專利名稱：醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及免疫分析醫學領域，具體的涉及醛固酮(ALD)化學發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
高血壓(Hypertension)是ー種世界性的常見疾病，世界各地的患病率高達109Γ20%，并可導致腦血管、心臟、腎臟的病變，是危害人類健康的主要疾病。據衛生部最新數據，我國現有高血壓患者2億多人，隨著經濟發展，人民生活水平的提高，高血壓已日益成為ー個重要的公共衛生問題。醛固酮(aldosterone，ALD)是腎上腺皮質激素的ー種，具有代表性的強電解質代 謝作用的鹽皮質類固醇。其作用是保鈉排鉀(増加Na+和Cl—的回放，排出K+和H+)、維持電解質平衡與體液容量恒定。ALD是由腎上腺皮質球狀帶生成，并受腎臟分泌的血管緊張肽原酶，即血管緊張素的調節。醛固酮是人體內調節血容量的激素，通過調節腎臟對鈉的重吸收，維持水平衡。醛固酮是調節細胞外液容量和電解質的激素，醛固酮的分泌，是通過腎素-血管緊張素系統實現的。當細胞外液容量下降時，刺激腎小球旁細胞分泌腎素，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統，醛固酮分泌増加，使腎臟重吸收鈉增加，進而引起水重吸收增加，細胞外液容量增多；相反，細胞外液容量增多時，通過上述相反的機制，使醛固酮分泌減少，腎重吸收鈉水減少，細胞外液容量下降。血鈉降低，血鉀升高同樣刺激腎上腺皮質，使醛固酮分泌増加。血漿中ALD水平的檢測，對于原發性醛固酮增多癥的診斷和療效觀察、Addisons病(阿狄森氏病又稱原發性慢性腎上腺皮質機能減退癥)的診斷及腎上腺皮質增生、繼發性醛固酮增多癥等的鑒別診斷有臨床價值。目前臨床上常用的測定醛固酮(ALD)的方法是放射免疫分析技術(RIA)和酶聯免疫分析法(ELISA)，但是這兩種方法存在諸多不足，例如RIA存在放射性污染、標記物半衰期短、對操作者具有放射性損傷，且操作繁瑣，時間長等缺點；而ELISA靈敏度低，檢測范圍窄；隨著標記免疫技術的迅速發展，各種新的檢測方法層出不窮，例如時間分辨免疫分析法、免疫熒光法、化學發光法等。其中，化學發光免疫分析(CLIA)是將化學發光和酶免疫分析結合在此技術上發展起來的，起步于80年代初，在90年代得到了快速發展和應用，是當今最為敏感的微量免疫測定法，具有靈敏度高(檢測極限10_17 10_19)、可測定物質濃度范圍寬、試劑有效期長、操作簡單快速、穩定性好、安全無環境污染等優點，目前已廣泛應用到基礎和臨床醫學的各個領域，成為取代RIA和ELISA的首選技術。但目前使用的化學發光免疫分析(CLIA)測定醛固酮(ALD)的靈敏度普遍低，而且測定范圍較窄。
發明內容
本發明要解決的問題是提供ー種醛固酮(ALD)化學發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法，解決了靈敏度低，檢測范圍窄的缺陷。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒,包含ALD抗體包被板；ALD酶結合物；ALD 校準品；ALD 質控品；發光液A和發光液B;20倍濃縮洗液。其中，所述的ALD抗體包被板的固相載體為96孔或48孔的白色微孔板；所述的 ALD酶結合物使用的酶是辣根過氧化物酶。所述的ALD質控品包括低值質控品(QcL)和高值質控品(QcH)，其中低值質控品的濃度范圍是124. 93 187. 39pg/mL，高值質控品的濃度范圍是1640. 33 2460. 50pg/mL。所述的發光液A包含O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對碘酚；發光液B包含O. 675g/L過氧化脲；所述的20倍濃縮洗液包含75. 5g/L Tris, 120g/LNaCl,5mL/L Tween-20,lg/L Proclin300。本發明還提供了上述試劑盒的制備方法，包含以下步驟I) ALD抗體包被板制備；包被板制備包括以下步驟a將ALD抗體用O. 02M pH7. 4磷酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL，加入到固相載體中，2 8°C包被20 24小時；b棄去孔內液體，用pH7. 4PBS-T緩沖液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，2 8°C封閉20 24小時；c棄去孔內液體，甩干后于30 37°C烘干16 30小時；d裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封ロ，貼標簽，儲存于2 8°C。2)用辣根過氧化物酶標記ALD，得ALD酶結合物；ALD酶結合物的制備包括以下步驟a將O-(羧甲基)羥胺和ALD溶解在こ醇中，使其濃度分別為5m mo I/L和2mmol/L，在沸水浴中反應90min ；b濃縮后，加入40mL 7jC,用こ醚抽提，抽提物用Na2S04干燥，將其溶于O. 01mol/L的氫氧化鈉溶液中，得II液；c將EDC溶解在pH8. O的PBS緩沖液中，得I液；d將HRP溶于PH7. 4的PBS緩沖液中，得III液；e將II液與III液混合，然后逐滴加入I液，在4°C攪拌16小時，用O. OlMPBS使之充分透析。3)配制不同濃度的ALD校準品將ALD用校準品稀釋液稀釋成不同濃度的校準品，濃度分別為 0,40,120, 360,1000, 3000pg/mL ；4)質控品的配制在正常人血清中加入適量的ALD純品，配制低值質控品(QcL)和高值質控品(QcH)，其濃度的平均值分別為156. 16pg/mL和2050. 41pg/mL。5)配制發光液A，發光液B ；6)配制20倍濃縮洗液；
7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C ；8)對采用該方法制得的試劑盒進行物理檢查，并對準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質控品的測定值和穩定性進行測定。辣根過氧化物酶(HRP)純度要求RZ彡3. O,活性彡250U/mL。根據本發明的方法，ALD抗體包被板是包被含有ALD抗體的96孔或48孔的白色微孔板；所述的ALD酶結合物使用的酶是辣根過氧化物酶；所述的發光液A包含魯米諾和對碘酚，發光液B包含過氧化服。本發明方法制備的試劑盒采用如下具體形式，其包含ALD抗體包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根過氧化物酶標記的ALD、不同濃度的ALD校準品、發光液A液為魯米諾和對碘酚、發光液B液為過氧化脲、20倍濃縮洗液為配方為75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl, 5mL/L Tween-20,lg/LProclin300oProClin300以其廣譜活性、優越的兼容性和穩定性及其在使用濃度下的低毒性，ProClin300成為用于診斷試劑的理想高效防腐劑。Proclin300防腐劑可在更長的時間內根除細菌、真菌及酵母，從而延長產品的儲存時間。其水溶性確保其可輕易溶入所需試劑中。特別是，ProClin300防腐對大多數的酶或抗體交聯反應的功能無影響，所以不會干擾檢驗指示劑。本發明的醛固酮(ALD)定量檢測試劑盒，采用目前最為敏感的免疫測定方法——化學發光免疫分析技木，醛固酮(ALD)定量檢測試劑盒(化學發光法)采用競爭法檢測人血清、血漿中的醛固酮含量。樣本加到固相含有ALD抗體的白色不透明的板條微孔中，再加入ALD-辣根過氧化物酶(HRP)結合物，此酶結合物與樣本中的ALD競爭結合固相ALD抗體。洗掉游離成分。加入底物工作液，在氧化劑作用下，HRP催化魯米諾生成處于激發態的氨基鄰苯ニ甲酸離子，其恢復到基態時，釋放出425nm的光子，于第5_15分鐘測定各加樣本孔的發光值RLU。樣本的RLU與其中的ALD濃度呈負相關。樣本中的ALD濃度依據由校準品ALD濃度和對應的RLU建立的數學模型進行定量，從而檢測人血清、血漿中的ALD含量。本發明具有以下優點(I)本試劑盒利用化學發光免疫技術測定血漿樣本。操作簡便，適用于臨床常規檢測；(2)靈敏度聞，分析靈敏度不聞于15pg/mL ; (3)本廣品的特異性良好，本產品對血管緊張素I，血管緊張素II、血管緊張素I 7的交叉特異性均小于1% ；
(4)精密度良好，批內精密度不高于15%，批間精密度不高于20% ;(5)穩定性良好，經37°C加速穩定性及2 8°C真實穩定性試驗證實，本產品在37°C可存放7天以上，在2 8°C可存放I年；(6)特異性強，反應快速，可在65分鐘內判斷檢測結果，操作簡便，安全無環境污染。此外，本發明還具有檢測樣品的濃度范圍寬、試劑有效期長、穩定性好等優點。性能優于RIA、Elisa產品，達到了國際先進水平，成本較低。
圖I是本發明的博奧賽斯化學發光試劑盒測定ALD與美國貝克曼庫爾特有限公司的放免試劑盒測定ALD的測定結果比較圖，其中縱坐標為博奧賽斯測得的ALD值，橫坐標為放免試劑盒測定ALD值，兩種方法相關系數(r) =0. 9719，直線方程y=0. 9761x+6. 0824。
具體實施方式
實施例I :制備醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，包含I) ALD抗體包被的96孔白色微孔板；2 ) ALD-辣根過氧化物酶(HRP )結合物；3) ALD 校準品； 4) ALD 質控品；5)發光液A液和發光液B液，發光液A液包含魯米諾和對碘酚，發光液B液包含過氧化脲；6) 20 倍濃縮洗液的配方為 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20,1g/LProclin300, Proclin300 選自美國 sigma 公司。通過下述方法制備醛固酮(ALD)化學發光免疫定量檢測試劑盒I)包被將ALD抗體用O. 02M磷酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL，加入到96孔白色微孔板中，2 8°C包被20 24小時；棄去孔內液體，用pH7. 4PBS-T緩沖液洗板，然后加入含O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，2 8°C封閉20 24小時；棄去孔內液體，甩干后于30 37°C烘干16 30小時；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封ロ，貼標簽，儲存于2 8で。2) ALD酶結合物的制備步驟如下a將0-(羧甲基)羥胺和ALD溶解在こ醇中，使其濃度分別為5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反應90min ；b濃縮后，加入40mL水，用こ醚抽提，抽提物用Na2SO4干燥，將其溶于O. Olmol/L的氫氧化鈉溶液中，得II液；c將EDC溶解在pH8. O的PBS緩沖液中，得I液；d將HRP溶于PH7. 4的PBS緩沖液中，得III液；e將II液與III液混合，然后逐滴加入I液，在4°C攪拌16小時，用O. OlMPBS使之充分透析。3)配制不同濃度的ALD校準品將ALD用校準品稀釋液稀釋成不同濃度的校準品，濃度分別為 0,40,120, 360,1000, 3000pg/mL ；4)質控品的配制在正常人血清中加入適量的ALD純品，配制低值質控品(QcL)和高值質控品(QcH)，其濃度的平均值分別為156. 16pg/mL和2050. 41pg/mL。5)配制發光液A液和B液發光液A液包含O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對碘酹，緩沖液為5mmol/LTriS · HCl(pH8. 6) ；B液包含O. 675g/L過氧化脲，用エ藝用水配制6)配制20倍濃縮洗液按照下述配方配制濃縮洗液，75.5g/L Tris, 120g/L NaCl, 5mL/LTween-20, lg/LProclin300o7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C ;其中包含發光液A、發光液B、20倍濃縮洗液、ALD酶結合物各I瓶，ALD抗體包被板I塊，ALD校準品6瓶、ALD質控品2瓶。8)對采用該方法制得的試劑盒進行物理檢查，并對準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質控品的測定值和穩定性進行測定。
說明(I)物理檢查在外觀上液體組分應澄清，無沉淀或絮狀物；其他組分應無包裝破損。(2)準確性試劑盒校準品與企業標準品系列同時進行分析測定，用Log(X)-Logit(Y)數學模型擬合，要求兩條劑量-反應曲線不顯著偏離平行(t檢驗，
11〈2. 447)；以企業標準品為對照品，用Log(X) -Logit (Y)數學模型擬合，試劑盒校準品的實測值與標示值比值的平均值應在O. 90 I. 10范圍內。企業校準品的配制方法如下將高純度的醛固酮(ALD)用稀釋液(含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液)稀釋為系列梯度，其濃度分別為40、120、360、1000、3000pg/mL，并以不含ALD的稀釋液作為零值對照。
(3)劑量-反應曲線的線性用Log⑴-Logit⑴數學模型擬合，劑量-反應曲線在O 3000pg/mL濃度范圍內相關系數r絕對值不低于O. 9900。(4)分析靈敏度試劑盒分析靈敏度不高于15pg/mL。(5)精密度批內不精密度(CV%)應不高于15. 0% ;批間不精密度(CV%)應不高于20. 0%。(6)質控品測定值平行測定10孔高值和低值的質控品，用Log (X)-Logit (Y)數學模型擬合，質控品測值應在允許范圍內，QcL和QcH的允許范圍分別為124. 92 187. 39pg/mL和 1640. 33 2460. 50pg/mL。(7)特異性交叉反應應符合下表要求。
權利要求
1.醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含 ALD抗體包被板； ALD酶結合物； ALD校準品； ALD質控品； 發光液A液和B液； 20倍濃縮洗液。
2.根據權利要求I所述的醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的ALD抗體包被板是包被含有ALD抗體的96孔或48孔的白色微孔板。
3.根據權利要求I所述的醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的ALD抗原酶結合物使用的酶是辣根過氧化物酶，要求純度RZ ^ 3. 0，活性> 250U/mL。
4.根據權利要求I所述的醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于ALD質控品包括低值質控品和高值質控品，其中低值質控品的濃度范圍是124. 93 187. 39pg/mL,高值質控品的濃度范圍是1640. 33 2460. 50pg/mL。
5.根據權利要求I所述的醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的發光液A包含O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對碘酚；發光液B包含O. 675g/L過氧化脲。
6.根據權利要求I所述的醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的20 倍濃縮洗液包含 75. 5g/LTris, 120g/LNaCl, 5mL/LTween-20, lg/LProclin300。
7.一種制備所述權利要求I的試劑盒的方法，其特征在于包含以下步驟 1)ALD抗體包被板制備； 2)ALD酶結合物的制備； 3)配制不同濃度的ALD校準品； 4)ALD質控品的配制； 5)配制發光液A液和B液； 6)配制20倍濃縮洗液； 7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C; 8)對采用該方法制得的試劑盒進行物理檢查，對其準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質控品的測定值和穩定性進行測定。
8.根據權利要求7所述的試劑盒的制備方法，其特征在于包被板的制備包含如下步驟 a將ALD抗體用O. 02mol/L pH7. 4磷酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL,加入到固相載體中，2 8°C包被20 24小時； b棄去孔內液體，用pH7. 4PBS-T緩沖液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，2 8°C封閉20 24小時； c棄去孔內液體，甩干后于30 37°C烘干16 30小時； d裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標簽，儲存于2 8°C。
9.根據權利要求I所述的醛固酮化學發光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于所述的ALD酶結合物的制備步驟如下 a將0-(羧甲基)羥胺和ALD溶解在乙醇中，使其濃度分別為5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反應90min ； b濃縮后，加入40mL 7jC,用乙醚抽提，抽提物用Na2SO4干燥，將其溶于O. 01mol/L的氫氧化鈉溶液中，得II液； c將EDC溶解在pH8. O的PBS緩沖液中，得I液； d將HRP溶于PH7. 4的PBS緩沖液中，得III液； e將II液與III液混合，然后逐滴加入I液，在4°C攪拌16小時，用O. OlMPBS使之充分透析。
10.根據權利要求7或8所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的ALD抗體包被板是包被含有ALD抗體的96孔或48孔的白色微孔板。
全文摘要
本發明公開了一種醛固酮ALD化學發光免疫定量檢測試劑盒，本發明試劑盒包含ALD抗體包被板、ALD酶結合物、ALD校準品、ALD質控品、發光液A液和B液、20倍濃縮洗液。制備本發明試劑盒包含以下步驟1)ALD抗體包被板的制備；2)ALD酶結合物的制備；3)配制不同濃度的ALD校準品；4)ALD質控品的制備；5)配制發光液A液和B液；6)配制20倍濃縮洗液；7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2～8℃；8)對采用該方法制得的試劑盒進行物理檢查，并對準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質控品的測定值和穩定性進行測定。本發明試劑盒與現有試劑盒相比操作簡單，靈敏度高，特異性好。
文檔編號G01N21/76GK102735679SQ20121021282
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月26日 優先權日2012年6月26日
發明者劉萍, 宋啟超, 張影, 范利花 申請人:博奧賽斯(天津)生物科技有限公司