專利名稱：一種卵裂球單細胞的固定方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，特別是一種卵裂球單細胞的固定方法。
背景技術：
單個卵裂球細胞的固定是極難控制、掌握，但又非常重要的技術，是醫學界的一大難題，與傳統的多個細胞固定技術不同，卵裂球細胞的固定只對單個細胞進行操作，要求徹底去除胞漿蛋白，保留染色體DNA的完整性。細胞固定的好壞直接影響單細胞熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)的結果。傳統的細胞固定方法有兩種甲醇/冰醋酸法和Tween-20/HCl法。(I)甲醇/冰醋酸法細胞活檢后，用帶內徑135um的細針Stripper將單個卵裂 球轉移到細胞低滲液中2-5min，后將細胞移至玻片背面已畫圈標記的區域內，總液體量不超過2ul。在解剖顯微鏡下觀察直至細胞低滲液基本干透形成結晶之前用新鮮配制的甲醇/冰醋酸(3:1)從上方滴向標本固定細胞，此時細胞可能會隨著固定液形成的湍流而游走，但很快固定在玻片上，重復數次至胞漿完全溶解。并用鉆石筆標記細胞核的確切位置。(2)吐溫20/鹽酸(又稱Tween-20/HCl)法細胞活檢后，將單個卵裂球轉移到細胞低滲液中2-5min，后將細胞移至玻片上Iul細胞裂解液中固定，在倒置顯微鏡下觀察直至細胞膜破裂，胞漿去除，胞核游離固定，胞漿去除不全影響雜交效果。后滴幾滴甲醇/冰醋酸去殘留的胞漿，自然干燥，鉆石筆標記細胞核的確切位置。上述兩種傳統的方法的缺點是方法(I)所有的單細胞都需要低滲，因此耗時；細胞在固定過程中由于甲醇/冰醋酸揮發很快，因此細胞漂移非常迅速，極易導致細胞丟失而導致無法診斷；細胞固定的好壞與濕度相關，一般建議在30%濕度下進行，因此固定條件要求高；另外初學者很難掌握。方法(2)同樣需要低滲，并且需要自然干燥，因此耗時更長。
發明內容
針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明的目的就是提供一種卵裂球單細胞的固定方法，可有效解決現有技術操作復雜繁瑣，要求條件苛刻，難以掌握，耗時長，細胞固定效果差，胞漿蛋白去除不徹底的問題。本發明的技術方案是包括以下步驟
(1)將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，得漂洗的卵裂球細胞；
(2)將步驟(I)所得卵裂球細胞移至載玻片的標定區域內，標定區域內滴加有l-2yL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35-38°C的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發過程中觀察細胞膨脹、破裂、核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液；
(3)待在顯微鏡下觀察到步驟(2)中細胞的細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液，室溫15-30°C下干燥后，再在載玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去殘留的胞漿。
本發明操作簡單方便，耗時短，容易掌握，細胞固定效果好，固定率高，簡單高效，大大節省了人力和物力。
具體實施例方式以下對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
本發明由以下步驟實現
(1)將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，得漂洗的卵裂球細胞；
(2)將步驟(I)所得卵裂球細胞移至載玻片的標定區域內，標定區域內滴加有1-2UL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35_38°C的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發過程中觀察細胞膨脹、細胞膜破裂、細胞核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液；
(3)待在顯微鏡下觀察到步驟(2)中細胞的細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液，室溫15-30°C下干燥后，再在載玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去殘留的胞漿。所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液的為10 μ L質量濃度O. 01%的吐溫20、10 μ L摩爾濃度O. OlN的鹽酸和10 μ L水混合的混合溶液。所述的甲醇和冰醋酸的混合溶液為甲醇和冰醋酸按照體積比3:1的比例混合的混合溶液。所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液的溫度為35_38°C。本發明所述的方法是對吐溫20/鹽酸(Tween-20/HCl)法進行了改良，省去了細胞低滲步驟，同時在37°C顯微鏡熱臺上觀察細胞固定以節約固定時間。即卵裂球不經1%乙酸鈉低滲處理，直接在PBS中漂洗后移至載玻片標定區域內的1-2 μ L的
O.01%Tween-20/0. OlN HCl溶液中(37°C顯微鏡熱臺上)，液體自然蒸發過程中觀察細胞膨脹、破裂、核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復滴加Tween-20 /HCl溶液。待細胞膜破裂、細胞核游離、干燥后再在載玻片上滴幾滴甲醇/冰醋酸液除去殘留的胞漿。本發明所述方法，經反復多次顯微觀察以及雜交實驗證明，均取得了相同或者相近的結果，表明該方法穩定可靠，固定率高，固定所得的單細胞雜交效果良好，且操作簡單聞效，有關試驗資料如下
在顯微鏡下觀察，發現將活檢后的單個卵裂球直接置于37°C的Tween-20/HCl中，細胞膜出現腫脹；置于35-38°C的顯微鏡熱臺上，液體不斷蒸發，細胞膜逐漸腫脹、破裂，細胞核游離；經甲醇/冰醋酸液除去殘留的胞漿，觀察到有明顯的完整細胞核結構，說明染色體DNA保留完整。實驗I 本發明所述固定方法與現有卵裂球固定方法的比較
將288個細胞核明顯的卵裂球，隨機分為三組，使用三種不同的固定方法，A組甲醇/冰醋酸法；B組常規Tween-20/HCl法；C組本發明所述的改良后的Tween-20/HCl固定法。實驗結果見表I :三組方法總共成功固定了 268個單細胞，其中固定成功率A組與B、C組間有顯著差異(X2檢驗，X2 =6. 87,P =0. 032〈0. 05)，而B、C組間無顯著差異Gd >
O.05)。如表I所示。
表I卵裂球分組固定的效果
權利要求
1.一種卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，得漂洗的卵裂球細胞； (2)將步驟(I)所得卵裂球細胞移至載玻片的標定區域內，標定區域內滴加有l-2yL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35-38°C的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發過程中觀察細胞膨脹、細胞膜破裂、細胞核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液； (3)待在顯微鏡下觀察到步驟(2)中細胞的細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液，室溫15-30°C下干燥后，再在載玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去殘留的胞漿。
2.根據權利要求I所述的卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液為10 μ L質量濃度O. 01%的吐溫20、10 μ L摩爾濃度O. OlN的鹽酸和10 μ L水混合的混合溶液。
3.根據權利要求I所述的卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，所述的甲醇和冰醋酸的混合溶液為甲醇和冰醋酸按照體積比3:1的比例混合的混合溶液。
4.根據權利要求I所述的卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液的溫度為35-38°C。
全文摘要
本發明涉及一種卵裂球單細胞的固定方法，可有效解決現有技術操作繁瑣，要求條件苛刻，難以掌握，細胞固定效果差的問題。解決的技術方案是將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，移至載玻片的標定區域內，標定區域內滴加有1-2μL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35-38℃的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發過程中觀察細胞膨脹、破裂、核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液；待觀察到細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合液，室溫下干燥后，滴加甲醇和冰醋酸的混合液，除去殘留的胞漿。本發明操作簡單方便，容易掌握，細胞固定效果好，固定率高，簡單高效，大大節省了人力和物力。
文檔編號G01N1/28GK102706716SQ201210221309
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月30日 優先權日2012年6月30日
發明者孫瑩璞, 宋文妍, 彭兆鋒, 戴善軍, 李剛, 石森林, 辛志敏, 郭藝紅, 金海霞 申請人:鄭州大學第一附屬醫院