專利名稱：基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的甲基對硫磷電化學生物傳感器的制作方法
技術領域：
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本發明涉及利用電化學傳感器對甲基對硫磷進行檢測，特點在于磺酸基功能化的石墨烯的應用，以及該檢測方法的超靈敏及易操作性。
背景技術：
甲基對硫磷是一種高毒有機磷酸酯類殺蟲劑，具有廣譜。高效。量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等優點，曾被廣泛應用于農業成產，對多種農作物上的多種害蟲的防治起了重要作用。但其殘留不僅對生態環境造成嚴重的污染與危害，而且還可以通過食物鏈作用在人體積累，引發各種疾病，危及人類健康。因此在很多國家已經被禁用，但在農產品的進出口貿易、環境安全和食品的監督檢測中，甲基對硫磷等一類高毒化合物仍然是常規檢測的重要污染物。為此，迫切需要加強甲基對硫磷農藥的檢測方法、檢測器件的研究，建立快速、可靠、靈敏和實用的甲基對硫磷農藥檢測的分析方法，對保障食品安全、保護生態環境，維護人類身體健康有著重要的現實意義。目前，有關甲基對硫磷的測定方法主要有色譜法。色譜與質譜聯用法、免疫測定法及電化學分析法。傳統的甲基對硫磷檢測方法色譜法與色-質聯用法，盡管靈敏、準確，但是需要對樣品進行繁瑣的預處理、費時、成本高，而且所需儀器大都昂貴且龐大笨重，需要專業技術人員維護，不適用于現場檢測。帶有硝基芳香環的有機磷農藥如甲基對硫磷、甲基對氧磷和樂果在電極表面展示出了良好的氧化還原性質；并且電化學方法因其擁有靈敏度高、穩定性好、設備成本低、所需空間小等優勢成為研究的熱點。石墨烯片是指只有一個碳原子層厚度的石墨，碳-碳間依靠共價鍵連接而形成蜂窩狀結構。由于石墨烯具有較大的表面積、優良的導熱和導電性能以及很高的機械強度等優點，將其應用于電化學檢測已成為研究的熱點。并且石墨烯對磷族化合物具有較強的吸附能力，芳香族有機磷農藥可以較好地吸附在石墨烯上；同時石墨烯褶皺的表面有利于生物分子以及一些靶物質組裝上。然后單層石墨烯之間存在很強的范德華力(5.9kJ moF1)進而容易重新聚集為石墨狀態，所以要想利用石墨烯優良的性能要解決這個問題。
發明內容
本發明將新型材料石墨烯應用于甲基對硫磷的檢測，以解決上述技術問題。基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的電化學酶傳感器檢測甲基對硫磷的方法將磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖修飾到裸玻碳電極表面，通過吸附作用將酶固定到電極表面，組成酶傳感器。當檢測環境中存在目標分析物甲基對硫磷時，目標物同固定在電極表面的乙酰膽堿酯酶發生不可逆的磷酸化反應，抑制了乙酰膽堿酯酶的活性，進而使得固定酶同底物氯化乙酰膽堿反應產生的電活性物質巰基乙酰膽堿量減少，響應電流也隨之減弱，以此現象對甲基對硫磷標準品進行檢測，建立標準曲線，以達到對含有甲基對硫磷樣品進行定量檢測的目的。步驟為
(I)磺酸基功能化石墨烯的制備在冰浴的條件下，將2g的石墨片和I. 6g的硝酸鈉添加到67. 5mL98%的H2SO4中；然后在攪拌中加入9g KMn04 :將混合物在35°C條件下攪拌35分鐘；之后在室溫下保持反應5天再將560mL溫水緩緩加入燒瓶，并用30%的過氧化氫溶液處理，至懸浮液變成亮黃色；最后將懸浮液進行離心，用超純水清洗后再70°C下烘干。將得到的氧化石墨烯在超純水中超聲2h，將未分散的氧化石墨烯離心除去；再取IOmL均一分散的氧化石墨烯同5mL濃度為lmg/mL的聚苯乙烯磺酸鈉進行混合,攪拌30min ;接著將O. 4mL質量分數為85%的肼溶液添加進去，將此混合液在100°C下冷凝回流4h ;之后將混合物冷卻至室溫，離心后用超純水清洗三遍以去除過量的肼和聚苯乙烯磺酸鈉；將得到的濃度為lmg/mL磺酸基功能化的石墨烯在4°C下保存。(2)裸玻碳電極的拋光與清洗裸電極依次用粒徑為I μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化鋁粉末各打磨7min，每次換不同粒徑氧化鋁粉末前都用水將打磨布和電極上殘余的粉漿沖洗干凈，之后分別用超純水、無水乙醇、超純水分別超聲5min，然后用氮氣將電極吹干。(3)裸玻碳電極的測試稱取3. 73g KCl及O. 082g K3Fe (CN)6溶于50mL容量瓶中，配成5mM Fe(CN)63_和I M KCl溶液，取5mL該溶液置于反應池中；以打磨好的電極為工作 電極，銀/氯化銀為參比電極，鉬絲為對電極組成三電極系統進行測試，工作電壓為-O. 2 O. 6V，掃速為100mV/s，直到得到峰形穩定、形狀良好、峰與峰差值小于65mV的循環伏安圖。(4)電極修飾將O. 25g殼聚糖溶于50mL2M醋酸溶液中得到O. 5%的殼聚糖溶液，用氫氧化鈉溶液調節pH至5. O。取100 μ L的殼聚糖溶液與200 μ L的石墨烯溶液混合，超聲20min得到均一混合液；用移液槍吸取5 μ L的混合液并滴涂在電極表面,用紅外燈烘干；然后用移液槍吸取4μ L酶液滴涂在修飾膜上，將電極至于25°C培養箱中30min，得到固定了酶的電極。本發明將磺酸基功能化石墨烯應用于電化學傳感器，有效的解決了石墨烯重新團聚為石墨；并且石墨烯的應用大大提高了傳感器的響應電流，起到了信號放大的作用，有效的防止了其他氧化物的干涉，提高了本發明甲基對硫磷殘留檢測的精度和靈敏度；該傳感器以玻碳電極為工作電極，銀/氯化銀為參比電極，鉬電極為對電極，以乙酰膽堿酯酶與氯化乙酰膽堿反應生成電活性的巰基乙酰膽堿為檢測信號，通過對不同濃度甲基對硫磷標準品的檢測，建立標準曲線，達到對含甲基對硫磷樣品進行定量檢測的目的，為農產品安全生產與消費提供殘留檢測的技術支撐。
圖I :基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖電化學酶傳感器檢測甲基對硫磷的實驗原理圖。圖2 :制備石墨烯材料的表征圖。a :制備的氧化石墨烯的原子力顯微鏡圖；b :制備的磺酸基功能化石墨烯的透射電鏡圖。圖3 :對甲基對硫磷檢測的相關圖。A :不同濃度農藥標準品抑制后的循環伏安曲線圖:固定酶抑制率與農藥濃度對數值的標準曲線。
具體實施例方式實施例I :
將制備好的電化學酶傳感器置于甲基對硫磷標準品溶液中反應，標準品溶液濃度依次為0ng/mL、0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、IOng/mL、50ng/mL、100ng/mL，選用工作電壓為0. 2V LOV，掃速為100mV/s，工作緩沖體系為NaH2PO4-Na2HPO4 (pH = 7. O)，每個濃度分別抑制16min ;取出電極后用超純水清洗電極表面以除去殘留的農藥，然后將電極置于裝有濃度為5mM氯化乙酰膽堿的反應池中反應2min，用公式A%= (I0-IP)/I0X100% (其中A%代表酶抑制率，Ic^P Ip表示未被農藥抑制與被農藥抑制后反應的峰電流值)計算出固定酶的抑制率，并據此與對應的甲基對硫磷標準品濃度建立標準曲線，線性范圍是A%= O. 061gC+0. 2458，R2 = O. 9898 :檢測限為5pg/mL。實施例2:將白菜葉片撕下展開，將農藥均勻噴灑在葉片上，然后切碎混勻。稱取10. OOg混勻的試樣，置于250mL具塞錐形瓶中，加入30g無水硫酸鈉脫水，劇烈振搖；再加入O. 25g活性炭進行脫色；之后加70mL 二氯甲烷，在振蕩器上振搖30min，用濾紙對混合物進行過濾。量取35mL濾液，室溫下在通風櫥中自然揮發至近干，用二氯甲烷少量研洗殘渣3次，移入5mL帶刻度離心管中，并定容至2. OmL備用。選用工作電壓為O. 2V 1.0V，掃速為IOOmV/S，工作緩沖體系為NaH2PO4-Na2HPO4 (pH = 7. O)，將制備的酶電極置于提取液中16min，取出電極后用超純水清洗電極表面以除去殘留的農藥，然后將電極置于裝有濃度為5mM氯化乙酰膽堿的反應池中反應2min，然后進行電化學測量。表I制備的酶傳感器對白菜樣品中有機磷農藥加標回收試驗
權利要求
1.基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的甲基對硫磷電化學生物傳感器，其特征在于對裸玻碳電極拋光處理，然后將制備的磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖復合物修飾在電極，接著將こ酰膽堿酯酶固定到復合膜上，制備出電化學酶傳感器，對甲基對硫磷標準品進行檢測，建立標準曲線，以達到對含甲基對硫磷樣品進行定量檢測的目的。
2.如權利要求I所述的基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的甲基對硫磷電化學生物傳感器的制備，其特征在于裸玻碳電極的拋光處理裸電極依次用粒徑為I μ m、0. 3 μ m、·0.05 μ m的氧化鋁粉末各打磨7min，每次換不同粒徑氧化鋁粉末前都用水將打磨布和電極上殘余的粉漿沖洗干凈，之后分別用超純水、無水こ醇、超純水分別超聲5min，然后用氮氣將電極吹干。
3.如權利要求I所述的基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的甲基對硫磷電化學生物傳感器的制備，其特征在于磺酸基功能化石墨烯的制備在冰浴的條件下，將2g的石墨片和I. 6g的硝酸鈉添加到67. 5mL98%的H2SO4中；然后在攪拌中加入9g KMn04 ;將混合物在35°C條件下攪拌35分鐘；之后在室溫下保持反應5天；再將560mL溫水緩緩加入燒瓶，并用30%的過氧化氫溶液處理，至懸浮液變成亮黃色；最后將懸浮液進行離心，用超純水清洗后再70°C下烘干。將得到的氧化石墨烯在超純水中超聲2h，將未分散的氧化石墨烯離心除去；再取IOmL均一分散的氧化石墨烯同5mL濃度為lmg/mL的聚苯こ烯磺酸鈉進行混合,攪拌30min ;接著將O. 4mL質量分數為85%的肼溶液添加進去，將此混合液在100°C下冷凝回流4h ;之后將混合物冷卻至室溫，離心后用超純水清洗三遍以去除過量的肼和聚苯こ烯磺酸鈉；將得到的濃度為lmg/mL磺酸基功能化的石墨烯在4C下保存。
4.如權利要求I所述的基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的甲基對硫磷電化學生物傳感器的制備，其特征在于裸玻碳電極的修飾將O. 25g殼聚糖溶于50mL2M醋酸溶液中得到·O.5%的殼聚糖溶液，用氫氧化鈉溶液調節pH至5. O。取100 μ L的殼聚糖溶液與200 μ L的石墨烯溶液混合，超聲20min得到均一混合液；用移液槍吸取5μ L的混合液并滴涂在電極表面，用紅外燈烘干；然后用移液槍吸取4μ L酶液滴涂在修飾膜上，將電極至于25°C培養箱中30min,得到固定了酶的電極。
5.基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的甲基對硫磷電化學生物傳感器，利用循環伏安法，優化各項工作條件工作電壓為O. 2 I. 0V，工作緩沖體系為NaH2PO4-Na2HPO4 (pH =·7.O);農藥抑制時間為16min，反應時間為2min，固定酶量為4 μし
全文摘要
基于磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖的電化學生物傳感器檢測甲基對硫磷的方法，屬于電化學傳感器技術領域，用于蔬菜、水果及其制品中甲基對硫磷殘留量的檢測。本發明的基礎是甲基對硫磷對乙酰膽堿酯酶的抑制作用，乙酰膽堿酯酶能夠催化氯化乙酰膽堿產生巰基乙酰膽堿的電化學反應。將磺酸基功能化石墨烯-殼聚糖修飾到裸玻碳電極表面，不僅可以有效的將乙酰膽堿酯酶固定在電極上，而且對電化學信號起放大的作用；甲基對硫磷殘留量與電化學峰電流相關，進而建立甲基對硫磷定量檢測的標準曲線。本發明旨在建立靈敏度高、可操作性強的甲基對硫磷定量檢測方法，并拓展新型材料石墨烯的應用。
文檔編號G01N27/26GK102706934SQ201210208988
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月25日 優先權日2012年6月25日
發明者何良興, 張偉龍, 王周平, 賈飛, 金旭忠, 魏云瀟 申請人:杭州市余杭區農產品監測中心, 江南大學