻璃晶片(Schott,紐約州揚克斯)，然后通過CVD或濺射法沉積(一層)非晶硅掩模。在一些實施方式中，鉻-金可用于替換非晶硅。可將HMDS粘附層涂覆在非晶硅上，用一薄層光致抗蝕劑(Shipley，加利福尼亞州圣克拉拉)旋涂晶片，并進行軟烘培(soft-bake)。可通過具有所需通道圖案的掩模用紫外線使光致抗蝕劑圖案化。光致抗蝕劑顯影后，可去除暴露的非晶硅，用濃氫氟酸將通道圖案化學蝕刻到玻璃內，流體晶片上的通道深度約為40 μ m，多支管晶片上的深度約為70 μ m0然而，本領域技術人員能夠確定各種部件的深度。可剝離掉殘留的光致抗蝕劑和非晶硅。用裝有金剛石鉆頭的CNC-小型磨機在硼浮法通路晶片上鉆出250 μ m或更小的通孔。在一些實施方式中，可用定制激光器鉆出更小的孔。對生產而言，超聲鉆法可同時鉆所有孔。最后用H2S04/H202清潔后，可將流體晶片和通路晶片對齊，以使通孔與通道缺口處于合適位置，在真空電爐中用約570°c與通路晶片進行熱粘結，產生雙層μ CAE芯片。對5層微芯片而言，首先可對齊并組裝這三個玻璃晶片；其中兩個玻璃層可以是薄晶片。可用UV臭氧清潔器清潔多支管晶片和254 μ m厚PDMS膜(Bisco Silicones，伊利諾斯州Elk Grove),組裝這四層或五層微芯片。UV臭氧處理可產生不可逆的玻璃-PDMS粘結。最終可將微芯片切成單個CSM微芯片產品或整個用于MINDS微芯片。在一些實施方式中，可用塑料和其它材料制造微芯片以重現設計，所用方法如注射成型、熱壓凸、層壓和其它熟知方法。應用這些制造方法來制備微芯片屬于本公開范圍。DNA分析模塊的表征。在采用旋轉掃描器的實施方式中，可用流動染料溶液和作為內標的水拉曼峰(來自577. 6nm和589. 4nm的兩個峰)測定檢測限。進行標準的全體積PCR反應然后對標準PCR產物進行連續稀釋，從而表征裝有DNA分析模塊的樣品凈化和分離微芯片。可用本領域技術人員熟知的方法優化樣品凈化的參數(如加載、洗滌和洗脫條件)以及注射和分離的參數(時間、電壓、分離溫度、緩沖液濃度等)。可測定質量值、成功率和閱讀長度，并與測試和真實樣品進行比較。在一些實施方式中，閱讀長度可約為600個堿基或更長。在一些實施方式中，可測試親和捕獲的再生，并可測定性能下降之前的輪次數。用DMSO部分替代分離基質中的脲可降低輪次次數和在毛細管中產生長閱讀長度。在一些實施方式中，可用標準樣品重復運行微芯片以測定具有不同基質或涂層的微芯片的壽命。例如，為了對8x BAC文庫進行鳥槍測序，100條通道的DNA分析模塊微芯片可進行約22輪(測 定)Oii)裝有DNA分析模塊的集成循環測序模塊結合CSM與DNA分析模塊的特征，可產生核心MINDS系統。上述和圖14中的CSM微芯片的基本單元設計可與8" DNA分析模塊微芯片端口相連。這可產生具有50個用于成對末端閱讀的100-nL循環測序樣品制備室的微芯片，所述制備室是與100個成對末端閱讀親和樣品凈化室和分離微通道集成的。該系統的運行可采用微流體功能和微型機器人操作的芯片上功能來操作和再生微芯片。在包括外部自動化加樣設備的實施方式中，核心MINDS系統每天可產生7M堿基的高質量序列，與現有方法相比成本大大降低。設備。核心MINDS系統設備的基礎可以是DNA分析模塊設備。可采用未經改動的掃描器。可直接對上述CSM微芯片接口裝置進行微小的改裝，以I)使芯片上控制基于CSM微芯片的筒中液體移動的微型機器人的外部傳動自動化，2)控制外部加熱和冷卻，以進行熱循環，和3)驅動注射器泵以將循環測序試劑遞送給芯片。在一些實施方式中，不需要Tecan機器人。對于I)而言，外部傳動芯片上的閥，不需要改裝裝備，因為各傳動通道可服務于所有通道的所有特定閥，不管有2個或是400個。對于2)而言，加熱和冷卻可以在微芯片以外進行，可以是電阻加熱器的陣列或Peltiers條帶。可通過包括加熱器的額外長度和數量的結構設計實現改裝。加熱管理是本系統的重要考慮因素。對3)而言，不需要除注射器泵之外的附加泵。如下所述加入工作通道應能夠使一個注射器泵服務于所有通道。因此，裝備改動可以將CSM微芯片接口裝置的部件與DNA分析模塊微芯片接口裝置組合。在一些實施方式中，可設計微芯片接口裝置和微芯片的細節，以消除任何空間或溫度抵觸。可改裝真空吸盤，使其具有用于樣品制備和凈化室的較低溫度的環。用下述芯片上微型機器人操作(service)微芯片的構思可大大簡化組合CSM和DNA分析模塊微芯片接口裝置的設計。微芯片和操作。核心MINDS微芯片可直接將CSM微芯片功能和設計與DNA分析模塊的樣品凈化和分離集成。圖22顯示了一種示范性設計的一對通道。需要注意，閥和泵的傳動線314會在微芯片上的圓環中-在圖22中它們表現為水平線。
可將樣品-PCR產物或帶有PCR產物的珠-加載到輸入儲存庫中。基本CSM重復單元(可重復約200次)可將樣品泵入含有循環測序混合物的IOOnL循環測序反應室316，四個環繞閥關閉，進行循環測序。循環測序后，就像在CSM中那樣，可將循環測序產物和反應物泵入含有水的儲存庫中 ，不同的是此時它具有電極連接。可將樣品電泳到兩個成對閱讀的親和捕獲室317-318中。可去除污染物，并可通過雙T注射器將純化的熒光標記的循環測序片段注射到兩條分離通道中；此單元可重復(例如)約200次，以產生400條分離通道。可在高效納米凝膠或其它基質中分離片段，并通過旋轉掃描器在中心附近進行檢測。在一些實施方式中，具有約100條分離通道的8 "晶片可用于模擬可具有約400條分離通道的12"晶片的四分之一扇區。微芯片可提供45分鐘的分離循環時間，以及45分鐘的循環測序和凈化循環時間，一個成對閱讀循環測序反應室可提供兩條分離通道。這簡化了設計，減少了需要的閥、電極和通道的數量。分離可以是幾乎連續的，僅微芯片再生和預運行與分離共享了循環時間。在35分鐘分離期間，可從樣品加載到輸入儲存庫中再次開始樣品分離循環。在一些實施方式中，可制備好樣品并在分離通道準備好接受注射時準備分離。在一些實施方式中，可采用按需提供單分離通道的多循環測序或基因型分析室。除了具有共同的中心陽極以外，微芯片還可具有共同的圓形開放陰極通道，它環繞著具有大緩沖容量的微芯片圓周。此通道可具有額外的緩沖容量，以防止離子耗盡而減少分離，簡化電極數量和安置，并可允許不去除緩沖液和過量基質的情況下重復加載基質。微芯片也可采用三維結構使工作通道(即循環測序混合物、廢液、親和凝膠聚合物、水)跨越其它通道，以大大簡化設計和操作。在一些實施方式中，組合的CSM和DNA分析模塊微芯片接口裝置可依賴采用中心晶片雙面蝕刻的三維微芯片設計使芯片上的微型機器人操作微芯片。該工作通道建立在閥連接多層設計中不同層的能力的基礎上。圖12說明工作通道320的連接的實施方式，它向樣品凈化室321提供新鮮的親和捕獲基質。在所示設計中，工作通道流徑從蝕刻晶片322上方的左側進入，跨過分離通道，上行至PDMS層的閥323的一個孔，跨過，然后下行至該閥的第二個孔，進入雙蝕刻的晶片的下層，在這里蝕刻了樣品制備、凈化和分離通道321、324。然后，工作通道流徑通過親和捕獲樣品凈化室(它垂直于該圖的平面)和通過一個閥再結合于蝕刻微芯片上方。這允許微芯片上側的工作通道穿過樣品分離和其它通道，從它們的上方穿過而不干擾它們。可將此相同原理應用于樣品制備通道，但不可應用于分析通道。單個工作通道可以是寬而深的，它將遞送循環測序混合物、用兩種親和捕獲基質再填充兩個樣品凈化室、提供洗滌以恢復樣品制備室以及收集所有樣品制備、樣品凈化和分離通道的廢液。這六個工作通道將各自在微芯片上形成同心環。它們將連接于注射器泵、大規模流體裝置或真空線。雙蝕刻的晶片和PDMS之間的“額外”晶片層將僅含通孔。由于蝕刻通道位于蝕刻晶片的兩側；通孔可相對較大，除了循環測序混合物。可如下所述進行微芯片的再生。分離后，中央臍帶可將新基質推入通道，僅僅充滿分離通道。側通道上不同的通道寬度可指導基質向陰極流動。在一些實施方式中，可用兩條工作通道再生兩個樣品凈化室。通常，由閥關閉工作通道。例如，為了取代親和基質，可打開閥，激活通道的注射器泵，將新親和基質泵入所有正向室(每次加載親和基質都可能進行多輪)。在其它親和室中進行了相似順序的步驟。簡單地，可通過將洗滌溶液從洗滌工作線泵入小室、然后進入廢液儲存室清潔循環測序反應室。緩沖液儲存庫可連接于晶片最上方的共用大儲存庫。大體積可最大程度降低蒸發和緩沖液耗盡的影響，并簡化緩沖液填充和沖洗。可根據以下實施例進一步理解本發明的各個方面，不應認為這些實施例以任何方式限制了本發明范圍。 G.實施例I.基于珠的大腸桿菌(E. coli)捕獲用偶聯于磁珠的單克隆或多克隆抗體捕獲稀釋溶液中的模式靶生物可用于提供濃縮、純化的物質，以用于引入BPM微裝置。本文中，我們描述了偶聯有抗大腸桿菌菌株0157抗體的DYNAL 珠的應用。我們進行了三個連續實驗(I)捕獲稀釋母液中的大腸桿菌，(2)在芽孢桿菌(Bacillus)大量過量的情況下捕獲大腸桿菌，和(3)捕獲獲自Baltimore空氣取樣器的氣溶膠樣品中的大腸桿菌。我們首先比較了DYNAL “藥簽方案”，該方案用于檢測食物樣品中的大腸桿菌0157，其中將珠直接接種到合適的生長培養基上。我們發現，將非病原性菌株0157和大腸桿菌ATCC菌株700728直接接種到胰酶解酪蛋白大豆瓊脂(TSA)上產生的集落約多5倍，因此能比藥簽法更好地估計捕獲生物體的數量。因此，我們在所有后續實驗中都采用直接接種。我們測定了在Io5Cfuail-Io1Cfuail的細胞效價范圍(在pbs/吐溫緩沖液中)上DYNAL 珠結合大腸桿菌的能力。在這些和后續免疫磁性分離(IMS)實驗中，方案是將5 μ L DYNAL 珠懸液加入大腸桿菌的250 μ LPBS/吐溫適當稀釋液中。在搖床上在有帽塑料小離心管中混合細胞和加入的珠10分鐘。然后在試管側面用強大磁力捕獲珠，去除上清(但保存用于接種)，用PBS/吐溫緩沖液洗滌珠三次。重懸珠，接種珠的稀釋液。在幾個實驗中，我們也將洗液接種。通常，洗液含有少量靶生物；靶細胞或者被珠捕獲，或者未結合并可在初級上清液中回收。圖35顯示出捕獲稀釋在PBS/吐溫中的大腸桿菌0157的結果，一式三份地進行捕獲，細菌起始濃度為2父105、104、103、102、20和2個細胞/!^。在IO5-IO個細胞/mL的范圍內，捕獲細胞的觀察數量為線性(R2 = O. 995)，在IO5-IO3個細胞/mL的范圍內捕獲效率約超過95 %，在100個細胞/mL時降低到87 %，在20個細胞/mL時降低到69 %。在大腸桿菌濃度為IO3-IO5時，其它實驗(數據未顯示)中從PBS/吐溫中回收的回收率通常大于85%。2.用單克隆抗體捕獲大腸桿菌的動態范圍首先在試管中的250 μ L體積中研究捕獲化學，用分散于緩沖液的模式生物優化捕獲和洗滌。圖36顯示出用偶聯于DYNAL 珠的單克隆抗體代表性捕獲大腸桿菌。將大腸桿菌0157以各種濃度加入與抗大腸桿菌0157抗體偶聯的5 μ L珠的250 μ LPBS/吐溫溶液中。在旋轉混合器上混合該混合物10分鐘。用強磁力將珠拉到試管一側，去除上清。用250 μ LPBS/吐溫(PBST)洗滌珠三次。將洗滌過的珠重懸于250 μ LPBST,在TSA上計數捕獲的大腸桿菌。圖36所示結果證明，發現在珠的用量和其捕獲大腸桿菌的能力之間有劑量反應關系。圖36顯示出，在高達約IO6個細胞/mL時捕獲呈線性，在最大約4χ107個細胞/mL時達到飽和。IO6個細胞/mL以上時，在上清中回收到的細胞百分數逐漸增加。用大腸桿菌飽和的DYNAL 珠的直接顯微鏡檢揭示出，約5個細胞/珠。此捕獲方法證明，在15分鐘內能夠從250 μ L (低至10 μ I以下體積)中純化和濃縮的靶細胞平均超過90%。3.用單克隆抗體特異性捕獲大腸桿菌為了測定基于珠的捕獲的特異性，我們測試了在標準試驗條件下加入蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus) (ATCC 11778)細胞對大腸桿菌與抗體-包被的珠的結合的影響。將約IO4個大腸桿菌/mL的懸液與不同效價的蠟樣芽孢桿菌混合，如上所述進行IMS，除了回收所用的TSA培養基中加入了四唑鹽，加入的水平能選擇性抑制蠟樣芽孢桿菌。這允許直接接種細胞混合物，但僅大腸桿菌可復制，從而可定量為菌落形成單位(CFU)。如圖37所示，當存在的兩種微生物的比率為1/1時，蠟樣芽孢桿菌的加入將結合于珠的大腸桿菌數量降低了約20%，但芽孢桿菌過量100，000倍僅能將大腸桿菌結合降低至對照的56%。這說明，對于這種抗體-細胞結合，DYNAL 珠可產生出色的特異性。 4.用單克隆抗體捕獲氣溶膠樣品中的大腸桿菌已經證明，我們可有效捕獲、純化和回收細菌細胞，我們想要將其擴展至回收溶液中的大腸桿菌0157，該溶液含有90% (v/v)來自Baltimore空氣取樣器的液體(BASL)樣品(Spector Industries)。BASL含有極多種類的競爭微生物、花粉以及其它化學和生物物質，它們可能干擾抗體介導的結合和回收。為了測試我們濃縮和回收BASL溶液中的大腸桿菌0157的能力，我們在純培養物中培養了菌株，并用90% BASL制備成102、103和104CFU/mL的效價，用PBST作對照。將
5μ LDYNAL 珠懸液(含有抗-0157抗體)加入含有90% BASL或PBST中的大腸桿菌的250 μ L樣品中，在搖床孵育10分鐘，然后進行珠捕獲。去除上清，用PBST洗滌珠三次，將珠重懸于PBST。將原始上清和珠接種，以測定CFU數量。用加入Cefixime和Tellurite的MacConkey-山梨糖醇瓊脂(CT-SMAC)確定所有板計數。CT-SMAC是大腸桿菌0157的半選擇性培養基，它用于降低BASL中所含大量生物體中非大腸桿菌CFU的總數，并通過發酵山梨糖醇提供0157的比色指征。用我們的標準MS方案出色地結合和回收了含90% BASL的溶液中的大腸桿菌0157(圖38)。通常，大于90%的細胞結合于MS珠并被回收，無論細胞是分散于PBST或90% BASL中。在由104、103和102CFU/ml測試的細胞濃度范圍內，情況都是這樣。圖39顯示了特別針對104CFR/ml效價的數據組。第一個柱和第三個柱顯示了對照的效價。第二個柱顯示了僅用PBST中的樣品作對照時，柱組分和上清組分中回收的細胞比例。第四個柱顯示了僅用90% BASL進行實驗時，柱組分和上清組分中回收的細胞比例。本實驗說明，BASL中的組分不干擾結合和回收，至少對這種抗體和其表位如此。5.固相提取(SPE)我們評價了可處理多達一升樣品體積、使分析物結合到小表面上而允許干擾化合物流過的芯片外一次性流過式裝置的SPE。最后，可回收濃縮形式的靶分析物，以用基于微芯片的生物處理器進行下游處理，或者SPE材料本身可以是該微芯片的給料。我們評價了大腸桿菌的二氧化硅基質SPE捕獲。基本方案是使不同效價的細菌通過固相、通過小體積的反向沖冼洗脫，然后分析上清和洗脫液中的細菌含量。在下述實驗中，用PBS/吐溫(PBST)制備IO4-IO2個細胞/mL稀釋度的大腸桿菌菌株DH5a (InvitrogenTechnologies)。將具有IOOmg固相床的裸露的二氧化娃提取物-清潔SPE筒(AlltechAssociates)用于所有實驗。對各筒而言⑴將18mL細菌/酶混合物通過SPE床，流速約為5mL/分鐘；⑵收集上清并分析細菌效價；(3)用2mL緩沖液反向沖洗該筒，測定洗脫液中的細菌數量。如上所述用TSA在37°C培養細菌進行分析，以測定細菌的相對捕獲和回收。6.在流過模式中SPE介質對細菌的保留。圖40顯示了細菌試驗結果，表明在加載樣品中、以及細菌濃度相對高(25，000或45，000CFU/mL)的樣品的SPE后上清液(未結合)和洗脫液中的細菌濃度。在此范圍內，80-90%大腸桿菌保留在SPE基質上(圖41)，而少量細菌通過，非常少量(1%)通過反向洗滌回收。因此，在二氧化硅上產生強烈結合，活細胞被洗脫的很少。在效價非常低(125和250CFU/mL)時，成比例地更多的細胞通過該柱，僅約20%的細胞被保留(數據未顯示)。
7.在流過模式中通過SPE和瓊脂糖“大珠”介質保留蛋白質半乳糖苷酶)一些實施方式采用基于瓊脂糖的“大珠”來捕獲或純化生物物質。將市售β -半乳糖苷酶(Sigma)溶解于O. IM磷酸鹽緩沖液，pH 7. 5，ImM MgCl2中，濃度為:100和IOng/ml。將這兩種溶液通過含有IOOmg 50 μ m 二氧化硅顆粒(孔徑50A )的“提取物清潔” SPE筒(Alltech)，或5ml含有500 μ m硬化瓊脂糖珠的“大珠”柱。對瓊脂糖和二氧化硅衍生的介質而言，將酶溶液(20ml)通過其各自的SPE床，流速約為5mL/分鐘，收集上清，用2mL緩沖液以約為Iml/秒的流速反向沖洗該筒。用ο-硝基苯基-β-半乳糖苷(ONPG)作底物分析上清和洗脫液中的酶活性。圖42顯示出在10和100ng/ml酶濃度下兩種基質的“上清”、“洗脫液”和“保留”組分的β_半乳糖苷酶活性分布圖。通過加載物、流過液和洗脫液之差計算“保留”。對于基于二氧化硅的SPE介質，流過約75%的β_半乳糖苷酶，在上清中回收。在反向沖洗洗脫液中檢測到的酶非常少(1-2% )。因此，約25% β-半乳糖苷酶保留在柱上。對于“大珠”介質，85-99%的β-半乳糖苷酶流過該柱，而在洗脫液中回收的少于5% (圖42)。這意味著非常少量(約0-10%)保留在基質上。因此，這些介質可用于流過模式，以分離靶分析物(如毒素)與保留物質。8.在流過模式中用瓊脂糖“大珠”作為捕獲介質保留大腸桿菌我們評價了瓊脂糖大珠筒選擇性結合和濃縮大腸桿菌菌株DH5CI的能力。圖43顯示出獲自以初始細胞濃度2，000或4，700CFU/ml進行的大珠捕獲試驗的組分中大腸桿菌DH5a的分布。用0. IM磷酸鹽緩沖液，pH 7. 5，ImM MgCl2進行這些實驗，其中采用IO4或103CFU/mL的20mL細菌懸液。該試驗是在TSA平板上生長。較低效價(2，000CFU/ml)時，在流過組分中回收了> 70%細菌，在反向沖洗的洗脫物中回收的少于1%。較高效價(4，730CFU/ml)時，在流過組分中回收了> 80%細菌，在洗脫物中回收的少于5%。因此，僅25-10%細菌保持結合于大珠基質。9.納米生物處理器微芯片主要根據Liu 等，2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10) :5369-5374 所述顯微制造微流體裝置。簡要說，清潔硼浮法玻璃晶片，沉積非晶硅掩模，然后沉積HMDS粘附層和光致抗蝕劑層。通過掩模用紫外線使光致抗蝕劑圖案化，用濃HF化學蝕刻通道圖案，流體晶片上的通道深度一般為40 μ m,多支管晶片上的深度為70 μ m。剝離掉光致抗蝕劑和非晶硅，用裝有金剛石鉆頭的CNC-小型磨機鉆出通孔。這些孔可用于四層微芯片，作為反應和檢測室。或者，我們采用超聲鉆法同時鉆所有孔。清潔后，將流體晶片和通路晶片對齊，進行熱粘結。加入多支管晶片和PDMS膜產生四層微芯片。設計和生產兩種納米生物處理器微芯片。第一種微芯片MBI_11240(圖19)設計用于分離和測試芯片上各種規模的主要微流體處理部件。它包括以下實施方式(I)閥設計，⑵反應室設計，⑶成組(ganging)反應和⑷路由選擇器設計。各元件的操作由全部(full scale)八條通道氣動系統241控制，該系統操作閥、泵和路由選擇器。我們測試了對3層和4層芯片中的MOV閥、泵和路由選擇器的操作。經設計，該芯片的各元件與8通道全尺寸氣動總線接口相連，以有助于閥操作。開發了第二種納米生物處理器微芯片MBI-12，以測試循環測序或PCR所用珠的樣品制備和測試μ CAE (單獨或與樣品制備聯合)。蝕刻圖20所示掩模設計，將其組裝到有功能的四層微芯片中，進行測試。ΜΒΙ-12具有幾種μ CAE通道設計以及如何將它們連接于上游樣品制備裝置的設計。我們已經證明了用MOV閥、泵和路由選擇器混合以及用在深室如通路中能良好地發揮作用的表面聲波(SAW)混合。SAW在微芯片的小室內產生脈沖式內壓波并使溶液均勻化以混合。10.進行生物防衛樣品制備的納米生物處理器這種生物處理器模塊接受來自上游空氣樣品收集器或其它輸入裝置的樣品，產生用于儲存或再測試的等份，裂解樣品，制備和標記樣品，并將它們輸出至單分子熒光相關檢測器進行分析。生物處理器模塊包括含有流體的一次性塑料筒和操作該筒的設備。在分析之前分級樣品并將其分為等份。自動化的微流體處理器可1)制備用于測試的核酸；2)制備用于測試的蛋白質；3)制備用于檢測的細胞；4)儲存，以再測試陽性樣品和進行法醫分析。該筒是“⑶”形式，每個筒的扇區中具有12個生物處理器單元，各單元用于一種樣品。該筒加工生物處理器單元中的一種樣品，然后旋轉以接受下一個生物處理器單元中的下一個樣品。在2小時取樣方案中，每天可從小圓盤傳送帶中儲存的筒組中自動改變該筒，類似于⑶交換器。約每兩周進行一次手工介入，以再供應筒和試劑。該設備提供了某些機構來儲存、加載試劑、運行和換筒。該設備具有以下功能1)打開和關閉電磁閥以輸送壓力或真空來操作閥和泵，2)加熱和冷卻筒上的區域，3)從小圓盤傳送帶移出或移入筒，4)超聲破壞微生物，和5)需要的其它功能。11.進行生物防衛遺傳分析的納米生物處理器樣品濃縮模塊。從宏觀尺度(macroscale)開始,將用祀生物表面表位的抗體修飾的磁珠加入小室中毫升體積的空氣收集器210流出物(或由其它基質產生的漿液)中(圖8)。珠是用對單個生物、亞型、物種等特異的抗體包被的珠組的混合物。加入另外的試劑混合物可擴展所研究的生物范圍。珠捕獲靶生物，而通過洗滌去除污染物-提供了選擇性和特異性的第一維度(dimension)。在SCPM 211中通過磁力收集含有祀生物的珠。樣品擴增和分析模塊。現在進入微尺度，將這些珠加載到納米生物處理器(NBP)微芯片213上的含有裂解緩沖液的儲存室212中，所有進一步操作都在微流體尺度上進行。經設計，NBP微芯片200(圖18)能處理單個生物處理器單元中的樣品，其中采用芯片上的微流體閥和泵作為控制元件。從儲存庫221泵吸珠，直到它們被閘板222捕獲，在閘板處進行超聲處理以破壞芽孢和/或細胞并釋放DNA。將DNA移動到反應室223，在此通過芯片上的泵加入含有μ RT-PCR所用探針的特異性引物的PCR試劑，以多重反應進行μ RT-PCR-提供選擇性和特異性的第二生化維度。雖然RT-PCR是有力的分子診斷工具，但因為核酶不能淬滅熒光染料、非特異性延伸或其它機制，RT-PCR也有背景高且可變的缺點。為了最大程度降低假陽性結果，通過快速(<5分鐘)芯片上的微通道毛細管陣列電泳分離224分離推定陽性的yRT-PCR樣品，以進一步研究選擇性和特異性。生物信息學引物設計產生了不同片段長度的產物，通過微通道電泳分離和熒光發射區分開這些產物-這允許增加PCR反應的多重數，其中通過片段篩分驗證和鑒定真陽性結果。至少96個生物處理器單元輻射狀地安置在微芯片225上(圖18)。采用每小時一個通道時，96通道微芯片工作4天。12.在納米生物處理器中進行的EXPAR反應EXPAR是用寡核苷酸序列、熱穩定聚合酶和切口酶(nicking enzyme)在60°C特異 性擴增DNA短節段的快速等溫法。通過熒光或MS檢測產物。可在納米生物處理器中進行EXPAR反應，以進行遺傳測試、基因表達測定、分子診斷、生物防衛和其它應用。在一個步驟中將反應混合物加入樣品，熱穩定聚合酶和切口酶的作用方式與微通道中的大多數其它蛋白質相似。在稍許改裝的圖15或20所示微芯片中或在圖13所示微芯片中進行EXPAR。將核酸(DNA或RNA)移動到微通道如標有MS輸入250的微通道中，用MOV泵251泵入小室，然后從試劑通道之一 252加入單一反應混合物。流體線路用于將多種反應物之一加入反應室253。任選地控制反應室的溫度。反應后，用MOV泵將處理的樣品泵入儲存庫或管254中，以進行芯片外MS分析或微芯片上的熒光、化學發光或其它檢測方法的分析。除了用于分析的單個通道以外，可用MOV路由選擇器將樣品分到許多通道中，然后進行多重-EXPAR。13.在納米生物處理器中進行的RiboMaker反應RiboMaker檢測系統基于采用人造啟動子復合物(APC)和稱為RiboLogs 的核苷酸類似物的RNA聚合酶(RNAP)轉錄起始中斷(稱為abscription )。APC提供了 RNAP聚合酶的起始位點，以產生50-450個三核苷酸中斷產物/分鐘/位點。檢測可以是MS分析、熒光、化學發光或本領域技術人員熟知的其它方法。對于DNA或RNA分析，APC可具有提供靶位點探針特異性的側接序列。具有不同質量單位的RiboLog可鑒定結合的是哪個位點。通過多重APC與待研究序列的不同部分的結合，RiboLog指紋可為生物防衛提供額外的特異性信息，這可幫助消除假陽性和假警報。對蛋白質而言，APC單元可連接于抗體。RiboMaker檢測聲稱能快速、線性地檢測，并且對抑制的敏感性低于PCR。在納米生物處理器微芯片如圖13所示芯片上完成RiboMaker反應。加入一種APC試劑，然后加入一種反應混合物，需要兩個混合步驟。如果在珠上捕獲了 RiboMaker樣品，該珠通過“IMS輸入”(圖13)進入反應室，該反應室任選地裝有閘板或具有磁性以捕獲珠。用試劑通道之一加入APC。從第二個試劑通道加入RiboLog。如果需要，使該反應在泵A和B之間來回移動。14.微芯片CMS陣列設計16通道微芯片270的實施方式見圖23。閥和泵的傳動線271互相垂直并終止于微芯片底部的通路上，外部傳動線可連接于此。通過注射器泵將循環測序混合物供應到左側通道272中，將用于再生微芯片的水或緩沖液供應到右側通道273中。復合這兩個“工作”通道，以注入所有16條通道，并使芯片上的泵或閥274分別控制流動。為來自玻璃晶片和PDMS膜的四層裝置構造此微芯片。15.完整的MINDS系統為了產生完整的MINDS系統，改裝來自核心MINDS系統的設備1)加入珠工作通道，并與珠分選法接口相連，以遞送單個珠；2)微芯片接口裝置上的電阻加熱器設計和電極環更換到微芯片；3)通過微芯片改裝保證重復地加載和卸載單個珠。MINDS微芯片設計見圖24。該微芯片類似于圖22所示核心MINDS微芯片，除了珠工作通道導聯330至輸入線，將樣品體積減少四倍，至25nL，在循環測序室中形成閘板以捕 獲珠。通過輸入通道輸入單個珠。將閘板蝕刻到僅2 μ m，這需要額外的掩模和制造步驟。將單個珠泵入循環測序室，該小室具有導向電極和流向親和捕獲室的通道。閘板阻止了珠的移動。一旦加載珠后，通過芯片上的泵將含有正向和反向成對末端閱讀引物的25nL循環測序混合物泵入反應室。關閉與小室相鄰的閥，循環溫度。循環后，將循環測序混合物中的循環測序產物泵入電極儲存庫6中，電泳至兩個樣品凈化室中，基本如上所述進行處理，各成對末端閱讀注射入分離的分離通道。打開導向廢液的閥，通過洗滌線將珠沖洗到廢液通道中。如上所述進行分離再生。通過以下方法將單個珠注入各通道1)操作良好分離的微流體珠串，并將它們連續或平行移動到各通道中，2)從珠‘箱”注入各通道，并將它們分配到循環測序反應器中，一次一個，或3)磁性操作單個珠或收集到毛細管末端進行“收集-和-放置”操作。對于珠串方法，在空間上一個珠與下一個珠通過一團(bolus)液體良好分離，所述液體可能是不混溶的如FluorInert (3M)。我們以前成功地將FluorInert團用于循環測序和PCR反應。將珠串一起移動到粗糙位置上。然后關閉循環珠工作通道上的閥，使流動轉向通過單個循環測序室，其長度足以將珠移動到加載通道中。關閉加載通道上的閥，打開珠工作通道上的閥，將下一個珠放入下一通道。也可能有平行變化，平行變化可能最大程度降低加載時間。光學珠感受器也可有助于調節時間和給料流。MINDS系統采用激光鉆出50 μ m測試孔的閥和泵，以使泵體積降低幾納升。或者，在各循環上完成部分“行程(stroke)”以部分打開具有250 μ m孔的閥。脈沖小室周圍的閥，以移動小室中的珠，或者施用外部超聲混合。通過添加劑改善表面相互作用，按需進行表面修飾。對直接注射而言，樣品凈化基質位于分離通道的連線中。如圖44所示，此設計具有用于珠和樣品凈化的循環測序室的常見元件，除了樣品凈化室被移動到分離通道的陰極偵^在樣品凈化基質上電泳循環測序樣品，污染物移動到陰極室中，如果需要可沖洗陰極室。清潔樣品是樣品凈化基質上的銳條帶，通過加熱該小室釋放清潔樣品，開始分離。這依體積將銳條帶注射到分離通道上。因此，分析了各樣品凈化基質上收集的所有樣品，這與典型雙T注射中發現的“心臟切開”相反，在雙T注射中雙T的加載僅能分析一部分樣品。以下內容對應于原案申請的權利要求書I. 一種模塊化系統,其包括第一模塊，其包括捕獲和純化靶分析物的器件以及將所述靶分析物引入微流體裝置的器件，和第二模塊，其包括所述微流體裝置，其中所述微流體裝置適用于檢測或分析所述革巴分析物。2.如項I所述的系統，其特征在于，所述靶分析物選自細菌、病毒、芽孢、真核細胞或核酸。3.如項2所述的系統，其特征在于，所述細菌是炭疽桿菌。4.如項2所述的系統，其特征在于，所述芽孢是炭疽桿菌芽孢。5.如項2所述的系統，其特征在于，所述細胞是癌細胞。6.如項2所述的系統，其特征在于，所述核酸是DNA。
7.如項6所述的系統，其特征在于，所述分析包括測序所述DNA。8.如項6所述的系統，其特征在于，所述分析包括擴增所述DNA。9.如項I所述的系統，其特征在于，所述微流體裝置是項32所述的微流體裝置。10. 一種磁行波流過式裝置，其包括旋轉極片；流過管；和磁性固定片，其中所述旋轉極片、所述管和所述固定極片以某種方式布置，并包含適合在旋轉所述極片時在所述流過管中產生磁行波的材料。11.如項10所述的裝置，其特征在于，所述極片以至少約IOOHz旋轉。13.如項10所述的裝置，還包括位于所述管腔內的珠。14.如項10所述的裝置，其特征在于，所述珠是磁珠。15.如項14所述的裝置，其特征在于，靶分析物附著于所述磁珠。16.如項15所述的裝置，其特征在于，所述靶分析物被所述磁珠親和捕獲。17.如項16所述的裝置，其特征在于，所述靶分析物選自細菌、芽孢、病毒、真核細胞或核酸。18.如項10所述的裝置，其特征在于，所述流過管注入微流體裝置。19. 一種裂解或破壞靶分析物的方法，其包括a)將靶分析物和磁珠引入項10所述的磁行波裝置的流過管中；和b)旋轉所述裝置的極片，旋轉頻率適于在一個或多個方向上加速所述管中的所述磁珠；其中所述珠裂解或破壞所述靶分析物。20.如項19所述的方法，其特征在于，所述靶分析物選自細菌、芽孢、病毒、真核細胞或核酸。21.如項19所述的方法，其特征在于，以至少約IOOHz旋轉。22.如項19所述的方法，其特征在于，所述靶分析物附著于所述磁珠。23.如項22所述的方法，其特征在于，所述靶分析物被所述磁珠親和捕獲。24.如項19所述的方法，其特征在于，所述流過管與微流體裝置流體相連。25.如項24所述的方法，其特征在于，所述靶分析物是核酸，所述微流體裝置適用于擴增所述核酸的序列。
26.如項24所述的方法，其特征在于，所述靶分析物是核酸，所述微流體裝置適用于測序所述核酸。27. 一種流過式超聲器，其包括適合包含氣溶膠的小室；和超聲器探頭，其中所述小室包括樣品入口和樣品出口，所述探頭位于所述小室中的方式使探頭適合處理位于所述樣品入口和樣品出口之間的樣品。28.如項27所述的超聲器，還包括
流體樣品，其中所述樣品流過所述小室。29.如項27所述的超聲器，其特征在于，所述樣品出口與微流體裝置流體相連。30. 一種裂解或破壞靶分析物的方法，其包括當所述超聲器的小室中存在包含靶分析物的樣品時，啟動項27所述的流過式超聲器的探頭，從而，超聲處理所述靶分析物。31.如項30所述的方法，其特征在于，所述靶分析物選自細菌、芽孢、病毒、真核細胞或核酸。32. 一種微流體裝置，其包括與兩個親和捕獲室流體相連的加載儲存庫，其中所述捕獲室各自與分離通道流體相連，適合將包含正向和反向核酸測序產物的樣品由所述儲存庫向所述親和捕獲室電泳的電極，其中所述捕獲室包含適合捕獲所述正向或反向測序產物的親和捕獲基質；和對所述親和捕獲室進行溫度控制的器件。
權利要求
1.一種樣品加工和分析系統，包括 (a)—組集成的模塊,包括 (i)標記性和濃縮性芯片外大規模模塊，該模塊包括 (1)儲存室，用于接收一毫升至一升體積的液體樣品；和 (2)磁珠，其被包含在所述大規模模塊中，用于通過捕獲和濃縮核酸分析物來進行標記；和 (ii)生物處理器模塊，包括 (1)微流體芯片，包括與所述大規模模塊流體連接的微流體通道并被設置成從所述大規模模塊接收所述磁珠；和 (2)與所述微流體通道流體連接的反應室，其中該反應室被設置成接收攜帶所述核酸分析物的所述磁珠并對該核酸分析物進行核酸擴增反應，以產生加工的樣品； (b)壓力源，其被設置成用于將所述磁珠從所述大規模模塊通過所述微流體通道移動到所述反應室中，其中具有捕獲的核酸分析物的所述磁珠以減小的樣品體積移動到所述微流體芯片上； (c)分析模塊，其與所述反應室流體連接并被設置成在所述加工的樣品上進行分析； (d)一個磁鐵，其被設置成將具有捕獲的核酸分析物的所述磁珠固定在所述大規模模塊中，并以減小的小規模體積移動和釋放具有捕獲的核酸分析物的所述磁珠；和 (e)包括軟件的計算機，該軟件被編程以使所述芯片外大規模模塊、手持式生物處理器模塊、所述壓力源、和所述分析模塊所進行的操作完全自動化。
2.權利要求I的系統，其中所述壓力源包括泵。
3.權利要求2的系統，其中所述泵包括位于所述微流體芯片上的氣動隔膜泵。
4.權利要求I的系統，其中使用所述磁珠將所述核酸分析物從所述樣品體積至少濃縮1000 倍。
5.權利要求I的系統，其中該系統被設置成處理多個樣品。
6.權利要求I的系統，其中該系統被設置成在所述液體溶液樣品體積中裂解細胞。
7.權利要求I的系統,其中所述磁珠結合DNA。
8.權利要求I的系統，其中所述核酸分析物是DNA。
9.權利要求I的系統，其中所述系統還包括PCR試劑。
10.權利要求9的系統，其中所述PCT試劑以可變數量的串聯重復(VNTR)進行PCR。
11.權利要求I的系統，其中所述分析模塊被設置成進行毛細管電泳。
12.權利要求I的系統，其中該系統是完全自動化的。
13.權利要求I的系統，其中所述微流體芯片是一次性的。
14.權利要求I的系統，其中所述微流體芯片是手持的。
15.—種方法,該方法包括 (a)在大規模模塊中，用珠子從液體溶液樣品體積中捕獲靶標分析物； (b)將具有捕獲的靶標分析物的珠子從所述液體溶液中移除； (C)用壓力源將具有捕獲的靶標分析物的珠子從所述大規模模塊中移動至微流體裝置上與該大規模模塊流體連接的微流體通道中，其中將所述具有捕獲的分析物的珠子移動到該微流體裝置導致所述樣品體積減小；(d)將具有捕獲的靶標分析物的珠子從所述微流體通道中移動至與該通道流體連接的反應室中； (e)在所述反應室中進行反應，生成加工的樣品； (f)將所述反應產物從所述反應室中移動至與該反應室流體連接的分析模塊中；和 (g)對所述加工的樣品進行分析。
16.權利要求15的方法，其中所述壓力源包括泵。
17.權利要求15的方法，其中所述泵包括位于所述微流體裝置上的氣動隔膜泵。
18.權利要求15的方法，其中所述析物從所述樣品體積至少濃縮1000倍。
19.權利要求15的方法，其中該方法被設置成處理多個樣品。
20.權利要求15的方法，其中該方法被設置成在所述液體溶液樣品體積中裂解細胞。
21.權利要求15的方法，其中所述珠子結合DNA。
22.權利要求15的方法，其中所述珠子是磁珠。
23.權利要求22的方法，該方法包括將所述珠子用磁鐵固定在所述大規模模塊中。
24.權利要求15的方法，其中所述靶標分析物是DNA。
25.權利要求15的方法，其中所述靶標分析物是DNA，所述反應包括在所述DNA上進行PCR。
26.權利要求25的方法，其中PCR以可變數量的串聯重復(VNTR)進行。
27.權利要求15的方法，該方法包括在所述分析模塊中對所述加工的樣品進行毛細管電泳。
28.權利要求15的方法，其中 (i)所述IE標分析物是DNA； (ii)所述珠子是結合DNA的磁珠； (iii)所述反應包括進行PCR;和 (iv)所述分析包括進行毛細管電泳。
全文摘要
本發明公開了將微芯片與各種類型的模塊接口連接的方法和裝置。所述技術可用作各種應用，如DNA測序和基因型分析、蛋白質組學、病原體檢測、診斷和生物防衛的樣品制備和分析系統。
文檔編號G01N1/28GK102759466SQ201210228109
公開日2012年10月31日 申請日期2005年9月15日 優先權日2004年9月15日
發明者D·蘭克, L·L·布拉加, S·B·喬瓦諾維齊 申請人:英特基因有限公司