專利名稱：血液25-羥基維生素d3腺癌檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，尤其是涉及一種血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
早在100多年前，維生素D作為維持骨骼健康的基本成分而被發(fā)現(xiàn)后便廣泛用于監(jiān)測佝僂病、軟骨癥等骨性疾病的發(fā)生。目前，研究者又發(fā)現(xiàn)維生素D還和其它多種慢性疾病相關(guān)，尤其是癌癥。I、維生素D來源與代謝維生素D(Vitamin D，VitD)是脂溶性類固醇衍生物，有五種形式，與健康關(guān)系較密切的是VitD2和VitD3。其中，前者來源于酵母細胞中的麥角固醇，后者則來源于動物皮下 7-脫氫膽固醇。通常只要我們每天接受充足的陽光，就可以獲得滿足人體90%的VitD3需求量， 而一些食物如牛奶、魚肝油等則會補給VitD2和VitD3，以滿足人體余下的10%需求。然而 VitD是沒有活性的，在人體內(nèi)與VitD結(jié)合蛋白或脂蛋白結(jié)合運送到肝臟，經(jīng)VitD-25-羥化酶(也稱為CYP27A1，CYP3A4, CYP2R1, CYP2J3)催化形成25_(0H)VitD。它是血漿中維生素 D的主要循環(huán)形式，常作為評估個體VitD營養(yǎng)狀況的檢測指標(最佳參考值為75-150nmol/ L，盡管許多實驗室采用的參考值為50-250nmol/L)。但25-(OH) VitD無生物活性，需在 25-(OH) VitD-I α -羥化酶作用下，代謝成具有生物活性的1，25_(0H) 2VitD來發(fā)揮效應(yīng)。 研究發(fā)現(xiàn)25-(0H)2VitD_l α -羥化酶不僅存在于腎中，也存在于前列腺、乳腺、直腸等多種細胞中，故VitD主要通過兩條途徑在體內(nèi)發(fā)揮作用一條是內(nèi)分泌途徑，通過血液中的l，25-(0H)2VitD調(diào)節(jié)全身性的鈣穩(wěn)定狀態(tài)；另一條是自分泌或旁分泌途徑，通過局部的1，25-(0H)2VitD和維生素D受體發(fā)揮作用，且不依賴全身性的鈣穩(wěn)定狀態(tài)，涉及細胞增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等。此外，l，25-(0H)2VitD的存在能誘導25-(0H)VitD-24-羥化酶 (CYP24)的表達，從而催化25-(OH) VitD和1，25-(OH) 2VitD形成水溶、無活性的膽骨化醇外排出去。2、維生素D在癌癥預防中的分子機制維生素D 受體(vitamin D receptor, VDR),作為 1，25-(OH) 2VitD 的受體,不僅存在于腎、甲狀旁腺中調(diào)節(jié)鈣磷平衡，在前列腺，直腸，乳腺，胰腺，免疫系統(tǒng)的各種細胞及其惡性細胞中也均表達。1，25- (OH) 2VitD與VDR結(jié)合后，促使VDR與RXR形成異二聚體，最終所形成的復合物作用于祀基因上的維生素D反應(yīng)元件(vitamin D - responsive elements, VDREs)，調(diào)節(jié)靶基因的表達。
目前，研究人員(Sreeram V. Ramagopalan, Andreas Heger, Antonio J. Berlangaj et al. A ChlP-seq defined genome-wide map of vitamin D receptor binding:Associations with disease and evolution. Genome Res，2010，20:1352-1360) 發(fā)現(xiàn)，維生素D可以直接或間接地影響229個基因的活性。這些基因已經(jīng)被證明與一系列疾病有關(guān)，其中最引人矚目的就是與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因表達調(diào)節(jié)。例如，抑制細胞由 G期向S期轉(zhuǎn)變的蛋白Rb，pl07和pl30等；抑制EGFR及其介導的細胞生長調(diào)節(jié)信號通路； 降低抗凋亡因子(Bcl-2，Bcl-XL)表達，增加促凋亡因子(Bax，Bak)的表達等來促進惡性細胞凋亡；調(diào)節(jié)VEGF和E-cadherin等表達，抑制血管生成，阻止惡性細胞轉(zhuǎn)移；并抑制與癌癥形成相關(guān)的炎癥反應(yīng)等，從而降低癌癥的罹病風險。3、維生素D與腺癌流行病學研究1980年代，Cedric Garland和Frank Garland兩兄弟通過比較美國不同地理上的直腸癌致死率和陽光照射量，首次提出紫外照射和VitD在降低癌癥風險中的角色。隨后， 更多流行病學研究開始聚焦于癌癥發(fā)生率/死亡率與VitD之間的關(guān)系。目前，VitD的這一重要作用在多種腺癌中已經(jīng)廣泛接受，其中尤屬乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌研究最多。一項預期和回復性流行病學研究表明25-(OH) VitD水平在50nmol/L以下時，乳腺癌，結(jié)腸癌，以及前列腺癌的患病風險增至30% 50%。Grant調(diào)查發(fā)現(xiàn)，歐洲乳腺癌中25% 死亡率是由于居住在高緯度地區(qū)缺失維 生素D造成的。而乳腺癌血清中25-(0H)VitD水平在130nmol/L時，與其含量在25nmol/L相比，以及結(jié)腸癌中25-(OH) VitD水平在85nmol/L 與15nmol/L相比時，兩種腺癌發(fā)生風險均降低50%。一項前瞻性研究表明，在1954個男性對象中維生素D攝入量與結(jié)腸癌風險呈直接關(guān)系(即當維生素D攝入量為6 94IU/天， 相對風險為I. O ;維生素D攝入量為233 652IU/天，相對風險為O. 53，P < O. 05)。一項八年的追蹤研究則發(fā)現(xiàn)婦女參與者血清中25-(OH) VitD的基本水平低于30nmol/L時其結(jié)腸癌發(fā)生風險升高25%[3]。William B. Grant [10]綜合多篇研究數(shù)據(jù)分析表明VitD與乳腺癌和結(jié)腸癌的劑量-反應(yīng)關(guān)系呈J形，25-(OH) VitD的最佳量似乎是lOOnmol/L以上，而其水平升至250nmol/L時，對于癌癥的作用可能發(fā)揮更大。另有研究對比室外工作與室內(nèi)工作的男性，發(fā)現(xiàn)前者患前列腺癌相對晚3 5年，因為室外男性的VitD水平要高于室內(nèi)工作男性。綜合表明25-(OH) VitD水品在lOOnmol/L以上時，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌發(fā)生風險會降低。因此，依據(jù)個體陽光照射，年齡，性別，體重以及VitD基本水平，建議每日補充 2000-4000IUVitD可以維持 25-(OH) VitD水品在 100nmol/L 以上(JoEllen Welsh. Cellular and molecular effects of vitamin D on carcinogenesis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2011, doi : 10. 1016/ j. abb. 2011. 10. 019)。VitD對于不同癌癥的發(fā)生率和致死率的效應(yīng)是不同的。近來一 篇綜述(E. R.Bertone-Johnson,Vitamin D and breast cancer, Ann. Epidemiol. 2009，19(2009)462-467)表明，有很多因素會引起VitD效應(yīng)的不同，其中包括年齡，女性絕經(jīng)狀況，腫瘤特征以及VDR基因多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)VDR基因上Fok I ff與FF 基因型相比，乳腺癌患病風險顯著的增加了 14% (Raimondi S，Johansson H, Maisonneuve P, Gandini S:Review and meta-analysis on vitamin D receptor polymorphisms and cancer risk. Carcinogenesis, 2009, 30:1170 - 1180)o 另有方差分析表明 BsmI Bb 與 bb 基因型相比，其前列腺癌患病風險顯著的降低了 17%。顯然，無論維生素D水平缺失或基因變異，l，25-(0H)2VitD對于細胞生長的正常調(diào)控都受到了抑制，促進了惡性細胞生長，從而提高了腺癌的發(fā)生風險。4、維生素D在腺癌中的臨床應(yīng)用4. I腺癌生物標記物
世界衛(wèi)生組織指出，如能早期診斷并及時治療，95%的腫瘤將可以治愈。這使得生物標記物的發(fā)現(xiàn)成為癌癥研究的主流。隨著新興的基因組學、蛋白組學技術(shù)的飛速發(fā)展，如 DNA和組織微矩陣、SELDI-T0F、質(zhì)譜、ELISA、RT-PCR、FISH等，許多有應(yīng)用前景的腺癌分子標志物被發(fā)現(xiàn)。依據(jù)其生物化學和免疫學特性大致分為以下幾種(I)基因類標志物微衛(wèi)星不穩(wěn)定，DNA超甲基化以及單核苷酸多態(tài)性等基因不穩(wěn)定性是致癌作用的一個基本因素，造成一些癌基因及其產(chǎn)物的異常表達，作為個體差異， 有助于作為癌癥風險評估，檢測及擬定治療方案的分子標記物。目前人們已發(fā)現(xiàn)近100 種與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的癌基因及其產(chǎn)物，部分已應(yīng)用于腫瘤標志物，涉及原癌基因(如 Her-2)和抑癌基因(如BRCAl, MTSl )，它們在多數(shù)癌癥中都呈現(xiàn)異常表達，是較佳的廣譜腫瘤分子標記物。另外，一些轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(如μι23)和凋亡相關(guān)基因(如Bcl-2)則與癌癥侵襲、凋亡相關(guān)，可作為預后指標。MLH1，MSH2或者MSH6這些基因錯配突變而引起的微衛(wèi)星不穩(wěn)定證明與直腸癌預后相關(guān)，但由于直腸癌標志物的低特異性以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，其使用并不廣泛。(2)酶類標記物酶及同工酶是最早出現(xiàn)和使用的腫瘤標志物之一，表現(xiàn)為在腫瘤發(fā)生過程中，與細胞分化或增生相關(guān)組織特異性酶或同工酶類量或(和)活性改變。例如前列腺特異性抗原PSA、人類腺體激肽釋放酶2(hk2)、基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs、溶酶體半胱氨酸蛋白酶Cath印SinB和L，絲氨酸蛋白酶類uPA和其抑制劑PAI-1，2等。(3)抗原類標記物主要分為腫瘤抗原(CEA、PCNA、Ki-67等)以及糖類抗原 (CA125、CA15-3 等)。(4)激素及其受體類標記物如降鈣素Calcitonin、雌激素受體ER以及孕酮受體 PR、胸腺素 thymosin β -15 等。(5)其它蛋白類如骨橋蛋白0ΡΝ，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌，前列腺癌以及肺癌病人的血液中呈高水平表達，可作為腺癌預后標志物。近來，F(xiàn)DA批準了一些新的基于尿液的生物標記物，其中包括核基質(zhì)蛋白ΝΜΡ22，作為膀胱癌的診斷標記。這些腫瘤標志物在腺癌發(fā)生風險評估、診斷、判斷預后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都發(fā)揮著較大的實用價值。4. 2VitD檢測在腺癌診斷中的應(yīng)用目前已經(jīng)命名的腫瘤標志物已有100多種，臨床應(yīng)用的標志物達到20左右，但因單項腫瘤標志物敏感度和特異度較低，無法準確診斷腫瘤和預測預后。國內(nèi)外研究表明，多腫瘤標志物聯(lián)合動態(tài)檢測是提高腫瘤診斷可行性策略。因此，我們旨在發(fā)現(xiàn)更多的生物標記物，希望使診斷結(jié)果更加可靠。綜上VitD與腺癌的流行病學概述以及與癌癥相關(guān)的分子機制研究來看，VitD與多種腺癌的發(fā)生發(fā)展有著不可切割的關(guān)系。而VitD作為個體物質(zhì)代謝所必需的小分子有機化合物，與基因和蛋白類等大分子類標記物相比在體內(nèi)代謝生成的無活性的25-(0H)VitD半衰期為2周，比較穩(wěn)定，相對而言更能實時的反映人體狀況，具有較好的指示性；研究人員發(fā)現(xiàn)將血液中的VitD代謝物儲存于24°C、 72h 仍保持完整(Bruce W Hollis. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr, 2008，88 (suppl) : 507S - 10S),故保證了樣品儲存時其穩(wěn)定性；檢測實驗中避免了基因或蛋白污染、降解等造成的結(jié)果偏差，具有可靠地預測性；同時也簡化了樣本處理步驟，易于檢測；且在多種腺癌中其水平都呈現(xiàn)明顯變化，有一定的敏感性；因此，若將VitD作為癌癥發(fā)生風險的預測因子之一將推動癌癥的診斷治療發(fā)展更邁進一步。VitD在體內(nèi)并不穩(wěn)定，會代謝成25- (OH) VitD和1，25- (OH) 2VitD。血清中25- (OH) VitD半衰期為2周，在人體內(nèi)水平穩(wěn)定，而1，25- (OH) 2VitD半衰期為15h，是VitD的活性形式，受多種因素調(diào)控，在許多靶組織中都會產(chǎn)生，即使VitD缺失，I, 25-(OH) 2VitD水平也常處于正常或增高狀態(tài)，所以用它來決定VitD是否缺失是沒有意義的，(Michael F. Holick. High Prevalence of Vitamin D Inadequacy and Implications for Health. Mayo Clin Proc, 2006, 81 (3) :353-373)故臨床上以血清中1，25-(OH) VitD含量作為個體VitD狀況的晴雨表。目前，檢測人體內(nèi)25_(0H)VitD方法主要有理化檢驗方法和免疫學方法。理化檢驗方法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)，高效液相色譜技術(shù)(HPLC)。這兩種方法都可分別檢測25-(0H) VitD2和25-(0H) VitD3含量，具有高重復性，通常將HPLC作為“黃金標準” 方法。但這些方法繁瑣費時，要求樣本相對大，需要專業(yè)培訓的技術(shù)人員準確操作，且LC-MS 無法區(qū)分25-(0H)VitD3和其非活性同分異構(gòu)體，而這個問題在新生兒含量檢測時尤其需要注意，因此并不適用于臨床實驗室。免疫學方法放射免疫測定(RIA)、競爭蛋白結(jié)合測定(CPBA)、放射受體測定(RRA)和酶聯(lián)免疫測定(EIA)，由于具有靈敏、快速、特異、簡便等優(yōu)點，在市場上應(yīng)用已成為一種必然的趨勢，如羅氏Elecsys25-羥基維生素D3，檢測使用了抗VitD3多克隆抗體，診斷成人體內(nèi)維生素VitD3是否充足，與其它臨床數(shù)據(jù)結(jié)合，作為輔助手段來判定骨代謝狀況。
然而目前的檢測方法都只應(yīng)用于臨床上評價個體骨質(zhì)疾病發(fā)生情況，故我們希望研究一個用以預測腺癌發(fā)生風險的25-(OH) VitD檢測方法。基于免疫學靈敏，快速，特異， 簡便等特點，本實驗室建立一種可定量檢測25-(0H)VitD3的免疫學方法。25-(0H)VitD3是一種脂溶性小分子化合物，結(jié)構(gòu)簡單，屬于半抗原，不具備免疫原性，需將其連接到大分子蛋白質(zhì)載體上，才能制備人工完全抗原。故本實驗室制備出25-輕基維生素D3-半琥拍酸酯-BSA抗原，已用其制備出多克隆抗體，目前正進行單克隆抗體的制備，期待未來能裝配成可供臨床應(yīng)用的25-(0H)VitD3檢測試劑盒，用以估測腺癌的發(fā)生風險性，使其成為檢測腺癌病人的第一道門檻。目前，越來越多的研究表明，25-羥基維生素D3可以作為腺癌的一項指標，但是， 目前，一套可行的將25-羥基維生素D檢測應(yīng)用到腺癌檢測的商品化產(chǎn)品仍然比較缺乏。大多數(shù)技術(shù)載體蛋白與25-羥基半琥珀酸酯偶聯(lián)的過程使用了水相，相比有機相來說，偶聯(lián)的效率不高，操作過程復雜，抗原的免疫效果較差。在維生素D的檢測方面也有商品化的產(chǎn)品，例如羅氏25-羥基維生素D3電化學發(fā)光免疫測定“ECLIA”，英國idas25_羥基維生素D檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，試劑盒用于維生素D缺乏狀況的評估，并且尚未進行關(guān)于腺癌方面的診斷性的研究的說明。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒及其制備方法。所述血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒包括不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清。所述25-羥基維生素 D3 濃度可米用 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L。包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板(抗體的酶標板記為AbPLAT):孔內(nèi)包被抗-25羥基維生素D3的抗體，所述酶標板可采用12X8條，包裝到帶干燥劑的錫箔袋中。標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3(標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素 D3 記為 VD3+HRP)。質(zhì)控品(質(zhì)控品記為CTRL):含25-羥基維生素D3和疊氮化鈉的人血清凍干品，所述疊氮化鈉的百分含量為O. 07% O. 09%。底物顯色液包括底物A (底物A記為SUBSA)和底物B (底物B記為SUBSB)，所述底物A為四甲基聯(lián)苯胺與醋酸鈉混合溶液，所述底物B為過氧化氫的水溶液。反應(yīng)終止液(反應(yīng)終止液記為STOP):采用O. 35 O. 5M的氫氯酸。
沖洗液(沖洗液記為WASHBUF):采用含有吐溫_20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫_20 的百分含量為O. 1%。所述血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟I)配制不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清,25-輕基維生素 D3 濃度分別為，Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L,330nmol/L。2)制備包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板，具體方法如下(I)用0. 05M pH9. O的碳酸鹽包被緩沖液將抗_25羥基維生素D3的抗體稀釋至含量為I 10 μ g / ml的混合液。(2)在每個96孔酶標板的反應(yīng)孔中加0. Iml抗-25羥基維生素D3的抗體混合液， 4°C過夜。(3)次日，棄去孔內(nèi)溶液，用含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖水溶洗3次，每次3min。3)制備標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，具體方法如下(I)稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于Iml蒸餾水中，再加入0. 2ml 0. IM高碘酸鈉水溶液，得混合溶液；(2)將混合溶液裝入透析袋中，對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，取出醛基化辣根過氧化酶溶液，再加入20 μ I 0. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩沖水溶液，調(diào)節(jié)pH值至
9.O 9. 5，然后加入IOmg 25-羥基維生素D3半琥珀酸酯在Iml 0. OlM碳酸鹽緩沖水溶液中；(3)加入0. Iml 4mg/ml硼氫化鈉水溶液，混勻，再置4°C 2h后裝入透析袋中， 對0. 15MpH7. 4磷酸鹽緩沖水溶液透析，4°C過夜后，加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih, 再3000rpm離心0. 5h，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨水溶液洗，最后沉淀物溶于2. 5ml
0.15M pH7. 4的磷酸鹽緩沖水溶液中；(4)將步驟(3)得到的溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩沖液(0. 15M，pH7. 4)透析， 去除銨離子后，10，OOOrpm離心30min去除沉淀，上清液即為標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，分裝后，冰凍保存；4)配制質(zhì)控品(質(zhì)控品記為CTRL):將25-羥基維生素D3溶解到人血清，冷凍干燥后，稱重。為便于長期儲存，按照0.07% 0.09%百分含量加入疊氮化鈉；
5)配制底物A:稱取TMB 17. 2mg(固體)，加DMSO Iml溶解，然后加入醋酸鈉緩沖液(O. 1M, pH5. 5) 66ml ；6)配制底物B :取一水合檸檬酸2. lg、無水磷酸氫二鈉2. 82g和O. 75%的過氧化氫尿素O. 64ml,用雙蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配制反應(yīng)終止液(反應(yīng)終止液記為STOP):取O. 5M的氫氯酸水溶液。8)配制沖洗液(沖洗液記為WASHBUF):取含有吐溫_20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫-20的百分含量為O. 1%。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明采用一系列的化學修飾，最終將25-羥基維生素D3修飾為25-羥基維生素 D3半琥珀酸脂。通過改良碳二亞胺法與蛋白載體BSA蛋白偶聯(lián)，最終由半抗原變?yōu)橥耆乖２⑶医Y(jié)合酶聯(lián)免疫吸附測定的方法開發(fā)出血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒。本發(fā)明的實際應(yīng)用是用于臨床上癌癥的檢測，并且癌癥的血液學檢測到目前為止仍然是個技術(shù)難題，商品化血液檢測產(chǎn)品的開發(fā)也是具有極其重要的意義。
圖I為血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒實施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。圖2為未偶聯(lián)25-羥基維生素D的BSA的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。圖3為25-羥基維生素D在有機相中偶聯(lián)BSA的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。圖4為25-羥基維生素D在水相中偶聯(lián)BSA的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。在圖2 4中，橫坐標為荷質(zhì)比m/z，縱坐標為強度Intensity。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。參見圖1，所述血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒實施例包括I、不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清，25-羥基維生素 D3 濃度分別為 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L，分別記為 CAL-I, CAL-2，CAL-3，CAL-4，CAL-5，CAL-6，CAL-7。2、包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板(抗體的酶標板記為AbPLAT):孔內(nèi)包被抗-25羥基維生素D3的抗體，酶標板12X8條，包裝到帶干燥劑的錫箔袋中。3、標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3(標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3記為VD3+HRP)。4、質(zhì)控品(質(zhì)控品記為CTRL,簡與為C):含25-輕基維生素D3和置氣化納的人血清凍干品，所述疊氮化鈉的百分含量為0. 07% 0. 09%。5、底物顯色液包括底物A (底物A記為SUBSA)和底物B (底物B記為SUBSB)，所述底物A為四甲基聯(lián)苯胺與醋酸鈉混合溶液，所述底物B為過氧化氫的水溶液。6、反應(yīng)終止液(反應(yīng)終止液記為STOP) 0. 35 0. 5M的氫氯酸。7、沖洗液(沖洗液記為WASHBUF):含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫-20的百分含量為0. 1%。所述不同濃度的校準品、包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板、標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3、質(zhì)控品、底物顯色液、反應(yīng)終止液和沖洗液設(shè)在盒體H內(nèi)。以下給出血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒的制備方法I)配制不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清,25-輕基維生素 D3 濃度分別為，Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L,330nmol/L。2)制備包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板，具體方法如下(I)用O. 05M pH9. O的碳酸鹽包被緩沖液將抗_25羥基維生素D3的抗體稀釋至含量為I 10 μ g / ml的混合液。(2)在每個96孔酶標板的反應(yīng)孔中加O. Iml抗-25羥基維生素D3的抗體混合液， 4°C過夜。(3)次日，棄去孔內(nèi)溶液，用含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖水溶洗3次，每次3min。 3)制備標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，具體方法如下(I)稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于Iml蒸餾水中，再加入O. 2ml O. IM高碘酸鈉水溶液，得混合溶液；(2)將混合溶液裝入透析袋中，對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，取出醛基化辣根過氧化酶溶液，再加入20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩沖水溶液，調(diào)節(jié)pH值至
9.O 9. 5，然后加入IOmg 25-羥基維生素D3半琥珀酸酯在Iml O. OlM碳酸鹽緩沖水溶液中；(3)加入O. Iml 4mg/ml硼氫化鈉水溶液，混勻，再置4°C 2h后裝入透析袋中， 對O. 15MpH7. 4磷酸鹽緩沖水溶液透析，4°C過夜后，加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih, 再3000rpm離心O. 5h，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨水溶液洗，最后沉淀物溶于2. 5ml
O.15M pH7. 4的磷酸鹽緩沖水溶液中；(4)將步驟(3)得到的溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩沖液(O. 15M，pH7. 4)透析， 去除銨離子后，10，OOOrpm離心30min去除沉淀，上清液即為標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，分裝后，冰凍保存；4)配制質(zhì)控品(質(zhì)控品記為CTRL):將25-羥基維生素D3溶解到人血清，冷凍干燥后，稱重。為便于長期儲存，按照O. 07% O. 09%百分含量加入疊氮化鈉；5)配制底物A :稱取TMB 17. 2mg(固體)，加DMSO Iml溶解，然后加入醋酸鈉緩沖液(O. 1M, ph5. 5) 66ml ；6)配制底物B :取一水合檸檬酸2. lg、無水磷酸氫二鈉2. 82g和O. 75%的過氧化氫尿素O. 64ml,用雙蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配制反應(yīng)終止液(反應(yīng)終止液記為STOP):取O. 5M的氫氯酸水溶液。8)配制沖洗液(沖洗液記為WASHBUF):取含有吐溫_20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫-20的百分含量為O. 1%。實施例I25-羥基維生素D3-3-半琥珀酸酯-BSA的合成本合成方法中，化學活化25-羥基維生素D3的3位，并與作為載體的BSA蛋白偶聯(lián)。這個合成經(jīng)過25-羥基維生素D3-半琥珀酸酯和25-羥基-維生素D3-3-半琥珀酰亞胺酯等中間步驟。25-羥基維生素D3結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特征在于包括不同濃度的校準品含25-羥基維生素D3的人血清；包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板孔內(nèi)包被抗-25羥基維生素D3的抗體；標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3 ；質(zhì)控品含25-羥基維生素D3和疊氮化鈉的人血清凍干品，所述疊氮化鈉的百分含量為 O. 07% O. 09% ；底物顯色液包括底物A和底物B，所述底物A為四甲基聯(lián)苯胺與醋酸鈉混合溶液，所述底物B為過氧化氫的水溶液；反應(yīng)終止液采用O. 35 O. 5M的氫氯酸； 沖洗液采用含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫-20的百分含量為O. 1%。
2.如權(quán)利要求I所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特征在于所述 25-輕基維生素 D3 濃度米用 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L。
3.如權(quán)利要求I所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特征在于所述酶標板采用12X8條，包裝到帶干燥劑的錫箔袋中。
4.如權(quán)利要求I所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)配制不同濃度的校準品含25-羥基維生素D3的人血清，25-羥基維生素D3濃度分別為，Onmol/L，6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L ；2)制備包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板，具體方法如下(1)用O.05M pH9. O的碳酸鹽包被緩沖液將抗-25羥基維生素D3的抗體稀釋至含量為 I 10 μ g / ml的混合液；(2)在每個96孔酶標板的反應(yīng)孔中加O.Iml抗-25羥基維生素D3的抗體混合液，4°C 過夜；(3)次日，棄去孔內(nèi)溶液，用含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖水溶洗3次，每次3min；3)制備標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，具體方法如下(1)稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于Iml蒸餾水中，再加入O.2ml O. IM高碘酸鈉水溶液，得混合溶液；(2)將混合溶液裝入透析袋中，對ImMpH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，取出醛基化辣根過氧化酶溶液，再加入20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩沖水溶液，調(diào)節(jié)pH值至9. O 9. 5，然后加入IOmg 25-羥基維生素D3半琥珀酸酯在Iml O. OlM碳酸鹽緩沖水溶液中；(3)加入O.Iml 4mg/ml硼氫化鈉水溶液，混勻，再置4°C 2h后裝入透析袋中，對O.15MpH7. 4磷酸鹽緩沖水溶液透析，4°C過夜后，加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih,再 3000rpm離心O. 5h，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨水溶液洗，最后沉淀物溶于2. 5mlO.15M pH7. 4的磷酸鹽緩沖水溶液中；(4)將步驟(3)得到的溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后， 10，OOOrpm離心30min去除沉淀，上清液即為標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，分裝后，冰凍保存；4)配制質(zhì)控品將25-羥基維生素D3溶解到人血清，冷凍干燥后，稱重。為便于長期儲存，按照O. 07% O. 09%百分含量加入疊氮化鈉；5)配制底物A:稱取TMB 17. 2mg，加DMSO Iml溶解，然后加入醋酸鈉緩沖液66ml ；6)配制底物B:取一水合檸 檬酸2. lg、無水磷酸氫二鈉2. 82g和O. 75%的過氧化氫尿素O. 64ml,用雙蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配制反應(yīng)終止液(反應(yīng)終止液記為STOP):取O.5M的氫氯酸水溶液；8)配制沖洗液取含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫-20的百分含量為O.1%。
全文摘要
血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒及其制備方法，涉及一種檢測試劑盒。試劑盒包括不同濃度的校準品、包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板、標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3、質(zhì)控品、底物顯色液、反應(yīng)終止液和沖洗液。采用一系列的化學修飾，最終將25-羥基維生素D3修飾為25-羥基維生素D3半琥珀酸脂。通過改良碳二亞胺法與蛋白載體BSA蛋白偶聯(lián)，最終由半抗原變?yōu)橥耆乖?。并且結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附測定的方法開發(fā)出血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒。可用于臨床上癌癥的檢測。
文檔編號G01N33/82GK102692514SQ20121020688
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者萬巍巍, 葉輝銘, 呂曉楠, 曾驥孟, 蔡良良, 鄭立謀 申請人:廈門大學