專利名稱：一種雙功能探針及其制備方法與在檢測g-四鏈體結構中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型雙功能探針及其制備方法，以及其在檢測G-四鏈體核酸二級結構的用途。
背景技術：
G-四鏈體(G-quadruplex)是一種特殊的DNA 二級結構。人類基因組中很多富鳥嘌呤區域具有形成這一結構的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復序列，以及多種基因的啟動子區域，如c-kit、c-myc、c_myb、bcl_2、PDGF> kRAS、VEGF> Rb和胰島素基因等。最新研究表明，很多非編碼區的RNA序列也可以形成G-四鏈體結構，RNA的G-四鏈體結構比DNA更穩定，該結構可能通過阻止基因的翻譯或參與蛋白結合識別的過程而達到抑制腫瘤生長的效果。G-四鏈體結構的形成對于體內的一系列生理過程都存在調控作用。研究證明，某些 啟動子區域的G-四鏈體結構會顯著影響基因的轉錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結構被認為是起到分子開關的功能，其形成和拆散可能涉及到信號傳導、細胞凋亡和細胞增殖等一系列體內重要的生理過程。所以，在體內或者體外試驗中，能夠特異性地檢測出G-四鏈體結構的存在或者形成，對于研究G-四鏈體結構的相關生物學功能以及開發以G-四鏈體結構為靶點的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。目前，在體內和體外檢測G-四鏈體結構的研究都取得了一些進展。由于體內大大過量的雙螺旋DNA的存在，以及復雜的細胞內環境，使得體內的檢測相對于體外檢測需要解決更多的難題，目前已有一些熒光分子可以實現體內G-四鏈體結構的檢測。而目前體外實驗中檢測G-四鏈體結構主要是通過儀器的手段，比如圓二色譜法、核磁共振、表面等離子共振、熒光共振能量轉移等方法，這些方法對儀器和技術操作的要求都較高，而且價格較昂貴，基本上不能普及使用。近年來，香豆素母體被廣泛應用于生物、醫藥、香料、化妝品及熒光染料等領域。其苯并吡喃結構具有Stokes位移大、熒光量子產率高、以及光穩定性好等優點，使香豆素類結構成為熒光傳感器分子設計中的優秀候選熒光團。而申請人實驗室前期的工作中合成了一系列的Isaindigotone類的化合物,其對G-四鏈體具有較好的選擇性和結合能力。申請人將香豆素結構融合到Isaindigotone結構當中，利用分子內電荷轉移的機理,得到了新型的G-四鏈體探針。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種雙功能探針。本發明的另一個目的在于提供上述探針的制備方法。本發明的再一個目的在于提供上述探針在檢測G-四鏈體結構的應用。本發明通過以下技術方案實現上述目的
本發明提供了一種雙功能探針，其結構式為
權利要求
1.一種雙功能探針，其特征在于結構式為
2.如權利要求I所述的雙功能探針，其特征在于A—為N原子甲基化反應后的陰離子。
3.—種如權利要求I或2所述的雙功能探針的制備方法，其特征在于包括以下步驟 先用4-二乙胺基水楊醛與丙二酸二乙酯反應，得到化合物
4.如權利要求I或2所述的雙功能探針在檢測G-四鏈體結構中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述應用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結構1)將待測DNA溶于PH值7.2-7. 4的緩沖液，得到溶液A ;將所述探針溶解，再用PH值7. 2-7. 4的緩沖液稀釋，得到溶液B ； 2)將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與探針的摩爾比為f3，混合后對混合液進行紫外可見光譜分析或熒光光譜分析，或者在日光或紫外燈下進行肉眼觀察，判斷待測DNA是否為G-四鏈體結構；判斷方法如下 (a)在日光下進行肉眼觀察時，與溶液B對比，若混合液在日光下的顏色由紅色變為藍紫色，則待測DNA為G-四鏈體結構； (b)在紫外燈下進行肉眼觀察時，與溶液B對比，若混合液在紫外燈下通過肉眼觀察到熒光增強，則待測DNA為G-四鏈體結構； (c)對混合液進行紫外可見吸收光譜分析時，與溶液B相比，若混合液紫外可見吸收光譜中最大吸收峰發生紅移，則待測DNA為G-四鏈體結構； Cd)對混合液進行熒光光譜分析時，與溶液B相比，若混合液的熒光發射強度增強，則待測DNA為G-四鏈體結構。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于判斷方法(c)中，與溶液B相比，若混合液紫外可見吸收光譜中最大吸收峰紅移50-70nm，則待測DNA為G-四鏈體結構。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于判斷方法(d)中，與溶液B相比，若混合液的熒光發射強度增強20倍或以上，則待測DNA為G-四鏈體結構。
8.如權利要求5-7中任一項所述的應用，其特征在于所述緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液。
9.如權利要求5-7中任一項所述的應用，其特征在于所述探針用二甲基亞砜溶解。
10.如權利要求5-7中任一項所述的應用，其特征在于溶液A和溶液B的混合反應時間為2分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種雙功能探針及其制備方法與在檢測G-四鏈體結構中的應用。該類探針制備簡單、易得，并且結構穩定，可用于特異性檢測G-四鏈體核酸二級結構，可以通過紫外可見吸收光譜，或者熒光分光光度計，或者直接通過肉眼觀察就可以快速檢測出溶液中的DNA樣品的二級結構。該類探針對G-四鏈體核酸二級結構的檢測方法具有操作簡便，選擇性好，快捷，肉眼可見的優點，克服了其他檢測方法價格昂貴，設備要求高，技術操作相對復雜等缺點。
文檔編號G01N21/31GK102719238SQ201210207279
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者古練權, 葉文杰, 譚嘉恒, 顏金武, 黃志紓 申請人:中山大學