專利名稱：測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，具體涉及一種測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法。
背景技術：
b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b, Hib)可引起嚴重的腦膜炎、肺炎、會厭炎、蜂窩組織炎及骨關節感染。世界衛生組織估計，每年Hib可引起300萬5歲以下兒童患病，其中38. 6萬患者死亡，30% -40%的Hib腦膜炎患者有神經系統后遺癥。現在，Hib結合疫苗已作為常規免疫，得到廣泛的應用。
在Hib結合疫苗中，高分子結合物含量是一項重要質量控制指標，它與制品的免疫原性密切相關。Hib結合疫苗中高分子結合物的含量會明顯影響大分子結合物的免疫原性。常用的高分子結合物含量檢測方法為乙醇分步沉淀法，但是此法操作繁瑣，對操作人員的要求高，檢測時間較長，且對于高分子結合物濃度較高或較低的樣品，檢測誤差大。
發明內容
本發明的目的即在于克服現有技術的不足，提供一種測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它通過脫氧膽酸鈉在酸性條件下形成膠團并吸附沉淀蛋白質的特性，使結合態多糖與游離態多糖分離，再通過50%乙醇水溶液溶解出低分子結合物，以達到對高分子結合物的分離測定。本發明的目的通過以下技術方案實現
測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它包括以下步驟
A.取多糖含量為20 30μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,作為樣品I ;
B.取多糖含量為20 30μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,并配置1%脫氧膽酸鈉溶液200 μ L，將兩種溶液混合并冰浴30min，制備得到混合液；
C.向混合液中加入O.lmol/L鹽酸溶液200 μ L，攪拌混合均勻后，于溫度4°C轉速600(T7000rpm條件下離心30min,收集上清液作為樣品2 ；
D.取步驟C中所得沉淀，加入50%乙醇I.OmL放置I 2h，再加入50%乙醇2. OmL放置I 2h，于6°C轉速750(T8500rpm條件下離心lh，取2. 7mL上清液作為樣品3 ；
E.取步驟D中所得沉淀，加入O.5mol/L的氫氧化鈉溶液O. 5mL,放置lh，再加入I. 5mL的水，作為樣品4 ；
F.分別量取I.OmL樣品I、I. OmL樣品2、0. 5mL樣品3和O. 5mL樣品4各兩份作為平行樣，將樣品礦化后以4 μ g/mL的磷對照品溶液為標準測定各樣品中的磷含量；
G.計算樣品的磷含量、實驗的有效性以及待測Hib結合疫苗樣品的高分子結合物含量，計算公式如下
P1= (A1X 3)/I. OP2= (A2X3. 4)/1. OP3= (A3 X 3. 0)/0. 5
P4= (A4 X 2. 3) /0. 5- (P3 X O. 3) /3. O
試驗有效性=P1/ (P2+P3+P4) X 100%
高分子結合物含量=P4/(P2+P3+P4) X 100%
其中，P2、P3和P4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4的磷含量(μ g/mL) 、A2> A3和A4分別表不樣品I、樣品2、樣品3和樣品4礦化后的憐含量(μ g)。Hib結合疫苗由純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖通過己二酰肼與破傷風類毒素共價結合制成。本發明的優點在于具有很好的重復性和重現性，且操作簡便，實驗周期短，能夠簡單、快速、準確地檢測Hib結合疫苗中高分子結合物的含量。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，本發明的保護范圍不限于以下所述。實施例I
測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它包括以下步驟
A.取多糖含量為20μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,作為樣品I ;
B.取多糖含量為20μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,并配置1%脫氧膽酸鈉溶液200 μ L，將兩種溶液混合并冰浴30min，制備得到混合液；
C.向混合液中加入O.lmol/L鹽酸溶液200 μ L，攪拌混合均勻后，于溫度4°C轉速6000rpm條件下離心30min,收集上清液作為樣品2 ；
D.取步驟C中所得沉淀，加入50%乙醇I.OmL放置lh，再加入50%乙醇2. OmL放置lh，于6°C轉速7500rpm條件下離心lh，取2. 7mL上清液作為樣品3 ；
E.取步驟D中所得沉淀，加入O.5mol/L的氫氧化鈉溶液O. 5mL,放置lh，再加入I. 5mL的水，作為樣品4 ；
F.分別量取I.OmL樣品I、I. OmL樣品2、0. 5mL樣品3和O. 5mL樣品4各兩份作為平行樣，將樣品礦化后以4μ g/mL的磷對照品溶液為標準測定各樣品中的磷含量，含量分別為 A1=L 928 μ g, A2=O. 019 μ g, A3=O. 048 μ g, A4=L 238 μ g ；
G.計算樣品的磷含量、實驗的有效性以及待測Hib結合疫苗樣品的高分子結合物含量，計算公式如下
P1= (A1X 3)/I. 0=5. 784
P2= (A2X3. 4)/1. 0=0. 065
P3= (A3 X 3. 0)/0. 5=0. 288
P4= (A4 X 2. 3) /0. 5- (P3 X O. 3) /3. 0=5. 666
試驗有效性=P1/ (P2+P3+P4) X 100%=96. 10%
高分子結合物含量=P4/(P2+P3+P4) X 100%=94. 14%
其中，Pp P2、P3和P4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4的磷含量(μ g/mL)。Hib結合疫苗由純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖通過己二酰肼與破傷風類毒素共價結合制成。實施例2 、測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它包括以下步驟
A.取多糖含量為22μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,作為樣品I ;
B.取多糖含量為22μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,并配置1%脫氧膽酸鈉溶液200 μ L，將兩種溶液混合并冰浴30min，制備得到混合液；
C.向混合液中加入O.lmol/L鹽酸溶液200 μ L，攪拌混合均勻后，于溫度4°C轉速6200rpm條件下離心30min,收集上清液作為樣品2 ；
D.取步驟C中所得沉淀，加入50%乙醇I.OmL放置I. 5h，再加入50%乙醇2. OmL放置I. 5h，于6°C轉速7700rpm條件下離心lh，取2. 7mL上清液作為樣品3 ；
E.取步驟D中所得沉淀，加入O.5mol/L的氫氧化鈉溶液O. 5mL,放置lh，再加入I. 5mL的水，作為樣品4 ；
F.分別量取I.OmL樣品I、I. OmL樣品2、0. 5mL樣品3和O. 5mL樣品4各兩份作為平行樣，將樣品礦化后以4μ g/mL的磷對照品溶液為標準測定各樣品中的磷含量，含量分別為 A1=L 899 μ g, A2=O. 010 μ g, A3=O. 053 μ g, A4=L 144 μ g ；
G.計算樣品的磷含量、實驗的有效性以及待測Hib結合疫苗樣品的高分子結合物含量，計算公式如下
P1= (A1X 3)/I. 0=5. 697
P2= (A2X3. 4)/1. 0=0. 034
P3= (A3 X 3. 0)/0. 5=0. 318
P4= (A4X2. 3)/0. 5-(P3XO. 3)/3. 0=5. 231
試驗有效性=P1/ (P2+P3+P4) X 100%=102. 04%
高分子結合物含量=P4/(P2+P3+P4) X 100%=93. 70%
其中，Pp P2、P3和P4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4的磷含量(μ g/mL)。Hib結合疫苗由純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖通過己二酰肼與破傷風類毒素共價結合制成。實施例3
測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它包括以下步驟
A.取多糖含量為24μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,作為樣品I ;
B.取多糖含量為24μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,并配置1%脫氧膽酸鈉溶液200 μ L，將兩種溶液混合并冰浴30min，制備得到混合液；
C.向混合液中加入O.lmol/L鹽酸溶液200 μ L，攪拌混合均勻后，于溫度4°C轉速6400rpm條件下離心30min,收集上清液作為樣品2 ；
D.取步驟C中所得沉淀，加入50%乙醇I.OmL放置I. 6h，再加入50%乙醇2. OmL放置I. 6h，于6°C轉速7900rpm條件下離心lh，取2. 7mL上清液作為樣品3 ；
E.取步驟D中所得沉淀，加入O.5mol/L的氫氧化鈉溶液O. 5mL,放置lh，再加入I. 5mL的水，作為樣品4 ；
F.分別量取I.OmL樣品I、I. OmL樣品2、0. 5mL樣品3和O. 5mL樣品4各兩份作為平行樣，將樣品礦化后以4μ g/mL的磷對照品溶液為標準測定各樣品中的磷含量，含量分別為 A1=L 716 μ g, A2=O. 029 μ g, A3=O. 005 μ g, A4=L 130 μ g ；
G.計算樣品的磷含量、實驗的有效性以及待測Hib結合疫苗樣品的高分子結合物含量，計算公式如下
P1= (A1X 3)/I. 0=5. 148
P2= (A2X3. 4)/1. 0=0. 099
P3= (A3 X 3. 0)/0. 5=0. 030
P4= (A4 X 2. 3)/0. 5-(P3 X O. 3)/3. 0=5. 195
試驗有效性=P1/ (P2+P3+P4) X 100%=96. 69%
高分子結合物含量=P4/(P2+P3+P4) X 100%=97. 58%
其中，Pp P2、P3和P4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4的磷含量(μ g/mL)。Hib結合疫苗由純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖通過己二酰肼與破傷風類毒素共價結合制成。實施例4
測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它包括以下步驟
A.取多糖含量為26μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,作為樣品I ;
B.取多糖含量為26μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,并配置1%脫氧膽酸鈉溶液200 μ L，將兩種溶液混合并冰浴30min，制備得到混合液；
C.向混合液中加入O.lmol/L鹽酸溶液200 μ L，攪拌混合均勻后，于溫度4°C轉速6600rpm條件下離心30min,收集上清液作為樣品2 ；
D.取步驟C中所得沉淀，加入50%乙醇I.OmL放置I. 8h，再加入50%乙醇2. OmL放置
I.8h，于6°C轉速8200rpm條件下離心lh，取2. 7mL上清液作為樣品3 ；
E.取步驟D中所得沉淀，加入O.5mol/L的氫氧化鈉溶液O. 5mL,放置lh，再加入I. 5mL的水，作為樣品4 ；
F.分別量取I.OmL樣品I、I. OmL樣品2、0. 5mL樣品3和O. 5mL樣品4各兩份作為平行樣，將樣品礦化后以4 μ g/mL的磷對照品溶液為標準測定各樣品中的磷含量，含量分別為 A1=2. 154 μ g, A2=O. 005 μ g, A3=O. 019 μ g, A4=L 341 μ g ；
G.計算樣品的磷含量、實驗的有效性以及待測Hib結合疫苗樣品的高分子結合物含量，計算公式如下
P1= (A1X 3)/I. 0=6. 462
P2= (A2X3. 4)/1. 0=0. 017
P3= (A3 X 3. 0)/0. 5=0. 114
P4= (A4 X 2. 3)/0. 5-(P3 X O. 3)/3. 0=6. 157
試驗有效性=P1/ (P2+P3+P4) X 100%=102. 77%
高分子結合物含量=P4/(P2+P3+P4) X 100%=97. 92%
其中，Pp P2、P3和P4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4的磷含量(μ g/mL)。Hib結合疫苗由純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖通過己二酰肼與破傷風類毒素共價結合制成。實施例5
測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它包括以下步驟
A.取多糖含量為30μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,作為樣品I ;
B.取多糖含量為30μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,并配置1%脫氧膽酸鈉溶液200 μ L，將兩種溶液混合并冰浴30min，制備得到混合液；
C.向混合液中加入O.lmol/L鹽酸溶液200 μ L，攪拌混合均勻后，于溫度4°C轉速7500rpm條件下離心30min,收集上清液作為樣品2 ；
D.取步驟C中所得沉淀，加入50%乙醇I.OmL放置2h，再加入50%乙醇2. OmL放置2h，于6°C轉速8500rpm條件下離心lh，取2. 7mL上清液作為樣品3 ；
E.取步驟D中所得沉淀，加入O.5mol/L的氫氧化鈉溶液O. 5mL,放置lh，再加入I. 5mL的水，作為樣品4 ；
F.分別量取I.OmL樣品I、I. OmL樣品2、0. 5mL樣品3和O. 5mL樣品4各兩份作為平行樣，將樣品礦化后以4 μ g/mL的磷對照品溶液為標準測定各樣品中的磷含量，含量分別為 A1=L 907 μ g, A2=O. 027 μ g, A3=O. 051 μ g, A4=L 214 μ g ；
G.計算樣品的磷含量、實驗的有效性以及待測Hib結合疫苗樣品的高分子結合物含 量，計算公式如下
P1= (A1X 3)/I. 0=5. 721
P2= (A2X3. 4)/1. 0=0. 092
P3= (A3 X 3. 0)/0. 5=0. 306
P4= (A4 X 2. 3)/0. 5-(P3 X O. 3)/3. 0=5. 554
試驗有效性=P1/ (P2+P3+P4) X 100%=96. 12%
高分子結合物含量=P4/(P2+P3+P4) X 100%=93. 31%
其中，Pp P2、P3和P4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4的磷含量(μ g/mL)。Hib結合疫苗由純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖通過己二酰肼與破傷風類毒素共價結合制成。通過以上實施例可以看出，試驗有效性在95% 105%之間，可以認為本方法可以用于測定b型流感嗜血桿菌結合疫苗中高分子結合物含量。
權利要求
1.測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，其特征在于，它包括以下步驟 A.取多糖含量為20 30μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,作為樣品I ; B.取多糖含量為20 30μ g/mL的待測Hib結合疫苗樣品3. OmL,并配置1%脫氧膽酸鈉溶液200 μ L，將兩種溶液混合并冰浴30min，制備得到混合液； C.向混合液中加入O.lmol/L鹽酸溶液200 μ L，攪拌混合均勻后，于溫度4°C轉速600(T7000rpm條件下離心30min,收集上清液作為樣品2 ； D.取步驟C中所得沉淀，加入50%こ醇I.OmL放置I 2h，再加入50%こ醇2. OmL放置I 2h，于6°C轉速750(T8500rpm條件下離心lh，取2. 7mL上清液作為樣品3 ； E.取步驟D中所得沉淀，加入O.5mol/L的氫氧化鈉溶液O. 5mL,放置lh，再加入I. 5mL的水，作為樣品4 ； F.分別量取I.OmL樣品I、I. OmL樣品2、0. 5mL樣品3和O. 5mL樣品4各兩份作為平行樣，將樣品礦化后以4 μ g/mL的磷對照品溶液為標準測定各樣品中的磷含量； G.計算樣品的磷含量、實驗的有效性以及待測Hib結合疫苗樣品的高分子結合物含量，計算公式如下 P1= (A1X 3)/I. O P2= (A2X3. 4)/1. O P3= (A3 X 3. 0)/0. 5 P4= (A4 X 2. 3) /0. 5- (P3 X O. 3) /3. O 試驗有效性=P1/ (P2+P3+P4) X 100% 高分子結合物含量=P/(P2+P3+P4) X 100% P1^ P2> P3和P4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4的磷含量(μ g/mL)ム、A2, A3和A4分別表示樣品I、樣品2、樣品3和樣品4礦化后的磷含量(μ g)。
2.根據權利要求I所述的測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，其特征在于所述的Hib結合疫苗由純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖通過己ニ酰肼與破傷風類毒素共價結合制成。
全文摘要
本發明公開了一種測定Hib結合疫苗中高分子結合物含量的方法，它通過脫氧膽酸鈉在酸性條件下形成膠團并吸附沉淀蛋白質的特性，使結合態多糖與游離態多糖分離，再通過50%乙醇水溶液溶解出低分子結合物，以實現對高分子結合物的分離測定。
文檔編號G01N33/15GK102735809SQ20121022124
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者張祥, 朱琳, 羅芹, 趙丹, 趙濤, 韓煉 申請人:成都歐林生物科技股份有限公司