專利名稱：一種快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法
技術領域：
本發明涉及乳酸菌發酵產物檢測領域，特別涉及一種快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法。
背景技術：
目前對乳酸菌發酵液中有機酸種類和產量的測定還沒有統一的標準。故建立一種快速測定乳酸菌產有機酸產量的方法具有重要的意義。乳酸菌的培養基中一般以糖類物質作為碳源，在細菌生長代謝過程中會將培養基中的碳 源物質分解成為甲酸、乙酸、丙酸、乳酸等有機酸，測定這些有機酸的成分、含量及其在發酵過程中的變化，對了解乳酸菌的代謝特性和發酵過程中代謝產物的監控都是非常有用的。目前，有機酸的檢測方法主要有分光光度法、酶法、薄層色譜法、氣相色譜法、離子色譜法和液相色譜法。分光光度法是以有機酸和一些特定物質反應能生成有色物質為機理測定有機酸含量，該法易受干擾，通常需要將提取液進行沉淀、離子交換樹脂等前處理，步驟繁冗。酶法雖然特異性較強，能夠測定有機酸的構型，但是每次只能測定一種有機酸，比較耗時。氣相色譜法不僅需要通過液液萃取將有機酸萃取到有機相中，還需進行柱前衍生化以提高其揮發性，且常因為衍生化反應不易定量而直接影響測定結果的準確性。離子色譜法雖然對于樣品預處理的要求比較簡單，但高濃度的無機離子可能會干擾有機酸根離子的測定。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法。本發明的快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法，包括分別制備樣品溶液和標準品溶液，用反相HPLC梯度洗脫法測定乳酸菌發酵產物中有機酸的種類和含量，其中，流動相A液為甲醇，流動相B液為0. OlM的磷酸二氫鈉水溶液，(T9. 5min為100%B液，9. 5 IOmin A 液升至 55%，B 液降至 45%，l(Tl3min 保持 55%A 液，45%B 液，13 15min A 液降至 45%，B 液升至 55%，15 25min 保持 55%A 液，45%B 液，25 28min B 液升至 100%，28 30min保持100%B液。其中，所述的反相HPLC的色譜條件為色譜柱為C18柱，250mmX4. 6mm，5iim，采用低壓梯度洗脫，檢測波長為215nm，柱溫3(T40°C，采樣時間為30min。優選地，所述的柱溫為35。。。其中，所述的樣品溶液制備方法為取乳酸菌發酵液lmL，加入體積分數50%的硫酸200 V- L, 10000r/min離心5min,取上清液100 u L稀釋至500 u L,經0. 45 u m濾膜過濾。其中，所述的標準品溶液制備方法為分別取有機酸標準品，加入水配成50mg/mL> lOOmg/mL或150mg/mL母液備用，使用時混合并稀釋至所需濃度,經0. 45 y m濾膜過濾。所述的標準品為酒石酸、氨基丁酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸、丁酸。其中，梯度洗脫流速0 IOmin 為 0. 7mL/min, 10 30min 為 lmL/min。
其中，所述的0. OlM磷酸二氫鈉水溶液pH值為2. 8^3. O。其中，進樣量為IOii L。本發明采用反相HPLC低壓梯度洗脫測得乳酸菌發酵產有機酸種類和含量，可以做到7種有機酸基線分離、峰形良好。本發明方法簡便、迅速，靈敏度高，重現性好。
圖I為7種有機酸混合標準品色譜圖。圖2為干酪乳桿菌發酵液色譜圖。 圖3為植物乳桿菌發酵液色譜圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I標準品的HPLCI.儀器與樣品LC-20A (日本島津)高效液相色譜儀，BT25S型電子天平(d=0. Olmg賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，KQ5200B型超聲清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；色譜甲醇(Fisher Scientific),水(18. 2MQ cm Millipore Rios 系列),其他試劑均為分析純。乳酸菌發酵產有機酸標準品為酒石酸、氨基丁酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸、丁酸(Sigma 試劑)。2.方法與結果2. I標準品溶液的制備分別取有機酸標準品，加入超純水配成100mg/mL或50mg/mL、150mg/mL母液備用，使用時混合并稀釋至所需濃度，經0. 45 y m濾膜過濾后分析。2. 2色譜條件與系統適用性試驗色譜條件為色譜柱為C18 柱(250_X4. 6mm, 5 ii m, GLSciences Inc.),流動相為甲醇-0. OlM的磷酸二氫鈉水溶液，其中流動相A液為甲醇，流動相B液為0. OlM的磷酸二氫鈉水溶液(濃磷酸調節PH值為2. 8^3. 0)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，檢測波長為215nm,柱溫35°C,進樣量為IOy L,記錄時間為30min。在上述色譜條件下,標準品混合色譜圖見圖I。從圖I中可以看出，在本試驗條件下可以做到7種有機酸基線分離且峰形良好。表I梯度洗脫程序時間程序流速流動相i組成 0~9.5min 0.7 inL/min 100% B 9.5 I Omin 0.7 mL/min 55% A+45% B IO^ Bmin I mL/min 55% A+45% B13-15min I mL/min 45% A+55% B 15~25min I mL/min 45% A+55% B 25~28min I mL/min 100% B 28~30minI mL/min_100% B_
實施例2樣品的HPLC分離乳酸菌為干酪乳桿菌和植物乳桿菌。分別取干酪乳桿菌和植物乳桿菌的發酵液lmL，加入50%硫酸200 u L，10000r/min離心5min,取上清液100 V- L稀釋至500 u L,經0. 45 y m濾膜過濾后分析。將制備好的樣品放入自動進樣器的樣品架上，每個樣品重復3次進樣、每次進樣IOuL, HPLC的色譜條件以及洗脫程序與實施例I相同。干酪乳桿菌和植物乳桿菌的色譜圖分別如圖2和圖3所示。從圖2、圖3中可以看出，在本試驗條件下可以做到發酵液產有機酸基線分離且峰形良好，且重復性好。進樣后根據峰面積用標準曲線法計算樣品中有機酸含量，取其平均值為平均百分含量，結果見表2。由表2可以看出，在本實施例中的2種發酵液樣品中檢測到3種有機酸的含量。表2乳酸菌發酵液中各有機酸含量單位:mg/mL
權利要求
1.一種快速測定乳酸菌發酵產有機酸種類和產量的方法，包括分別制備樣品溶液和標準品溶液，用反相HPLC梯度洗脫法測定乳酸菌發酵產物中有機酸的種類和含量，其特征在于，流動相A液為甲醇，流動相B液為0. OlM的磷酸二氫鈉水溶液，(T9. 5min為100%B液，9.5 IOmin A 液升至 55%，B 液降至 45%，l(Tl3min 保持 55%A 液，45%B 液，13 15min A 液降至 45%，B 液升至 55%，15 25min 保持 55%A 液，45%B 液，25 28min B 液升至 100%，28 30min保持100%B液。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的反相HPLC的色譜條件為色譜柱為C18柱，250mmX4. 6mm, 5 u m,采用低壓梯度洗脫，檢測波長為215nm，柱溫3(T40°C，采樣時間為30min。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的柱溫為35°C。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的樣品溶液制備方法為取乳酸菌發酵液ImL,加入體積分數50%的硫酸200 u L, 10000r/min離心5min,取上清液100 u L稀釋至500 u L,經0. 45 u m濾膜過濾。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的標準品溶液制備方法為分別取有機酸標準品，加入水配成50mg/mL、lOOmg/mL或150mg/mL母液備用，使用時混合并稀釋至所需濃度，經0. 45 ii m濾膜過濾。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，梯度洗脫流速(TlOmin為0.7mL/min,10 30min 為 lmL/min。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的0.OlM磷酸二氫鈉水溶液pH值為2.8 3. O。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，進樣量為10yL。
全文摘要
本發明公開了一種快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法，包括分別制備樣品溶液和標準品溶液，用反相HPLC梯度洗脫法測定乳酸菌發酵產物中有機酸的種類和含量，其中，流動相A液為甲醇，流動相B液為0.01M的磷酸二氫鈉水溶液，0~9.5min為100%B液，9.5~10minA液升至55%，B液降至45%，10~13min保持55%A液，45%B液，13~15minA液降至45%，B液升至55%，15~25min保持55%A液，45%B液，25~28min B液升至100%，28~30min保持100%B液。本發明采用反相HPLC低壓梯度洗脫測得乳酸菌發酵產有機酸種類和含量，可以做到7種有機酸基線分離、峰形良好。本發明方法簡便、迅速，靈敏度高，重現性好。
文檔編號G01N30/89GK102721781SQ20121021672
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月27日 優先權日2012年6月27日
發明者劉媛媛, 張軍, 汪攀, 王安如 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 吉林大北農農牧科技有限責任公司, 漳州大北農農牧科技有限公司